Khi kháng thểđặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố, do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thểđộng vật. Phản ứng đó
được gọi là phản ứng trung hòa độc tố.
Trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ
thể đặc hiệu (Gb4) có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào và gây chết tế bào. Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào người ta có thể biết
được là tế bào chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng
độc tốở liều TCID50 người ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui
định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2e vào thỏ thì cơ thể thỏ sẽ tạo ra một cơ chếđáp ứng miễn dịch dịch thể và sản xuất kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thểđặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả
năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờđó đánh giá được khả
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: từ 14/02/2005 đến 30/07/2005.
Địa điểm thực hiện:
Trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng miễn dịch viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng kiểm định vaccin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ.
3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT
3.3.1. Thú thí nghiệm:
5 con thỏ, trọng lượng từ 1,5 – 2 kg.
3.3.2. Vật liệu và hoá chất
Dung dịch Ammonium Sulfate 100%S Dung dịch Ammonium Sulfate 45%S Dung dịch PBS 1X
Dung dịch PBS++ Dung dịch PBS-
Dung dịch Sodium azide NaN3 5% Tá chất Aluminum hydroxide Al(OH)3
Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Dung dịch Versene 0,2% Dung dịch Trypsin 0,5%
Huyết thanh bào thai bê (FBS – Fetal Bovine Serum) Dung dịch Formol 3,7%
Dung dịch Borat 0,01M, pH 8.5 Dung dịch Methylene Blue 1%
Dịch chiết canh cấy chủng E. coli DH5α: VT2e- Thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%
3.3.3. Môi trường
Môi trường DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) (Gibco).
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ
Máy khuấy từ CAT M6/1
Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments Tủ cấy vô trùng
Tủấm 37oC
Chai nuôi cấy tế bào 25, 80 cm2 Phiến polystyren 96 giếng
Tấm plastic dán phiến polystyren 96 giếng Pipette 8 kênh
Pipette tựđộng Pipette 100 µl
Đầu côn vàng tiệt trùng Máng nhựa tiệt trùng
Ống nghiệm thuỷ tinh 3 ml Kính hiển vi soi ngược IOD3 Xi lanh loại 1 ml, 20 ml
Ống ly tâm 50 ml Eppendoft 1,5 ml
Buồng đếm hồng cầu GASSALEM. Tủ lạnh 2 – 8oC.
Cân phân tích Explorer OHAUS Màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo 2 quy trình. Vị trí tiêm: tiêm dưới da
Quy trình ngắn ngày (theo R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [13]
Thí nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml.
- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)
- Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 5: tiêm 1 ml với liều 75 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 9: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)
- Ngày 10: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 14: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)
- Ngày 15: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 19: lấy 1 ml (mũi nhắc lại 3)
- Ngày 20: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 25: lấy 40 ml máu
- Ngày 30: lấy 40 ml máu - Ngày 35: lấy máu tim
Quy trình dài ngày (quy trình viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh)
Thí nghiệm trên 3 con thỏ, 28 ngày tiêm 1 lần, tiêm 6 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB giảm dần từ 100 µg/ml xuống 50 µg/ml.
- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)
- Ngày 1: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 28: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 42: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)
- Ngày 56: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 70: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)
- Ngày 84: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml. - Ngày 98: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 3)
- Ngày 112: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 126: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4)
- Ngày 140: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 154: lấy máu tim
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm
Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng.
Pha protein tái tổ hợp với dung dịch Al(OH)3 đểđạt hàm lượng 50 µg, 75 µg và 100 µg MBP-VT2eB/ml.
Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 1 ml/chai, bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm.