Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ

TÓM TẮT . iv MỤC LỤC . .v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii DANH MỤC CÁC HÌNH .xi DANH MỤC CÁC BẢNG xii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .xiv

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌCNiên khóa : 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận

Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp con hoàn thành khoá luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim, Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp

Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

iv

TÓM TẮT

PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

“NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP VT2eB TRÊN THỎ”

MBP-Hội đồng hướng dẫn:

TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang

Độc tố verotoxin VT2eB do E coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu

và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được

chủng E coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được

protein này Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng

dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E coli gây ra trên heo

Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố verotoxin

Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu:

- Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả

- Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero

- Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo)

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .xiv

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu 6

2.3.2 Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo 6

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch 7

2.4 Cơ chế miễn dịch dịch thể 10

2.5 Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 15

2.6 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 15

2.6.1 Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể 15

2.6.2 Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 17

vi

2.7 Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 18

2.7.1 Sơ lược về tế bào vero 18

2.7.2 Độc tố VT2e 19

2.7.3 Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero 20

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21

3.1 Thời gian và địa điểm 21

3.2 Nội dung nghiên cứu .21

vii

3.6 Chỉ tiêu theo dõi 33

3.7 Đánh giá kết quả và xử lý số liệu 33

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ thuật Ouchterlony 34

4.3 Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 42

4.3.1 Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero 42

4.3.1.1 Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero .43

4.3.1.2 Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt 43

4.3.1.3 Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 44

4.3.1.4 Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt 44

4.3.2 Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero .46

4.3.2.1 Quy trình dài ngày .47

4.3.2.2 Quy trình ngắn ngày .50

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 56

viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ag ATCC

DAG DMEM

EDTA

FBS Gb4 Ig IL2 IL4 IL5 IL6 IP3

LB MAF

Tissue culture infectious dose 50

Ethyllene diamine tetra acetic acid

Fetal Bovine Serum Globotetraosyl ceramide Immunoglobulin

Interleukin 2 Interleukin 4 Interleukin 5 Interleukin 6

Inositol triphosphate Lubria – Bertani Macrophage activating factor

Maltose binding protein Major histocompatibility complex class II antigens Macrophage inhibitation factor

Manufacturer's working cells bank

Polymerase chain reaction

Kháng nguyên

Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ

Huyết thanh bào thai bê

Globulin miễn dịch

Yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào

Các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II

Ngân hàng tế bào đang làm việc

ix

PBS SLT TC

Vero VT

VT2e (SLT-IIv) VT2eB

Phosphate buffer stalin Shiga-like toxin

Cytotoxic T cell Delayed type

hypersensitivity T cell Inducer T cell

Tế bào lympho T cảm ứng Tế bào lympho T giúp

Độc tố Shiga-like toxin IIv Tiểu đơn vị B của VT2e

x

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Hình 2.2:

Hình 2.3: Hình 2.4:

Hình 2.5: Hình 2.6:

Hình 2.7:

Hình 2.8:

Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 4.1:

Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc

Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ 61

Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ 62

Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S 62

Bảng 4.5: Bảng 4.6: Bảng 4.7:

Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây

miễn dịch 39

Kết quả đo OD620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e 41

Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) 45

Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 47

Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) 48

Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 2 50

Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch 52

xiii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

TRANG Sơ đồ 3.1: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ 3.3: Sơ đồ 3.4: Quy trình tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S 25

Quy trình xác định liều TCID50 29

Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm 30

Quy trình trung hòa độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 32

xiv

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1: Biểu đồ 4.2:

Biểu đồ 4.3:

Biểu đồ 4.4:

Biểu đồ 4.5:

Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e 42 Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero 46 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero 51

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 MỞ ĐẦU

Độc tố verotoxin VT2eB do E coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và

tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta Vì vậy, các nghiên cứu giúp phòng bệnh, phát hiện, giám sát các tác nhân gây bệnh là vấn đề đang nhận được sự quan tâm hàng đầu

Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh tiêu chảy và phù đầu ở heo con tuy có hiệu quả nhưng gây nhiều triệu chứng phụ, như rối loạn tiêu hoá, không có chức năng phòng bệnh và tạo ra những chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (gây khó khăn cho việc trị bệnh lâu dài) Để khắc phục những khó khăn trên, phương pháp dùng vaccin để phòng ngừa bệnh cho heo hứa hẹn mang lại hiệu quả hơn Tuy nhiên, hầu hết các loại vaccin hiện nay được sản xuất theo phương pháp cổ điển bằng cách sử dụng vi khuẩn chết hay vi khuẩn nhược độc nên tính đặc hiệu không cao và gây một số phản ứng phụ có hại Phương pháp này gặp một số bất lợi như hiện tượng phục hồi một số tính độc ban đầu hay sự phân huỷ không hoàn toàn các độc tố, dễ dẫn đến các hiệu ứng không mong muốn ở các con thú được tiêm chủng Hơn nữa, việc sử dụng vi khuẩn chết lại đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễn dịch không cao

Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra

được chủng E coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch

được protein này Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với sự hướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê

Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ”

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu

Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù

do E coli gây ra trên heo

1.2.2 Yêu cầu

Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB

Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Thử khả năng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero

Tính phản ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào một phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên được gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) hay epitop Các epitop có hai đặc tính: tính kháng nguyên (antigenicity) và tính sinh miễn dịch (immunogenicity)

Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ thể được gọi là paratop

Tính miễn dịch của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể

Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể của nó hoặc giữa kháng nguyên với các thụ thể của tế bào có thẩm quyền miễn dịch mang tính đặc hiệu rất cao Điều đó có nghĩa là một kháng nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một kháng thể anti-A hoặc chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên A

2.2 KHÁNG THỂ[1]

Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Immunoglobulin, Ig), ở động vật hữu nhũ có 5 lớp Ig: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, các Ig đều là protein hình cầu Mỗi phân tử Ig đều có hai cặp chuỗi polypeptide nặng ký hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ ký hiệu là L (light chain) Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở chuỗi nặng Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hoàn toàn từng đôi một

2.2.1 Chuỗi nhẹ (L)

Chuỗi nhẹ có trọng lượng khoảng 22.000, có thể phân biệt hai type chuỗi nhẹ khác nhau, đó là type kappa (κ) và type lambda (λ) Hai chuỗi này có tính kháng nguyên khác nhau hoàn toàn

Mỗi chuỗi nhẹ có 214 acid amin Thứ tự các acid amin từ 108 – 214 là hoàn toàn không thay đổi Còn các acid amin từ số 1 – 107 có thể thay đổi về thứ tự Đoạn này được gọi là vùng thay đổi VL (variable light), trong vùng thay đổi có đoạn thay đổi mạnh nhất gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions) Những đoạn siêu biến trong chuỗi lambda là các đoạn từ vị trí acid amin 24 – 34, 50 – 56 và 89 – 97

2.2.2 Chuỗi nặng (H)

Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, gồm 446 acid amin được chia làm hai phần: vùng thay đổi VH (variable heavy) và vùng hằng định CH (constant heavy)

Người ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch polypeptide trong chuỗi nặng Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi:

- Gamma (γ) thì Ig đó được gọi là IgG - Muy (µ) thì Ig đó được gọi là IgM - Alpha (α) thì Ig đó được gọi là IgA - Delta (δ) thì Ig đó được gọi là IgD - Epsilon (ε) thì Ig đó được gọi là IgE

Vùng thay đổi (VH): cũng giống như vùng thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng này có 116 acid amin Những vùng thay đổi mạnh nhất được gọi là vùng siêu biến chuỗi nặng Vùng hằng định (CH): ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn có một nhóm glucide gọi là oligosaccharide được ký hiệu là CHO CHO được gắn vào phần CH2 của phân tử kháng thể, đây là phần glucide của phân tử kháng thể có nhiệm vụ cố định bổ thể, giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết định tính kháng nguyên của phân tử kháng thể

Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến chuỗi nặng và siêu biến chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành tính đặc hiệu trong sự kết hợp của kháng nguyên với kháng thể

2.3 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH[1]

Khi vào cơ thể, kháng nguyên được đại thực bào bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa lên bề mặt tế bào các nhóm quyết định kháng nguyên, sau đó trình diện những thông tin của các nhóm quyết định kháng nguyên này cho các loại tế bào lympho T để khởi động đáp ứng miễn dịch, phát triển tạo tính miễn dịch cho cơ thể

Trong số các tế bào lympho T đến nhận diện các quyết định kháng nguyên thì tế bào lympho T cảm ứng (inducer T cell, TI) đóng vai trò quan trọng đặc biệt Khi nhận diện được các quyết định kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho TI bị kích thích và tiết ra các yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào MAF (macrophage activating factor), đến lượt đại thực bào được hoạt hoá và tiết ra interleukin 1 Interleukin 1 sẽ tác động trở lại lympho TI Lúc này, lympho TI có đủ hai tín hiệu kích thích: một là quyết định kháng nguyên đặc hiệu, hai là interleukin 1, đó là hai tín hiệu cần và đủ để hoạt hoá lympho TI Lympho TI sau khi được hoạt hoá sẽ tăng sinh và tiết ra interleukin 2, interleukin 2 sẽ tác động lên một loạt các tế bào khác, trước hết là một loạt các tế bào cùng đến nhận diện các quyết định kháng nguyên được trình diện trên bề mặt đại thực bào như tế bào lympho T giúp (helper T cell, TH), lympho T gây quá mẫn muộn (delayed type hypersensitivity T cell, TDTH) Các tế bào này sau khi nhận được các quyết định kháng nguyên thì sẽ xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận kích thích của interleukin 2 Hai tín hiệu cần và đủ giúp chúng hoạt hoá và phát huy tác dụng

Hình 2.1: Cấu trúc kháng thể

Các lympho TDTH sẽ tăng sinh và tiết ra các lymphokin có ảnh hưởng đến hoạt động của các tế bào khác để chiêu mộ, hoạt hoá và kìm chân chúng tại nơi có mặt kháng nguyên, dẫn đến hình thành phản ứng viêm kiểu quá mẫn muộn

Các lympho TH sẽ tăng sinh và tiết ra các yếu tố hoà tan, yếu tố này cùng với kháng nguyên là hai tín hiệu để kích thích lympho B biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể

Các tiền tế bào lympho T gây độc sau khi nhận diện được phức hợp kháng nguyên – kháng nguyên phù hợp tổ chứa chính trên bề mặt tế bào đích thì xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận tín hiệu từ interleukin 2 Khi đã có đủ hai tín hiệu, tiền tế bào lympho T gây độc biệt hoá thành lympho T gây độc (cytotoxic T cell, TC), có khả năng gây độc trực tiếp lên tế bào đích

2.3.1 Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu

Khi kháng nguyên vào cơ thể lần đầu, chúng được đại thực bào xử lý và làm nhiệm vụ trình diện cho lympho TI Khi đó, đại thực bào đã được kích thích bởi kháng nguyên và tiết ra interleukin 1; interleukin 1 lại kích thích tế bào lympho TI, làm chúng tiết ra lymphokin gọi là interleukin 2, mở màn cho một loạt hoạt động của các tế bào lympho khác Tế bào lympho T tiết ra các lymphokin MIF (macrophage inhibition factor), MAF tác động trở lại đại thực bào làm chúng hoạt động mạnh mẽ hơn Trong đáp ứng lần thứ nhất, hoạt động của các tế bào đã tạo nên một vòng kín khuếch đại tín hiệu ban đầu nhưng còn yếu vì số tế bào đã được mẫn cảm lúc đầu còn ít, phải mất thời gian cho sự mẫn cảm cũng như cho sự sinh sôi nảy nở của dòng tế bào đã được mẫn cảm

2.3.2 Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo

Khi kháng nguyên vào cơ thể lần hai, kháng nguyên gặp ngay tế bào lympho T đã mẫn cảm, tức là đã có những thụ thể (receptor) kiểu kháng thể ở trên bề mặt và sự kết hợp như kháng nguyên – kháng thể tạo nên kích thích để chúng tiết ra các lymphokin trong đó có MIF, MAF làm tế bào đại thực bào đứng tại chỗ, tăng cường hoạt động nuốt và tiêu hoá kháng nguyên Mặt khác, các đại thực bào lại tiết ra interleukin 1 để kích thích lympho TI tăng tiết interleukin 2, cơ chế hoạt động cũng tương tự lần 1, nhưng có hai điểm khác biệt:

- Mức độ phản ứng do có nhiều tế bào đã mẫn cảm nên mạnh mẽ hơn nhiều - Phản ứng khởi phát là sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch - Tính lạ của kháng nguyên

Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác biệt chủng loài giữa thú được gây miễn dịch và kháng nguyên Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với cơ thể thú bao nhiêu thì khả năng sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu Ví dụ: Albumin gà sẽ tạo kháng thể cao hơn albumin bò khi cùng tiêm cho dê Trong miễn dịch qua trung gian tế bào chỉ cần sự khác biệt giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao, ví dụ như phản ứng thải bỏ mảnh ghép của chuột A khi ghép một bộ phận nào đó của chuột B

- Cấu tạo hoá học của kháng nguyên

Các kháng nguyên là protein hay polysaccharide đều có tính miễn dịch cao khi chúng ở dạng hoà tan hay trong cấu trúc phức tạp, ví dụ: vỏ vi khuẩn, các loại protein trong máu

Các chất khác gồm lipide, steroid, acid nucleic có tính sinh miễn dịch yếu hoặc không có tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải để trở thành một phức hợp có tính sinh miễn dịch

Hình 2.2: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản ánh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh

(Nguồn: Ian R Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)

Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại acid amin thì có tính sinh miễn dịch yếu Các kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại acid amin trở lên sẽ có tính sinh miễn dịch cao Nếu trong mạch polypeptide có thêm acid amin mạch vòng (đặc biệt là tyrosine) sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của phân tử polypeptide đó

Các polypeptide được tổng hợp từ các acid amin dạng D có tính sinh miễn dịch thấp vì nó ít bị chuyển hoá Sự chuyển hoá kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi bị chuyển hoá các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định kháng nguyên ra ngoài

- Kích thước của phân tử kháng nguyên

Kháng nguyên càng có kích thước phân tử lớn và cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên, đó là một trong những yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao

- Cách gây miễn dịch và liều lượng của kháng nguyên

Ngoài các yếu tố trên, còn có những các yếu tố khác ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch:

• Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: với những kháng nguyên mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp ứng miễn dịch, ví dụ: virus, vi khuẩn, tế bào Nhưng với những kháng nguyên hoà tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là đường tiêm trong da, dưới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần

• Liều lượng kháng nguyên: Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch

• Quy trình gây miễn dịch cũng ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của phân tử kháng nguyên Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lô thú thí nghiệm thuần chủng nhưng ở hai quy trình gây miễn dịch khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau Mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng Với những kháng nguyên yếu thường phải được gây miễn dịch bằng quy trình hết sức nghiêm ngặt và gây miễn dịch nhiều lần thì mới có đáp ứng miễn

dịch mạnh Trong khi đó, với những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần gây miễn dịch một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch mạnh

- Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên

Nếu cùng một lúc gây miễn dịch nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình Hiện tượng này được gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên

Nếu cùng một lúc cho con thú mẫn cảm với hai loại kháng nguyên: một kháng nguyên liều mạnh và một kháng nguyên liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh Hiện tượng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên Hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên có cấu trúc hoá học gần giống nhau

- Phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ)

Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã được mẫn cảm với kháng nguyên đó một lần rồi, thì hàm lượng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu Phản ứng nhớ này tồn tại trong một thời gian khá dài sau mũi tiêm thứ nhất, đó là nhờ các tế bào lympho B sau khi tiếp xúc với kháng nguyên đã phân chia và biệt hoá trở thành tế bào ghi nhớ (memory cell), để khi kháng nguyên vào những lần sau sẽ lập tức tăng sinh thành dòng tế bào đã có hoạt tính miễn dịch

- Chất bổ trợ

Ngày nay, tá chất được sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccin, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên Ngoài ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch

Qua các nghiên cứu gần đây, tá chất còn có tác dụng làm tăng tế bào TH Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ Kháng nguyên được giải phóng dần dần, có tác dụng giống như kích thích miễn dịch nhiều lần

Khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể Ig bề mặt của tế bào lympho B, chúng sẽ hoạt hoá phospholipase C ở màng tế bào thuỷ phân phosphotidyl inositol biphosphate thành diacylglycerol (DAG) và inositol triphosphate (IP3) DAG và IP3 có tác dụng hoạt hoá protein kinase C và gia tăng hàm lượng Ca2+ ngoại bào Protein kinase C được hoạt hoá sẽ thúc đẩy quá trình sao chép các gen mã hoá cho các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II antigens) và thụ thể transferrin CD71

Hình 2.3: Quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào lympho B

(Nguồn: Ian R Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)

Các tế bào lympho B bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa lên bề mặt tế bào các nhóm quyết định kháng nguyên, sau đó gắn kết với các kháng nguyên MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng nguyên MHC lớp II Phức hợp này sẽ được phức hợp thụ thể TCR – CD3 của tế bào lympho TH nhận diện và kết hợp

Hình 2.4: Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề mặt tế bào lympho B

(Nguồn: Ian R Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)

Nhờ vậy, các tế bào lympho B có thể gửi một dấu hiệu trình diện kháng nguyên bị giới hạn bởi kháng nguyên phù hợp tổ chức chính (MHC – restricted antigen – presenting signal) cho tế bào lympho TH Tế bào lympho TH bị hoạt hoá, chuyển từ

Hình 2.5: Sự kết hợp giữa tế bàolympho TH và tế bào lympho B.

(Nguồn: Ian R Tizard,Immunology, Saunders CollegePublishing, 1988)

Hình 2.6: Tế bào lympho B xử lý vàtrình diện kháng nguyên cho tế bàolympho TH (Nguồn: Ian R Tizard,

Immunology, Saunders CollegePublishing, 1988)

trạng thái nghỉ ngơi (resting state) sang trạng thái G1 (G1 state) trong chu trình tế bào (the cycle cell) và tiết ra hỗn hợp các interleukin Tế bào lympho TH gồm hai tiểu quần thể với các chức năng khác nhau: TH1 và TH2 TH1 là các tế bào lympho T giúp đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng trung gian tế bào, TH1 tiết interleukin 2 (IL2) TH2 là các tế bào lympho T giúp đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất kháng thể của tế bào lympho B TH2 tiết interleukin 4 (IL4), interleukin 5 (IL5), interleukin 6 (IL6), các interleukin này có tác động giúp tế bào lympho B hoạt hoá, phân chia và biệt hoá

Tế bào lympho B phân chia và biệt hoá thành tế bào plasma (plasma cell) Chỉ có tế bào plasma mới có khả năng sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ Các tế bào plasma có khả năng sản xuất 300 phân tử kháng thể trong 1 giây Các chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể được tổng hợp trong các polyribosome, và được kết hợp để tạo thành các phân tử kháng thể hoàn chỉnh trong các rãnh nội bào (intracellular pool)

Mặt khác, tế bào lympho B cũng biệt hoá thành tế bào ghi nhớ (memory cell) để khi gặp kháng nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn

Hình 2.7: Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên

(Nguồn: Ian R Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)

2.5 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB[4]

Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB là một protein gồm hai thành phần: MBP (maltose binding protein) và VT2eB (tiểu phần B của độc tố vero), có trọng lượng phân tử vào khoảng 47 kDa

Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB được tổng hợp từ đoạn gen tái tổ hợp trong vector

pMal-c2X đã được chèn vào vi khuẩn E coli DH5α Gen vt2eB qui định việc tổng hợp tiểu phần VT2eB của độc tố vero VT2e được tổ hợp với gen malE qui định việc tổng hợp nên protein MBP tạo thành đoạn gen tái tổ hợp trong vector pMal-c2X Hoạt động của gen này bị chi phối bởi gen ptac, một gen khởi động được hoạt hoá dưới tác động của IPTG Khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ hoạt động kích ứng việc tổng hợp protein tái

tổ hợp MBP-VT2eB

Dịch chứa protein MBP – VT2eB được cho qua cột sắc ký có chứa các hạt amylose Protein này có ái lực với amylose nên sẽ được giữ lại trong cột sắc ký, các chất khác sẽ bị rửa trôi theo dung dịch đệm

Cho dung dịch đệm có chứa maltose chạy qua cột sắc ký Do ái lực của protein MBP – VT2eB đối với maltosse mạnh hơn đối với amylose nên các protein này gắn trên amylose sẽ chuyển sang gắn trên maltose và được rửa theo dung dịch đệm ra ngoài

2.6 PHẢN ỨNG KẾT TỦA KHUẾCH TÁN KÉP TRÊN THẠCH (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)

2.6.1 Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể[1]

Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (dịch thể hoặc tế bào) với kháng nguyên thì phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu Kháng thể dịch thể (các loại Ig) thường tồn tại trong huyết thanh và dịch cơ thể nên phản ứng kháng nguyên – kháng thể còn gọi là phản ứng huyết thanh học

Phản ứng huyết thanh học là phản ứng xảy ra dựa trên cơ chế miễn dịch học, đó là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, mà cụ thể là giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể Phân tử IgG có hai trung tâm hoạt động nên kết hợp được với hai phân tử kháng nguyên cùng loại Các kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định sẽ kết hợp với nhiều phân tử kháng thể tương ứng

Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ lực liên kết lý hoá và biểu hiện làm hai pha phản ứng

Khi thực hiện phản ứng kháng nguyên và kháng thể ở in vitro, kết quả của

phản ứng có thể trực tiếp hoặc gián tiếp quan sát được bằng mắt thường hoặc bằng kính hiển vi

Với những phản ứng kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát được bằng mắt thường, phản ứng thường xảy ra theo hai pha

Pha thứ nhất: Đặc trưng bởi sự hấp thụ kháng thể lên bề mặt kháng nguyên tương ứng, pha này xảy ra nhanh được gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy Trong pha này, thực chất là sự tìm đến và kết hợp đặc hiệu giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể, tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể

Pha thứ hai: Tiếp sau pha thứ nhất, xảy ra chậm hơn và biểu hiện ra ngoài nên có thể nhìn thấy được như ngưng kết thành mạng lưới, tạo thành hạt lổn nhổn, mịn như cát, hoặc như sợi bông, hoặc kết tủa thành cặn màu trắng lắng xuống đáy; pha này thực chất là theo nguyên lý lý hoá đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy được

2.6.2 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions)(Kỹ thuật Ouchterlony) [6]

Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên là phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony)

Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn Kháng nguyên và kháng thể sau khi được phủ đầy vào các giếng sẽ khuếch tán toả tròn xung quanh các giếng và hình thành građien nồng độ Khi nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng nhau, một đường hoặc cung kết tủa xuất hiện Thông thường đường kết tủa được tạo thành ở tỉ lệ kháng thể - kháng nguyên là 4:1 Đường kết tủa được tạo thành giữa kháng nguyên và kháng thể hoạt động như một hàng rào miễn dịch đặc hiệu, ngăn chặn sự tiếp tục khuếch tán của các cặp kháng nguyên – kháng thể nhưng không cản trở sự khuếch tán của từng phân tử kháng nguyên, kháng thể

Khi nhận định kết quả, căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp xảy ra: - Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau Đây là hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhất (Hình 2.8A)

- Nếu hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức hai kháng nguyên không có liên quan với nhau Đây là hiện tượng hai kháng nguyên không đồng nhất nhau (Hình 2.8B).

- Nếu hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan một phần với kháng thể (cùng có chung một nhóm quyết định A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn (Hình 2.8C).

2.7 PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO

2.7.1 Sơ lược về tế bào vero[5]

Dòng tế bào vero (Vervet Monkey Origin) được Y Yasumura và Y Kawakita ở đại học Chiba, Nhật Bản thiết lập vào năm 1962, khởi đầu từ nuôi cấy tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Cercopithecus aethiops) Sau một số lần cấy truyền, dòng tế bào này được chuyển đến Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ - American Type Culture Collection (ATCC) Vào năm 1979, ngân hàng tế bào tiên phát được thành lập từ một ống tế bào cấy truyền lần thứ 124 Ngân hàng tế bào tiên phát được dùng để sáng lập ngân hàng tế bào đang làm việc (Manufacturer's Working Cells Bank – MWCBs) Dòng tế bào này được thử nghiệm nhiều lần để tiếp tục sử dụng cho việc sản xuất vaccin virus Thậm chí, lấy dịch nuôi cấy tế bào tiêm vào chuột không có tuyến ức (mất khả năng đề kháng), kết quả nhận được là âm tính, không hình thành khối u Thử nghiệm DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ở lần cấy truyền 169, kết quả cho thấy lượng DNA tồn dư không đáng kể Chính vì thế, lần cấy truyền 137 được dùng cho MWCB và lần cấy truyền 142 được dùng để sản xuất tế bào nuôi

Môi trường nuôi cấy tế bào chia làm hai loại, môi trường phát triển và môi trường duy trì Môi trường phát triển chứa hàm lượng huyết thanh cao 8 – 10%, có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào Huyết thanh bào thai bê là thích hợp nhất để thúc đẩy sự phát triển của tế bào vì nó không chứa các yếu tố ức chế tế bào

Hình 2.8: Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép

trên thạch

(Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977)

Tế bào vero tăng trưởng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) có bổ sung thêm huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal Bovine Serum) Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH bằng sodium bicarbonate và ủ trong tủ ấm CO2 để duy trì pH 7.2 –7.4 Tế bào vero được nuôi cấy ở 37OC, 5% CO2

2.7.2 Độc tố VT2e[4][9]

Vào năm 1977, Konowalchuk và các cộng sự đã đặt tên verotoxin (VT) cho một

độc tố do một dòng E coli tiết ra và gây chết tế bào nuôi cấy Trong một nghiên cứu trên 136 mẫu phân lập E coli, 7 trong 10 trường hợp VT dương tính đã kéo theo bệnh

tiêu chảy xảy ra ở người và một trường hợp kéo theo bệnh tiêu chảy ở heo Trong một

báo cáo vào năm 1982, O΄ Brient và các cộng tác viên đã cho rằng một vài chủng E

coli gây bệnh đường ruột đã tiết ra một độc tố gây chết tế bào Hela Cũng giống như

các độc tố do Shigella tiết ra và gây độc làm chết tế bào Hela nuôi cấy, các độc tố này

ức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào Hela và gây chết chuột Vì thế, các độc tố này được gọi là Shiga-like toxin (SLT)

Vào năm 1983, O΄Brient và LaCeck đã tinh chế SLT và đã chứng minh rằng

Shiga toxin do Shigella dysenteriae tiết ra và SLT được tiết từ chủng E coli H30 là

giống nhau về các đặc tính lý hoá và hoạt tính hoá học

Độc tố SLT-II variant (Shiga-like toxin IIv, SLT-IIv) hay VT2e là một độc tố

có đặc trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I Độc tố SLT-IIv là một phân tử gồm 2 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị A khoảng 33 kDa và 5 tiểu đơn vị B khoảng 7.7 kDa/đơn vị Tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme, trong khi tiểu đơn vị B chịu trách nhiệm cho sự liên kết các SLT với thụ thể có bản chất là glycolipid Thụ thể cho SLT-IIv là Globotetraosyl ceramide (Gb4) trên màng tế bào vero Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (Elongation Factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome, do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào

2.7.3 Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero

Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố, do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật Phản ứng đó được gọi là phản ứng trung hòa độc tố

Trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu (Gb4) có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào và gây chết tế bào Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào người ta có thể biết được là tế bào chết hay không Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng độc tố ở liều TCID50 người ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB

Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích Do đó khi tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2e vào thỏ thì cơ thể thỏ sẽ tạo ra một cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể và sản xuất kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh Nhờ đó đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ.

PHẦN 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

Thời gian: từ 14/02/2005 đến 30/07/2005 Địa điểm thực hiện:

Trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Phòng miễn dịch viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh

Phòng kiểm định vaccin viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ

3.3 VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1 Thú thí nghiệm:

5 con thỏ, trọng lượng từ 1,5 – 2 kg

3.3.2 Vật liệu và hoá chất

Dung dịch Ammonium Sulfate 100%S Dung dịch Ammonium Sulfate 45%S Dung dịch PBS 1X

Dung dịch PBS++ Dung dịch PBS-

Dung dịch Sodium azide NaN3 5% Tá chất Aluminum hydroxide Al(OH)3

Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Dung dịch Versene 0,2% Dung dịch Trypsin 0,5%

Huyết thanh bào thai bê (FBS – Fetal Bovine Serum) Dung dịch Formol 3,7%

Dung dịch Borat 0,01M, pH 8.5 Dung dịch Methylene Blue 1%

Dịch chiết canh cấy chủng E coli H28: VT2e+

Dịch chiết canh cấy chủng E coli DH5α: VT2e-

Thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%

3.3.3 Môi trường

Môi trường DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) (Gibco)

3.3.4 Thiết bị và dụng cụ

Máy khuấy từ CAT M6/1

Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments Tủ cấy vô trùng

Đầu côn vàng tiệt trùng Máng nhựa tiệt trùng Ống nghiệm thuỷ tinh 3 ml Kính hiển vi soi ngược IOD3 Xi lanh loại 1 ml, 20 ml Ống ly tâm 50 ml Eppendoft 1,5 ml

