Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-12:2011. Tiêu chuẩn về Giống vi sinh vật thú y – Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, các chủng Pa.1, Pa.2. Mời các bạn tham khảo.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-12:2011 Xuất lần GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y – PHẦN 12: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN TỤ HUYẾT TRÙNG GÀ, CÁC CHỦNG PA.1, PA.2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 12: The procedure for preservation of Pasteurella multocida aviseptica, Pa.1, Pa.2 strains HÀ NỘI 2011 TCVN 8683-12:2001 Lời nói đầu TCVN 8683-12:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 268:1996 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-12:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-12:2001 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-12:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, chủng Pa.1, Pa.2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 12: The procedure for preservation of Pasteurella multocida aviseptica, Pa.1, Pa.2 strains CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho việc giữ giống vi khuẩn Tụ huyết trùng gà chủng Pa.1 Pa.2 dùng sản xuất kiểm nghiệm vắc xin tụ huyết trùng gà Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684:2011, Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y – Phép thử độ khiết Yêu cầu giống vi sinh vật 3.1 Nhận dạng TCVN 8683-12:2001 Serotype đặc hiệu giống xác định nhiều phương pháp huyết học sau với kháng huyết đặc hiệu: – Ngưng kết nhanh phiến kính (kháng nguyên vi khuẩn sống) – Ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên giáp mô) – Ngưng kết trực tiếp ống nghiệm (kháng nguyên xử lý axit) – Miễn dịch khuyếch tán (kháng nguyên chịu nhiệt kháng nguyên ổn định nhiệt) 3.1.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,8 kg đến 2,0 kg 3.1.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đơng khơ hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Kháng nguyên, kháng huyết chuẩn bị sau: a) Chuẩn bị kháng huyết thanh: Canh khuẩn ria thạch BAB có bổ sung % máu thỏ, ủ 37 0C 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch nước sinh lý 0,3 % formalin, thu hoạch huyễn dịch Pha loãng cho huyễn dịch đạt mật độ vi khuẩn vào khoảng ống Brown’s số Thỏ tiêm vào da kháng nguyên nói theo lịch sau: Mũi đầu tiêm liều ml/thỏ vào da kháng nguyên chết Sau mũi tuần thỏ tiêm tiếp với liều 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml cuối 2,0 ml kháng nguyên chết vào tĩnh mạch tai thỏ, mũi cách ngày đến ngày Một tuần sau mũi tiêm kháng nguyên chết cuối cùng, thỏ tiêm vào tĩnh mạch tai liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương ứng Từ ngày đến 10 ngày sau mũi tiêm kháng nguyên sống thỏ lấy máu chắt huyết kiểm tra hiệu giá kháng thể 10 ngày sau tiêm mũi cuối (hiệu giá phải lớn 1/512 lấy tồn máu) Nếu hiệu giá kháng thể khơng đạt tiêm tiếp ml kháng nguyên sống vào tĩnh mạch Một tuần sau lấy máu thỏ kiểm tra hiệu giá kháng thể, đạt lấy máu tồn (nếu khơng đạt thỏ loại bỏ) Huyết bảo quản – 20 0C, lượng nhỏ bảo quản nhiệt độ 0C Huyết bổ sung 1/10000 merthiolat b) Chuẩn bị kháng nguyên: – Chuẩn bị kháng nguyên cho phản ứng ngưng kết TCVN 8683-12:2001 Canh khuẩn ria thạch BAB có bổ sung % máu thỏ, ủ 37 0C 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch nước muối sinh lý 0,3 % formalin, thu hoạch huyễn dịch Sau ly tâm với gia tốc 000 g 15 0C (hoặc từ 200 g đến 500 g từ 30 đến 45 nhiệt độ phòng) Cặn vi khuẩn hoàn nguyên HCl N saline (0,85 % nước muối sinh lý dung dịch HCl N), cho mật độ vi khuẩn vào khoảng ống số (ống Brown’s) ủ qua đêm Huyễn dịch lại ly tâm lại loại bỏ phần nước trong, cặn vi khuẩn rửa lần nước sinh lý (PBS) pH: 5; 6; Cặn vi khuẩn cuối đạt mật độ khoảng ống số Brown’s hồn ngun PBS, pH Bất kì kháng nguyên tự ngưng kết phải loại bỏ – Chuẩn bị kháng nguyên cho phản ứng khuyếch tán thạch Từ canh trùng gốc cấy chuyển sang môi trường thạch, ủ 37 0C 18 h đến 24 h Thu hoạch khuẩn lạc PBS chứa 0,3 % formalin Đun huyễn dịch tế bào h nước sôi Loại bỏ cặn tế bào cách ly tâm Sử dụng nước làm kháng nguyên (kháng nguyên hòa tan) Hòa tan 0,9 % thạch Noble nước sinh lý 0,85 %, đun hòa tan thạch Đổ thạch đĩa dùng làm phản ứng Đục lỗ đĩa thạch để làm phản ứng với đường kính lỗ mm Nhỏ kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ nhỏ huyết cần kiểm tra vào lỗ đối diện Ủ 37 0C 24 h Kết xác định đường kết tủa kháng nguyên đặc hiệu với huyết cần kiểm tra 3.1.3 Cách tiến hành Phản ứng tiến hành đĩa 96 giếng đáy tròn Cho 50 µl nước sinh lý vào giếng bố trí A1 - D12 Tiếp tục cho 50 µl kháng nguyên vào A1, B1 pha loãng theo số 2, dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu Ủ 37 0C 24 h đọc kết Phản ứng âm tính kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước Phản ứng dương tính kháng nguyên ngưng kết hình mạng nhện đáy giếng, hiệu giá ngưng 3.2 Đặc tính ni cấy Mọc tốt mơi trường ni cấy vi khuẩn BHI có bổ sung % huyết ngựa, pH từ 7,2 đến 7,4, yếm khí tùy tiện Ủ 36 0C đến 37 0C 20 h đến 24 h môi trường đục vẩn mây, không váng, khơng cặn 3.3 Hình thái vi khuẩn TCVN 8683-12:2001 Vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn, kích thước từ (0,2 x 0,5) µm đến (0,5 x 1,0) µm, Gram âm, có giáp mơ, khơng nha bào, khơng di động, có hiên tượng bắt màu hai cực Trên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 16 h đến 18 h, khuẩn lạc có dạng S, dung quang Fo Trên thạch máu cừu, khuẩn lạc có dạng tương tự, khơng làm dung huyết 3.4 Kiểm tra tính độc 3.4.1 Chuẩn bị động vật – gà mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,0 kg đến 2,0 kg – chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đông khô hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn pha loãng đến nồng độ cần tiêm 3.4.3 Cách tiến hành Tiêm cho gà, liều ml pha loãng nồng độ 250 CFU/con theo đường da, gây chết gà Tiêm cho chuột nhắt trắng, liều 0,1 ml pha loãng nồng độ 10 –7 theo đường da gây chết chuột (MLD: 17 – 20) 3.5 Kiểm tra tính gây miễn dịch 3.5.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị gà mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,0 kg đến 2,0 kg 3.5.2 Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BHI bổ sung % đến 10 % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Tiến hành vô hoạt canh khuẩn formol từ 0,2 % đến 0,4 % giữ nhiệt độ phòng ngày đến ngày 3.5.3 Cách tiến hành TCVN 8683-12:2001 Tiêm cho gà, liều ml canh khuẩn vô hoạt theo đường da Gà sống 50 % so với gà đối chứng (không tiêm canh khuẩn vô hoạt) sau thử thách với MLD chủng vi khuẩn Tụ huyết trùng gà cường độc tương ứng Phương pháp truyền giống 4.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị 12 gà mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,0 kg đến 2,0 kg 4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống đông khơ hồn ngun nước thịt Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h 4.3 Cách tiến hành 4.3.1 Ria lên thạch BAB có bổ sung % huyết 4.3.2 Làm tiêu nhuộm Gram để kiểm tra hình thái 4.3.3 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc theo TCVN 8684:2011 4.3.4 Tiêm cho gà, liều ml canh khuẩn nguyên, theo đường da 4.3.5 Chọn mổ gà hấp hối sau chết khoảng 24 h đến 48 h sau tiêm Thu hoạch máu tim 4.3.6 Ria máu tim nên thạch BAB, ủ 37 0C 18 h đến 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường BAB lặp lại bước từ 4.3.1 đến 4.3.5, thay đổi liều tiêm 250 CFU/con 4.3.7 Ria máu tim lên thạch BAB, ủ 37 0C 18 h đến 20 h 4.3.8 Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch máu cừu, ủ 37 0C 24 h 4.3.9 Rửa mặt thạch huyết ngựa, thu huyễn dịch đông khô Kiểm tra giống sau đông khô 5.1 Tiêu chuẩn vật lý – Chế phẩm đóng thành bánh, xốp, màu đồng nhất, có chân khơng TCVN 8683-12:2001 – Độ ẩm: không lớn % – Độ hòa tan: lắc nhẹ nước sinh lý, chế phẩm tan trở lại dung dịch ban đầu vòng đến 5.2 Yêu cầu kỹ thuật Giống đông khô phải đạt yêu cầu Điều Bao gói, ghi nhãn bảo quản 6.1 Bao gói Giống sau đơng khơ bao gói giấy, để túi nhựa 6.2 Ghi nhãn - Nơi sản xuất - Tên giống - Số lô…ngày…tháng…năm… sản xuất - Người thực - Điều kiện bảo quản 6.3 Bảo quản Giống giữ nhiệt độ từ đến 0C năm TCVN 8683-12:2001 Thư mục tài liệu tham khảo OIE Manual 2008: Chapter 2.3.9: Fowl cholera 10 .. .TCVN 8683-12:2001 Lời nói đầu TCVN 8683-12:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 268:1996 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm... chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-12:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm... cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-12:2001 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-12:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn