luận văn tốt nghiệp, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường đến sự sinh trưởng và phát tricuaruar nấm men Sacharomyces cerevisiae

luận văn tốt nghiệp, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường đến sự sinh trưởng và phát tricuaruar nấm men Sacharomyces cerevisiae

Phần 1Đặt vấn đề1.1.Lí do chọn đề tài

Ngời ta đã biết làm rợu vang từ 3000 năm trớc công nguyên Đến thờiTrung cổ, nhu cầu về rợu vang 150 l/đầu ngời/năm[2] Hàng năm trên thế giớisản xuất khoảng 18 tỷ lít rợu vang Trong đó 1/3 của Pháp và Angiêri[14].

Đa số rợu vang (Wine, win ) trên thế giới đợc sản xuất từ nho, vì vậy từ“rợu vang” gần đây đồng nghĩa với “rợu nho” [2] Theo thời gian và kỹ thuậtsản xuất rợu vang ngày càng phong phú và hoàn thiện Mỗi nớc khác nhau cóphơng thức sản xuất khác nhau và hàng trăm loại rợu vang ra đời (độ rợu 9% -14% ): Chianti, chablis, rợu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne,Zinfandet,[2].

Thực chất của rợu vang bắt nguồn từ sự biến đổi tự nhiên của các loạihoa quả có đờng, do hệ enzim có trong một loại vi sinh vật là nấm men

Sacharomyces mà chủ yếu là loài: Sacharomyces cerevisiae, ngoài ra còn có

các phụ phẩm khác: các chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng,muối và các este Do đó, rợu vang không chỉ có đặc điểm nổi bật là gây sayêm dịu mà còn có giá trị dinh dỡng cao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, timmạch Việt Nam là một nớc nhiệt đới khí hậu nóng ẩm, hoa quả nhiều về sốlợng, phong phú về chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rợu vang từ các nguồnnguyên liệu khác nhau nh: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ trong đó phổ biếnnhất là vang vải vì vang vải đã đợc sản xuất ở một số nớc nh: Florida (Mỹ ),Trung Quốc [12, 17] Bên cạnh đó, quả vải giá thành thấp lại rất đa dạng,phong phú Tổng số diện tích trồng khoảng 28.000 ha, sản lợng cho thu hoạchkhoảng 36.000 tấn/ năm Nơi có diện tích trồng và thu hoạch nhiều nhất làLục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hng Yên ) [12, 17] Quả vải dùng chủyếu để ăn (chiếm khoảng 30% - 35% sản lợng quả cho thu hoạch, số còn lạibuộc phải sấy khô hoặc bán thẩm lậu qua biên giới Việt – Trung Việc chếbiến quả vải thiều ở dạng nớc giải khát đóng hộp cũng chỉ đáp ứng một phầnnhỏ sản lợng thu hoạch hàng năm và sản phẩm rất khó đợc thị trờng chấp nhận[12, 17].

Ngành sản xuất rợu vang ở Việt Nam thực sự phát triển từ những năm80 của thế kỷ XX đợc đánh dấu bằng sự xuất hiện của vang Thăng Long, sauđó là một số cơ sở sản xuất khác hiện lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba,vang Đà Lạt, nhng lại thiếu nguồn nguyên liệu Do đó theo chúng tôi, việc

nghiên cứu sử dụng quả vải thiều để sản xuất rợu vang là rất cần thiết và phùhợp với thực tiễn ở Việt Nam Chúng tôi tiến hành lựa chọn và nghiên cứu đềtài:

“Nghiên cứu ảnh hởng của hàm lợng đờng và NaCl trong qúa trình lên

men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )”.

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập và tuyển chọn chủng nấm men cókhả năng lên men vang vải thiều.

- Nghiên cứu ảnh hởng hàm lợng đờng, KH2PO4, NaCl, pH, men giống vànhiệt độ để lựa chọn mức thích hợp cuả các nhân tố này tới quá trình lên menvang vải thiều với quy mô phòng thí nghiệm.

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả vải thiều.

1.3 Nhiệm vụ

Giúp sinh viên biết phơng pháp sản xuất rợu vang ở Việt Nam tận dụngnguồn nguyên liệu sẵn có

1.4 ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý,

sinh hoá của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 có khả năng

lên men vang vải thiều Từ đó tìm hiểu quá trình sản xuất vang vải thiều trênquy mô phòng thí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang trong gia đình tận dụngnguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam.

Phần 2

Tổng quan tài liệu2.1 Khái quát chung về rợu vang

2.1.1 Các loại rợu vang

Rợu vang là loại nớc thơm ngon giàu chất bổ dỡng với độ cồn nhẹ và ơng thơm trái cây còn giữ lại đợc trong rợu [1] Rợu vang theo đúng nghĩa làrợu lên men từ nớc ép quả nho (không chng cất ) Gần đây, ngời ta mở rộngkhái niệm rợu vang để chỉ các loại rợu lên men từ các loại hoa quả khác nhaunh: mơ, dứa, táo, vải, xoài, nhãn Sự đa dạng về các loại rợu vang đang là kếtquả của sự biến đổi sinh hoá khi lên men Trong rợu vang ngời ta còn chiathành hai loại chính: Rợu vang không gaz và rợu vang có gaz Trong hai loạichính này rợu vang lại đợc chia thành nhiều loại theo màu sắc, theo hàm lợngđờng có trong rợu hoặc theo độ cồn.

Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux) Theo hàm lợngđờng có trong rợu vang thì có vang chát hay vang khô (ít đờng ) và vang ngọt(nhiều đờng ), vang nửa khô[13] Vang khô thờng uống giữa bữa ăn, vừa ăn,vừa uống Vang ngọt dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang Vermouth ) có mùirất thơm (chứa 21% độ rợu ) dùng để khai vị Champagne là loại rợu vang cóqúa trình lên men phụ sinh CO2, nên khi uống thờng có bọt và đợc dùng nhiềutrong đại tiệc, phụ nữ thờng a thích loại vang này[2].

2.1.2 Nguyên liệu sản xuất rợu vang

Việt Nam là một nớc nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho pháttriển, nhng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt bốn mùa Tất cả cácloại quả nếu chứa đờng, prôtêin, muối khoáng và không chứa chất độc hại vớinấm men đều có thể chế biến lên men rợu vang Nh vậy, nguồn nguyên liệusản xuất rợu vang chủ yếu là các loại quả trồng (mận, mơ, táo, dâu, dứa,chuối, vải, nhãn).

Nói chung thành phần hoá học của quả có ảnh hởng rất lớn đến chất ợng rợu vang Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhỡng, kỹ thuật canhtác cũng ảnh hởng lớn đến chất lợng rợu vang, bởi chúng ảnh hởng tới sự cómặt của các hợp chất hữu cơ có mặt trong quả.

l-Bảng 1 Thành phần hoá học của các loại quả [7, 16].

Nho ngọtDâu

0,560,495,16 0,01

2.1.3.Tàng trữ rợu vang

Vang truyền thống đợc tàng trữ từ 1ữ5 năm hoặc nhiều năm, hàng thếkỷ hoặc lâu hơn nữa Trong thời gian này xảy ra sự oxi hoá khử màu tím sangmàu đỏ tía Vang trắng trở nên vàng, thậm chí đỏ nâu Thành phần axít tăng,độ cồn giảm, este và hơng vị tăng lên [13], [14] Cho nên, công nghệ cổtruyền ngời ta cho rằng cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ởmức độ tối thiểu một số chỉ tiêu lý hoá Ngợc lại trong thực tế cơ chế thị trờngđã thúc đẩy nhà sản xuất phải xử lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các ph ơng phápcông nghệ học, ly tâm, nạp khí CO2, làm lạnh.

2.2 Nấm men trong sản xuất rợu vang

Nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rợu vang vì quá trìnhtrao đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thànhsản phẩm Nấm men sản xuất rợu vang gồm nấm men thuần chủng và nấmmen tự nhiên.

2.2.1 Sơ lợc về nấm men

Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, ờng sinh sản bằng nảy chồi Từ năm 1680 Levenhuc đã quan sát thấy Nấmmen, và từ 1857 Pasteur đã nghiên cứu khá tỉ mỉ về men rợu Nấm men phânbố rộng rãi trong tự nhiên (Trong đất, trong nớc, trong không khí, trong lơngthực, thực phẩm, trong hoa quả) Nhiều loài nấm men có khả năng lên men r -ợu do đó từ lâu con ngời đã biết sử dụng nấm men để nấu rợu, bia, sản xuấtcồn Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi, sinh sản nhanh chóng, sinh khối củanấm men giàu prôtêin – vitamin Vì vậy chúng còn đợc sử dụng rộng rãitrong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho ngời, gia súc và giacầm Nấm men còn đợc sử dụng làm nở bột mì, gây hơng cho nớc chấm, sảnxuất một số dợc phẩm khác Tuy nhiên bên cạnh đó có một số nấm men có hạicho ngời và gia súc, làm h hỏng lơng thực, thực phẩm [3].

th-2.2.2 Hình thái, kích thớc và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomycescerevisiae

Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng Hình dạng và kíchthớc điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo đợc trong điều kiện nhất định Nếuthay đổi thì hình dạng tế bào cũng thay đổi.

Kích thớc của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm Tế bàonấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp hơntế bào vi khuẩn Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men

Sacharomyces cerevisiae đợc bao bởi lớp thành tế bào.

Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lợngkhô (trong đó 31% manan, 29% glucan ) Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin,6% - 10% prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng Thành tế bào có cấu tạonhiều lớp là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào Thành tế bào nấmmen có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rợu vangvà bia Bên ngoài chất nguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyênsinh ) có chức năng quan trọng là hấp phụ các chất dinh dỡng và thải các cácsản phẩm trao đổi chất Màng chất nguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợpchất canxi Màng chất nguyên sinh ăn sâu vào trong tạo thành mạng lới nộichất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A0 và có ty thể Ty thể của nấm men códạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiện của môi trờng cũng nhtrạng thái sinh lý của tế bào, kích thớc khoảng 0,2 – 0,6 cm, ty thể có màngtrong suốt, mỏng (60 – 80 A0 ), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu tạo 2lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lợc Lớp ngoài đợccấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái Ty thể đợc cấu tạo chủ yếu bằng hợp chấtprôtêin, lipit trong đó chiếm một lợng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit Số lợngty thể trong tế bào nấm men từ 10 đến 20 Chúng tham gia vào quá trình sinhtrởng của tế bào, sự hình thành và nảy mầm của bào tử [1, 3, 9 ].

Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào đợchình thành từ thể glogi hay mạng lới nội chất, không bào có tính chất thẩmthấu cao và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất Không bào chứamột hệ thống keo, trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, cácmuối canxi, photpho, kali, axit nuclêic Hình dạng của không bào thờng thayđổi do sự co rút của chất nguyên sinh Trong không bào thờng xảy ra các phảnứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ thống enzim xitocromoxidaza trong không bào.Một dạng dự trữ của tế bào là glucogen trong môi trờng giàu hiđrat cacbon,glicogen của tế bào nấm men đợc tích luỹ khá nhiều.

Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hìnhtròn, hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thớc 1- 2,4 àm Nhân tếbào đợc bao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc nh màng cơ sở,

gồm 3 lớp phân tử, những lớp này đợc liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân.Lỗ màng nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào [6, 9].

2.2.3 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữutính,).

Bình thờng tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện khôngthuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử [1, 12 ].

Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất.Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồinhỏ gọi là mầm (hay chồi ) Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bàomẹ Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phíakhác nhau ở mỗi chồi sẽ nhận đợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh ởtế bào mẹ Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độclập, cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra mộtlớp tế bào nấm men giống hình cành cây Trong điều kiện thuận lợi một tế bàođợc hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ với thời gian 20- 30 phút.

Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử Bào tử túi đợc sinh ratrong những túi nhỏ gọi là túi nang Mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử (Th -ờng từ 4 bào tử ) Nấm men đợc tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không qua tiếphợp Bào tử túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men Tếbào này sinh sản theo lối nảy chồi (Lodder.J.1971 ).

Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử.Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bàotử Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy đợc sự khác nhau về thời gianhình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm mennảy chồi.

Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi Giữa quá trìnhnày có thể sinh sản hữu tính.

2.2.4 Nấm men thuần chủng

Trong thiên nhiên tồn tại một số lợng lớn các chủng nấm men khác nhau,chúng có những đặc tính đặc biệt và đợc sử dụng trong sản xuất Tế bào nấmmen có thể tìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây Tuy nhiêntrên bề mặt trái cây tồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc Đểtránh ảnh hởng cuả nấm dại, vi khuẩn, nấm mốc, mà ngày nay xu thế lênmen với chủng thuần khiết đang đợc phổ biến rộng rãi.

Nấm men thuần chủng là nấm men đợc phát triển từ cùng một tế bào đã ợc phân lập và tuyển chọn trên môi trờng Hansen.

Nấm men đợc phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài

Sacharomyces cerevisiae – loài này đôi khi đợc gọi là Sacharomycesellípsoideus hoặc Sacharomyces vini nhng những tên này đợc coi là lỗi thời,

nó đợc đặt tên bởi Hoyer (1837 ), đợc mô tả từ đầu bởi Schwann trong cùngmột năm.

* Một số chủng hay dùng trong sản xuất rợu vang:

Sacharomyces vini trớc đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini nấmmen này chiếm tới 80% Saccharomyces Trong khi lên men loại này có khả

năng lên men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin.

Saccharomyces oriformis đợc tách từ nớc nho lên men tự nhiên, đặc biệt

loại này chịu đợc đờng cao, tạo độ rợu cao (10% V) trong qúa trình lên men.Trong quá trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch quả, cókhả năng lên men glucoza, fructoza, mantoza.

Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rợu vang, trớcđây gọi là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 – 20% V cồn.

* Khả năng lên men đờng của Saccharomyces

Sự lên men rợu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môitrờng còn chứa nhiều hàm lợng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đ-ờng đến CO2 và H2O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ Năng lợng của sựlên men không đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ này.Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đờng còn lại ít trong môi trờngnấm men sẽ sử dụng các glicogen đã đợc tích luỹ trong đó, do đó hàm lợngglicogen trong tế bào giảm dần.

Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rợu bia là khác

nhau đối với mỗi loại đờng Tốc độ lên men đờng glucoza và fructoza nhanhhơn xaccaroza Tốc độ lên men đợc xác định lợng CO2 bay ra từ một thể tíchmôi trờng nhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự, 1976 ).

* Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuầnchủng cho sản xuất rợu vang [7] Nhng chỉ từ khi có những hãng rợu sản xuấtđợc vang ngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới đợc quan tâm, pháttriển.

Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomycescerevisiae Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n Thành phần hoá học của

nấm men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trờng nuôicấy Trung bình nấm men chứa 75% nớc, 25% chất khô.

Theo quan điểm kinh tế, ngời ta chia nấm men ra thành các chủng nhsau:

+ Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối u sản xuất thì đạt20,5% V cồn.

+ Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 – 12% V cồn, thậmchí ở nhiệt độ thấp 4 – 100 c không bị kìm hãm.

+ Chủng chịu đợc nông độ đờng cao, lên men đợc rợu vang gần 30% ờng với hàm lợng cồn 10 -13% V.

đ-2.3 Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rợu vang, khả

năng lên men đờng của Saccharomyces cerevisiae

Quá trình sản xuất rợu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm mensinh sản trong môi trờng dịch quả Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh tr-ởng của nấm men Sau đó tạo điều kiện lên men rợu etylic yếm khí nhanhchóng, chiếm toàn bộ khoảng không cho quá trình lên men tạo thành CO2 vàrợu etylic xảy ra mạnh mẽ, sự lên men rợu etylic đợc biểu diễn theo phơngtrình sau: [1, 12]

ohOch2O pO

Glucoza 6 - bị tác dụng của enzim iromeza chuyển thành fructoza 6 -  có cấu

tạo kém bền vững hơn

o ch2oop

* Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch.

Fructo 1,6 đi  dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt vàđioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza.

na d++ h3p o4

ch2o oopp+

nadh2

Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP Phản ứngnày có ý nghĩa hơn vì năng lợng giải phóng cho quá trình oxy hoá đợc tíchluỹ trong các phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lợng cho quá trình hoạtđộng của tế bào trong điều kiện không có oxy Phản ứng do enzim photpho –glyxeratkitonaza xúc tác tạo axit 3 – photphoglyxeric.

* Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic

Dới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3 –photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 – photphoglyxeric.

A.3.P G

C ooopp

A.2.P E.Ph2o

* Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rợu.

Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetalđehytnhờ enzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza Sau đó axetalđehyt bị khửthành etanol nhờ enzim alcođehiđrogenaz.

Phơng trình tổng quát quá trình lên men:

C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O

Nh vậy sự lên men chuyển đờng thành rợu là một dãy các quá trình oxyhoá khử có enzim trong tế bào nấm men tham gia.

2.4 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rợu vang, bệnh vang

2.4.1 Nấm men2.4.2 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rợu vang, thùng chứa

thiết bị hoặc do bụi, không khí đa đến nh nấm mốc thuộc chi Rhizopus,Aspergillus.

2.4.3 Vi khuẩn

Trong nớc hoa quả và nớc rợu vang có thể phát triển những dạng vikhuẩn có tính ổn định lớn với rợu và axit hữu cơ Chúng có thể gây ra nhữngbiến đổi sâu sắc trong rợu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm

đục cho vang, đó thờng là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacteraceti Pasteur đã khám phá cơ chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi r-

ợu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus Do vậy, để bảo quảnrợu vang ngời ta có thể thanh trùng pasteur nhng nó làm giảm chất lợng rợuvang, phơng pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến nh SO2 ( 75– 120 mg/l ).

2.5 Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình sinh trởng của nấm men

2.5.1 Nguồn cacbon

Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứngenzim axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất Vì vậy các hợp chất cacbon cóvị trí quan trọng hàng đầu cho sự sinh trởng nấm men Nguồn thức ăn chủ yếucủa nấm men là hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là:

- Sản sinh năng lợng

- Tạo thành những tiền chất

- Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thànhsản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trờng.

2.5.2 Nguồn nitơ và muối khoáng

- Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng nh tất cả nhữngcơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào Do đó môi trờng nuôi cấycần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá.

- Các nguyên tố của photpho, lu huỳnh đóng vai trò quan trọng trongquá trình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phầncủa nhân, hạt nhiễm sắc thể, enzim.

Các ion: Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men.

Các ion: Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh họccũng ảnh hởng tới sinh trởng và phát triển của nấm men [16].

2.5.3 Nguồn Oxi

Đối với nấm men dùng để lên men, oxi cần trong giai đoạn đầu giúpnấm men sinh trởng, tăng sinh khối Quá trình lên men rợu diễn ra ở điều kiệnyếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn Sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men, rútngắn thời gian lên men có lợi về mặt kinh tế nhng không có lợi về công nghệdo tạo sản phẩm bậc hai quá lớn.

2.6 Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình lên men

2.6.1 pH môi trờng

Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trờng bị biến đổi khiến cho sự sinhsản của nấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môitrờng lúc này bắt đầu khan hiếm chất dinh dỡng và hoạt lực enzim trong tếbào lớn Vì vậy nấm men tự phân huỷ và giải phóng NH3 Khi pH dới 2 – 3thì quá trình lên men bị yếu đi Nếu pH trên 6,5 – 7,5 khả năng lên men vangphát triển tốt: 4,0 – 5,0.

2.6.2 ảnh hởng của nhiệt độ

Quá trình lên men thờng sinh ra nhiệt và lợng nhiệt này có ảnh hởng lớnđến chất lợng rợu.

Nhiệt độ ảnh hởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do cácphản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ.Nhiệt độ giới hạn của men rợu vang là không quá 300 c ở 35 0c đợc coi lànhiệt độ nguy hiểm, tuy nhiên đây không đợc coi là quy luật chung tuyệt đốivề nhiệt độ Nhiệt độ 35 0c nấm men mất tác dụng , quá trình lên men bị dừnglại nhng không bị chết nấm men Trong quá trình lên men rợu vang, việckhống chế nhiệt độ dới 30 0c là điều rất quan trọng Nếu vợt quá đến nhiệt độtới hạn (350 c ), quá trình lên men rợu bị ngừng lại ảnh hởng đến việc chuyểnhoá đờng thành cồn và CO2 Đồng thời lợng đờng sót lại cha đợc lên men làmôi trờng cho các vi khuẩn sinh khí hoạt động, đặc biệt vi khuẩn chuyển hoáđờng thành axit lắc tíc hoặc axit axetic, đó là hiện tợng hoá chua axit, làmgiảm chất lợng rợu vang.