Buồng đếm hồng cầu GASSALEM Tủ lạnh 2 – 8oC

Cân phân tích Explorer OHAUS Màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm theo 2 quy trình Vị trí tiêm: tiêm dưới da

Quy trình ngắn ngày (theo R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [13]

Thí nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml

- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)

- Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 5: tiêm 1 ml với liều 75 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 9: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)

- Ngày 10: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 14: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)

- Ngày 15: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 19: lấy 1 ml (mũi nhắc lại 3)

- Ngày 20: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 25: lấy 40 ml máu

- Ngày 30: lấy 40 ml máu - Ngày 35: lấy máu tim

Quy trình dài ngày (quy trình viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh)

Thí nghiệm trên 3 con thỏ, 28 ngày tiêm 1 lần, tiêm 6 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB giảm dần từ 100 µg/ml xuống 50 µg/ml

- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)

- Ngày 1: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 28: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 42: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)

- Ngày 56: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 70: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)

- Ngày 84: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 98: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 3)

- Ngày 112: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 126: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4)

- Ngày 140: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 154: lấy máu tim

3.4.2 Chuẩn bị dịch tiêm

Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng

Pha protein tái tổ hợp với dung dịch Al(OH)3 để đạt hàm lượng 50 µg, 75 µg và 100 µg MBP-VT2eB/ml

Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút Phân phối vào các chai nhỏ 1 ml/chai, bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm

3.4.3 Thu nhận kháng huyết thanh

Lấy máu (40 ml/con, 50 ml/con):

Trước khi lấy máu, tráng ống bằng nước muối sinh lý 0,85%

o Vnước muối sinh lý = 0,2% Vmáu

Lấy máu ở tĩnh mạch tai thỏ vào ống 50 ml

Sau khi lấy máu xong, dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống Để qua đêm ở 4oC, ly tâm tách kháng huyết thanh chia làm hai phần:

- Phần 1: có bổ sung NaN3, VNaN3 = 0,05% Vmáu, bảo quản ở 4oC - Phần 2: không bổ sung NaN3, bảo quản ở -20oC

Ly tâm lạnh tách kháng huyết thanh

Cho dung dịch PBS 1X vào mỗi chai kháng huyết thanh (lượng PBS1X gấp ba lần lượng kháng huyết thanh)

Tủa kháng huyết thanh thỏ bằng cách nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S vào hỗn hợp kháng huyết thanh và PBS 1X trên máy khuấy từ ở 4oC Thể tích (NH4)2SO4 100%S sử dụng bằng tổng thể tích của kháng huyết thanh thỏ và

PBS 1X

Tiếp tục khuấy trong 45 – 60 phút ở 4oC

Để qua đêm ở 4oC

Ly tâm lạnh tách kết tủa

Rửa tủa 3 – 4 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45%S

Bảo quản kháng thể trong (NH4)2SO4 45%S ở 4oC

Sơ đồ 3.1: Quy trình tách kháng thể với ammonium sulfate 100%S

phân tử protein lớn di chuyển qua lại Khi những phân tử muối khuếch tán ra khỏi bao và đi vào dung dịch đệm, nồng độ ion của dung dịch protein giảm xuống Quá trình này vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích ngang bằng nhau (sau 5 – 6 giờ) Tiếp tục đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm mới, thực hiện khoảng 3 lần Phương pháp này không chỉ loại bỏ được muối mà cũng loại bỏ được các phân tử biến dưỡng nhỏ như ATP, coenzyme

Chuẩn bị bao thẩm tích

Bao thẩm tích được cho vào cốc chứa EDTA 0,5M và đun sôi trong nửa giờ Sau đó đổ bỏ dung dịch EDTA Lập lại tiến trình trên nhưng thay thế dung dịch EDTA bằng nước cất (khoảng 8 lần)

Thực hiện thẩm tích

Cho kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S vào bao thẩm tích đã được xử lý, dùng kẹp kẹp hai đầu bao thẩm tích lại Đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm PBS-, để 5 – 6 giờ ở 4oC Thực hiện 3 lần thẩm tích như trên, thu kháng thể để xác định hiệu giá

Hình 3.1: Bao thẩm tích

(Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977)