Kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S được phục hồi bằng phương pháp thẩm tích.
Nguyên tắc[12]
Một trong những phương pháp dùng để loại muối ammonium sulfate 45%S là sử dụng bao thẩm tích. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ, chúng cho phép các phân tử muối nhỏ dễ dàng di chuyển qua lại nhưng không cho phép các
Ly tâm lạnh tách kháng huyết thanh
Cho dung dịch PBS 1X vào mỗi chai kháng huyết thanh (lượng PBS1X gấp ba lần lượng kháng huyết thanh)
Tủa kháng huyết thanh thỏ bằng cách nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S vào hỗn hợp kháng huyết thanh và PBS 1X trên máy khuấy từở 4oC. Thể tích (NH4)2SO4 100%S sử dụng bằng tổng thể tích của kháng huyết thanh thỏ và PBS 1X Tiếp tục khuấy trong 45 – 60 phút ở 4oC Để qua đêm ở 4oC Ly tâm lạnh tách kết tủa Rửa tủa 3 – 4 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45%S Bảo quản kháng thể trong (NH4)2SO4 45%S ở 4oC
phân tử protein lớn di chuyển qua lại. Khi những phân tử muối khuếch tán ra khỏi bao và đi vào dung dịch đệm, nồng độ ion của dung dịch protein giảm xuống. Quá trình này vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích ngang bằng nhau (sau 5 – 6 giờ). Tiếp tục đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm mới, thực hiện khoảng 3 lần. Phương pháp này không chỉ
loại bỏđược muối mà cũng loại bỏđược các phân tử biến dưỡng nhỏ như ATP, coenzyme.
Chuẩn bị bao thẩm tích
Bao thẩm tích được cho vào cốc chứa EDTA 0,5M và đun sôi trong nửa giờ. Sau đó đổ bỏ dung dịch EDTA. Lập lại tiến trình trên nhưng thay thế dung dịch EDTA bằng nước cất (khoảng 8 lần).
Thực hiện thẩm tích
Cho kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S vào bao thẩm tích đã được xử lý, dùng kẹp kẹp hai đầu bao thẩm tích lại. Đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm PBS-, để 5 – 6 giờ ở 4oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích như
trên, thu kháng thểđể xác định hiệu giá.
Hình 3.1: Bao thẩm tích
(Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977)