Ngợc lại ở nhiệt độ thấp (<20 0c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp,các cấu tử có lợi cho rợu vang đợc hình thành quá ít Quá trình lên men bắtđầu tốt ở nhiệt độ 200 c, ở 25 0c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn17 - 18 0c xảy ra sau 24 h Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp100c Nh vậy nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28 0c.

2.6.3 ảnh hởng của nồng độ cồn

Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rợu vang phát triển tốt:9 – 140 Hàm lợng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm,thậm chí làm dừng lại quá trình lên men ảnh hởng của cùng một hàm lợngcồn ở 300 c và 200c là hoàn toàn khác nhau ở 300 c cồn gây ảnh hởng xấu hơnở 20 0c Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lợng rợu vang.Nhiều thí nghiệm chỉ ra rằng, chính hàm lợng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đãcản trở sự lên men chứ không phải sự thiếu vắng các chất sinh trởng hoặc sựtạo thành các chất kháng khuẩn.

Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rợu vang, cải thiện chất lợngvang, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồngđộ cao Việc sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạycảm với nhiệt độ cao.

2.6.4 ảnh hởng của nồng độ đờng và áp suất thẩm thấu

Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đờng cũng là một yếu tốquan trọng, ảnh hởng đến quá trình lên men Nồng độ đờng cao, ức chế quátrình lên men Nồng độ đờng thích hợp khoảng 200 – 280 g/l Nếu cao hơnnữa tốc độ lên men giảm đi.

Đờng và các chất hoà tan khác trong môi trờng tạo áp suất, áp suấtthẩm thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trờng nuôi cấy Sự chênh

lệch này làm cho các chất dinh dỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trờng tế bàoqua màng và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trờng áp suất thẩm thấuquá cao gây hiện tợng khô sinh lý teo chất nguyên sinh Nồng độ quá cao tếbào nấm men không sinh trởng đợc Nồng độ đờng quá thấp tế bào sẽ ngừngphát triển.

Phần 3

Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu3.1 Đối tợng nghiên cứu

Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) đợc thu nhận từ hai trung tâm trồng

và thu hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) vàThanh Hà (Hng Yên ).

Các chủng nấm men nghiên cứu đợc phân lập từ dịch cùi quả vải thiều cóvị trí phân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây:

- Cồn.

3.3 Dụng cụ thiết bị

- Nồi hấp áp lực.- Cồn kế.

- Kính hiển vi quang học.- Buồng đếm Goriaev.

- Cân kỹ thuật và cân phân tích.- Tủ sấy.

- Buồng vô trùng.- ống nghiệm.

- Máy đo pH và giấy đo pH.- Hộp pêtri.

- Bình cầu, bình tam giác.

- Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh.- Que cấy, đèn cồn.

3.4 Môi trờng

Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi

chọn môi trờng vô cơ theo tỷ lệ sau:

3.4.1 Môi trờng Hansen (MT1 ) g/l: Môi trờng phân lập và sơ tuyển chủngnấm men

- Đờng glucoza : 50 g.- Pepton : 5,0 g.- MgSO4 7 H2O : 0,5 g.- KH2PO4 : 1,0 g.- (NH4)2SO4 : 1,0 g.- Thạch agar : 20 g.- Nớc cất : 1000 ml.

3.4.2 Môi trờng nhân giống (MT2 ): g/l.

- Đờng glucoza : 50 g.- Pepton : 5,0 g.- MgSO4 7 H2O : 0,5 g.- KH2PO4 : 1,0 g.- (NH4)2SO4 : 1,0 g.- Nớc cất : 1000 ml.

3.4.3 Môi trờng lên men (MT3 ) : g/l.

- Dịch siro hoa quả :200- MgSO4 7 H2O : 1,0 g.- KH2PO4 : 1,0 g.- (NH4)2SO4 : 1,0 g.- Nớc cất : 1000 ml.

3.5 Phơng pháp nghiên cứu:

Trong đề tài này tôi sử dụng phơng pháp nghiên cứu sau:1 Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men.

2 Xác định hoạt lực lên men bằng:+ Cân bình trọng lợng.

+Xác định số lợng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoágiống.

3 Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế.4 Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.

5 Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóngđại 1000 lần.

6 Các phơng pháp phân tích:

+ Xác định hàm lợng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH0,1 N.

+ Xác định độ cồn bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150c, bằngphơng pháp hoá học.

