Chuẩn bịđộc tố VT2e
Vi khuẩn E. coli 0139 K82 (H28) có gen quy định độc tố VT2e được nuôi cấy trong môi trường LB, ở 37oC, lắc 150 vòng/phút trong 24g. Dịch nuôi cấy đem ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút. Thu dịch trong để thử độc tố trên tế bào vero.
Chuẩn bị tế bào vero
Tế bào vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), 2 mM gentamycin trong các chai nuôi cấy 25 cm2, ở 37oC, 5%CO2.
Các tế bào được chuyển vào phiến 96 giếng theo các bước sau - Đổ bỏ môi trường trong chai.
- Hút 3,5 ml versene 0,2% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trong versene có EDTA sẽ làm phân tách tế bào.
- Hút 2,5 ml trypsin 0,5% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trypsin sẽ loại bỏ protein có trong môi trường cũ.
- Sau đó cho huyết thanh bào thai bê (FBS) và môi trường DMEM vào, hút 0,2 ml đem đếm nồng độ tế bào. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ
tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồng độ huyết thanh là 10%.
- Hút 100 µl tế bào vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24g.
Xác định liều TCID50
- Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy tế bào DMEM. - Đối chứng (-)2: giếng chứa dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α.
- Đánh giá kết quả:
Nồng độ TCID50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero trong giếng nuôi cấy tế bào.
Quan sát sự huỷ hoại tế bào do độc tố verotoxin tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer
ở bước sóng 620 nm và xác định kết quả bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng (-)2.
Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng (-)2.
Dịch thu từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli 0139 K82 được pha loãng theo tỉ
lệ ½,1/20, 1/200, 1/2000, ...
Hút 100 µl dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng từ cột 1 đến cột 11 trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero. Hút 100 µl dịch lọc canh cấy vi khuẩn E. coli DH5α vào 4 giếng ở cột 12 trên phiến 96 giếng làm đối chứng (-)2, 4
giếng còn lại là đối chứng (-)1
Ủở 37oC, 5% CO2 trong 24 – 48g
Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược vào những thời điểm 24 –48g. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào.
Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định liều TCID50
Nhuộm tế bào
Đổ bỏ môi trường, tráng một lần bằng dung dịch đệm PBS++
Cho vào mỗi giếng 200 µl formol 3,7%, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g
Đổ bỏ formol. Tráng hai lần các giếng bằng dung dịch đệm borat 0,01 M, pH 8,5.
Cho vào mỗi giếng 100 µl thuốc nhuộm blue methylene 1% được pha loãng trong dung dịch đệm borat 0,01 M, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g
Đổ bỏ thuốc nhuộm. Tráng 5 lần bằng nước khử ion.
Để phiến khô ở 37oC trong 1g
Đọc độ hấp thu bằng máy spectrophotomer ở bước sóng 620 nm
Sơđồ 3.3: Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quảở bước sóng 620 nm
Công thức tính liều TCID50
Liều TCID50được tính dựa trên phương pháp Reed – Muench[11].
o 50% ( logt) x y x A × − − − = o TCID50 =logb−A=a
o Hiệu giá kháng thể trung hoà = a
10 1 Trong đó: - x: % tế bào chết dưới 50% - y: % tế bào chết trên 50% - t: Bậc pha loãng.
- a: TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50). - b: Độ pha loãng có % tế bào chết dưới 50%.