Các tiến hành: Môi trờng phân lập đợc khử trùng và phân vào các hộppêtri vô trùng để nguội theo phơng pháp Pasteur.

Dịch hoa quả đã đợc pha loãng 10-1- 10-10 bằng nớc cất Nhờ một haigiọt huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang.Gói kín và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 – 280c trong 4 ngày trên bề mặtxuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trng cho nấm men(mép răng ca và nhẵn bóng ).

3.5.2 Phơng pháp hoạt hoá giống

Trớc khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thìtôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trờng thạch nghiêng 24– 280c trong vòng 24 h trên máy lắc Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống đ-ợc pha ở nồng độ đờng 10% trong vòng 24 h đợc giống cấp hai.

3.5.3 Phơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Để biết đợc hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiếnhành dùng các phơng pháp sau:

* Phơng pháp cân bình trọng lợng:

Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trờng, có cùngmột lợng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24 h lên men đem cântrọng lợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại.

* Phơng pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev:

Cấy giống vào môi trờng nhân giống ở 280c, lắc đều canh trờng dùngpipet chia độ pha loãng canh trờng Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển màđộ pha loãng theo tỷ lệ khác nhau Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào mộtkhe hở giữa hai tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên đểyên 3 – 5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm sốtế bào trong 5 ô lớn chéo nhau.

Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A 50 B.

Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.

A: Số lợng tế bào trung bình trong 1 ô vuông B : Hệ số pha loãng.

3.5.4 Phơng pháp phân tích

+ Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế.+ Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.

+ Xác định hàm lợng axit trong dịch lên men bằng cách:

Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ sốml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lợng axit trong dịch lên men.Phản ứng trung hoà: OH- + H+ H2O

3.5.5 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi

Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độphóng đại 1000 lần.

Xi nếu n < 30

 = 

Xi : Giá trị đo lần thứ i.

- Lên men tốt trong môi trờng có hàm lợng đờng cao.- Chịu độ cồn và độ axit cao.

- Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.- Hơng thơm có tạo các este đặc biệt.

4.1.3 Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men H7 và C13

Dựa vào khoá phân loại của Loder năm 1971 (Khoá phân loại mới đợcnhiều ngời sử dụng ), theo khóa phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiêncứu đều có đặc tính [10]:

- Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía.- Không đồng hoá nitrat.

- Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu.- Lên men Glucôza mạnh.

- Lên men đợc saccaroza, galactoza, mantoza.

- Điều kiện không thuận lợi hình thành 1  4 bào tử.- Mỗi nang chứa 2  4 bào tử.

Từ đó tạm thời đặt tên cho 2 mẫu nấm men là Sacharomyces cerevisiae

H7 và C13.

4.2 Xác định hoạt lực lên men

Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đợc đánh giá bằng hàm ợng CO2 sinh ra Lợng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trờng thìtrọng lợng bình lên men càng giảm Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càngmạnh Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai chủng H7 và C13 với số lần nhắclại là 8 lần, thu đợc kết quả lợng CO2 thoát ra trong 72 h từ khi lên men ở bảngsố 2.

l-Bảng 2.Hàm lợng khí CO2 giải phóng sau 72 h lên men của hai chủng nấmmen Sacharomyces cerevisiae H7 và C13.

4.2.2 Động thái phát triển của hai chủng nấm men Sacharomycescerevisiae H7 và C13

Trong qúa trình sản xuất rợu vang giai đoạn nhân giống chiếm một thờigian ngắn khoảng 24 – 28 h, nhng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọngtrong quá trình tăng nhanh số lợng của tế bào nấm men Việc nghiên cứu cácnhân tố ảnh hởng tới sự sinh trởng và phát triển 2 chủng H7 và C13 là một phầntrong quá trình sản xuất rợu.

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng số 2 (môi trờng nhân giống) ở điều kiện môi trờng 280c, số tế bào ban đầu 3,5 106 tế bào, cứ sau 12 hkiểm tra 1 lần Mục đích là xác định động thái phát triển của 2 chủng nấmmen H7 và C13 Kết quả thí nghiệm đợc diễn ra ở bảng 3 và đồ thị 2.

Bảng 3 Động thái phát triển của 2 chủng nấm men S cerevisiae H7 và C13