17 2.6.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) [6] Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên là phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony). Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn. Kháng nguyên và kháng thể sau khi được phủ đầy vào các giếng sẽ khuếch tán toả tròn xung quanh các giếng và hình thành građien nồng độ. Khi nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng nhau, một đường hoặc cung kết tủa xuất hiện. Thông thường đường kết tủa được tạo thành ở tỉ lệ kháng thể - kháng nguyên là 4:1. Đường kết tủa được tạo thành giữa kháng nguyên và kháng thể hoạt động như một hàng rào miễn dịch đặc hiệu, ngăn chặn sự tiếp tục khuếch tán của các cặp kháng nguyên – kháng thể nhưng không cản trở sự khuếch tán của từng phân tử kháng nguyên, kháng thể. Khi nhận định kết quả, căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp xảy ra: - Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhấ t (Hình 2.8A). - Nếu hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức hai kháng nguyên không có liên quan với nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên không đồng nhất nhau (Hình 2.8B). - Nếu hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan một phần với kháng thể (cùng có chung một nhóm quyết định A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn (Hình 2.8C). 18 2.7. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero [5] Dòng tế bào vero (Vervet Monkey Origin) được Y. Yasumura và Y. Kawakita ở đại học Chiba, Nhật Bản thiết lập vào năm 1962, khởi đầu từ nuôi cấy tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Cercopithecus aethiops). Sau một số lần cấy truyền, dòng tế bào này được chuyển đến Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ - American Type Culture Collection (ATCC). Vào năm 1979, ngân hàng tế bào tiên phát được thành lập từ một ống tế bào cấy truyền lần thứ 124. Ngân hàng tế bào tiên phát được dùng để sáng lập ngân hàng tế bào đang làm việc (Manufacturer's Working Cells Bank – MWCBs). Dòng tế bào này được thử nghiệm nhiều lần để tiếp tục sử dụng cho việc sản xuất vaccin virus. Thậm chí, lấy dịch nuôi cấy tế bào tiêm vào chuột không có tuyến ức (mất khả năng đề kháng), kết quả nhận được là âm tính, không hình thành khối u. Thử nghiệm DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ở lần cấy truyền 169, kết quả cho thấy lượng DNA tồn dư không đáng kể. Chính vì thế, lần cấy truyền 137 được dùng cho MWCB và lần cấy truyền 142 được dùng để sản xuất tế bào nuôi. Môi trường nuôi cấy tế bào chia làm hai loại, môi trường phát triển và môi trường duy trì. Môi trường phát triển chứa hàm lượng huyết thanh cao 8 – 10%, có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào. Huyết thanh bào thai bê là thích hợp nhất để thúc đẩy sự phát triển của tế bào vì nó không chứa các yếu tố ức chế tế bào. Hình 2.8: Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977) 19 Tế bào vero tăng trưởng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) có bổ sung thêm huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal Bovine Serum). Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH bằng sodium bicarbonate và ủ trong tủ ấm CO 2 để duy trì pH 7.2 –7.4. Tế bào vero được nuôi cấy ở 37 O C, 5% CO 2 . 2.7.2. Độc tố VT2e [4][9] Vào năm 1977, Konowalchuk và các cộng sự đã đặt tên verotoxin (VT) cho một độc tố do một dòng E. coli tiết ra và gây chết tế bào nuôi cấy. Trong một nghiên cứu trên 136 mẫu phân lập E. coli, 7 trong 10 trường hợp VT dương tính đã kéo theo bệnh tiêu chảy xảy ra ở người và một trường hợp kéo theo bệnh tiêu chảy ở heo. Trong một báo cáo vào năm 1982, O΄ Brient và các cộng tác viên đã cho rằng một vài chủng E. coli gây bệnh đường ruột đã tiế t ra một độc tố gây chết tế bào Hela. Cũng giống như các độc tố do Shigella tiết ra và gây độc làm chết tế bào Hela nuôi cấy, các độc tố này ức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào Hela và gây chết chuột. Vì thế, các độc tố này được gọi là Shiga-like toxin (SLT). Vào năm 1983, O΄Brient và LaCeck đã tinh chế SLT và đã chứng minh rằng Shiga toxin do Shigella dysenteriae tiết ra và SLT được tiết từ chủng E. coli H30 là giống nhau về các đặ c tính lý hoá và hoạt tính hoá học. Độc tố SLT-II variant (Shiga-like toxin IIv, SLT-IIv) hay VT2e là một độc tố có đặc trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. Độc tố SLT-IIv là một phân tử gồm 2 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị A khoảng 33 kDa và 5 tiểu đơn vị B khoảng 7.7 kDa/đơn vị. Tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme, trong khi tiểu đơn vị B chịu trách nhiệm cho sự liên kết các SLT với thụ thể có bản chất là glycolipid. Thụ thể cho SLT- IIv là Globotetraosyl ceramide (Gb4) trên màng tế bào vero. Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (Elongation Factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome, do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào. 20 2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố, do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật. Phản ứng đó được gọi là phản ứng trung hòa độc tố. Trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu (Gb4) có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào và gây chết tế bào. Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào ng ười ta có thể biết được là tế bào chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng độc tố ở liều TCID 50 người ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2e vào thỏ thì cơ thể thỏ sẽ tạo ra một cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch th ể và sản xuất kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờ đó đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễ n dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ. 21 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian: từ 14/02/2005 đến 30/07/2005. Địa điểm thực hiện: Trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng miễn dịch viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. Phòng kiểm định vaccin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ. 3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1. Thú thí nghiệm: 5 con thỏ, tr ọng lượng từ 1,5 – 2 kg. 3.3.2. Vật liệu và hoá chất Dung dịch Ammonium Sulfate 100%S Dung dịch Ammonium Sulfate 45%S Dung dịch PBS 1X Dung dịch PBS ++ Dung dịch PBS - Dung dịch Sodium azide NaN 3 5% Tá chất Aluminum hydroxide Al(OH) 3 Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Dung dịch Versene 0,2% Dung dịch Trypsin 0,5% Huyết thanh bào thai bê (FBS – Fetal Bovine Serum) Dung dịch Formol 3,7% Dung dịch Borat 0,01M, pH 8.5 Dung dịch Methylene Blue 1% Dịch chiết canh cấy chủng E. coli H28: VT2e+ 22 Dịch chiết canh cấy chủng E. coli DH5α: VT2e- Thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2% 3.3.3. Môi trường Môi trường DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) (Gibco). 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ Máy khuấy từ CAT M6/1 Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments Tủ cấy vô trùng Tủ ấm 37 o C Chai nuôi cấy tế bào 25, 80 cm 2 Phiến polystyren 96 giếng Tấm plastic dán phiến polystyren 96 giếng Pipette 8 kênh Pipette tự động Pipette 100 µl Đầu côn vàng tiệt trùng Máng nhựa tiệt trùng Ống nghiệm thuỷ tinh 3 ml Kính hiển vi soi ngược IOD3 Xi lanh loại 1 ml, 20 ml Ống ly tâm 50 ml Eppendoft 1,5 ml Buồng đếm hồng cầu GASSALEM. Tủ lạnh 2 – 8 o C. Cân phân tích Explorer OHAUS Màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo 2 quy trình. Vị trí tiêm: tiêm dưới da 23 Quy trình ngắn ngày (theo R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [13] Thí nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml. - Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng) - Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 5: tiêm 1 ml với liều 75 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 9: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1) - Ngày 10: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 14: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2) - Ngày 15: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 19: lấy 1 ml (mũi nhắc lại 3) - Ngày 20: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 25: l ấy 40 ml máu - Ngày 30: lấy 40 ml máu - Ngày 35: lấy máu tim Quy trình dài ngày (quy trình viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh) Thí nghiệm trên 3 con thỏ, 28 ngày tiêm 1 lần, tiêm 6 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB giảm dần từ 100 µg/ml xuống 50 µg/ml. - Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng) - Ngày 1: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 28: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 42: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1) - Ngày 56: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 70: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2) - Ngày 84: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml. - Ngày 98: l ấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 3) - Ngày 112: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 126: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4) - Ngày 140: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 154: lấy máu tim 24 3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm Chuẩn bị dịch Al(OH) 3 vô trùng. Pha protein tái tổ hợp với dung dịch Al(OH) 3 để đạt hàm lượng 50 µg, 75 µg và 100 µg MBP-VT2eB/ml. Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 1 ml/chai, bảo quản ở 4 o C cho đến khi tiêm. 3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh Lấy máu (40 ml/con, 50 ml/con): Trước khi lấy máu, tráng ống bằng nước muối sinh lý 0,85%. o V nước muối sinh lý = 0,2% V máu Lấy máu ở tĩnh mạch tai thỏ vào ống 50 ml. Sau khi lấy máu xong, dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống. Để qua đêm ở 4 o C, ly tâm tách kháng huyết thanh chia làm hai phần: - Phần 1: có bổ sung NaN 3 , V NaN3 = 0,05% V máu , bảo quản ở 4 o C. - Phần 2: không bổ sung NaN 3 , bảo quản ở -20 o C. 3.4.4.Xử lý kháng huyết thanh 3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S Nguyên tắc [10][12] Phương pháp kết tủa protein được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng muối vô cơ như ammonium sulfate, potassium sulfate, sodium sulfate. Khi ammonium sulfate hoà tan, một số lượng lớn các phân tử nước sẽ bám xung quanh các phân tử ammonium sulfate. Khi số lượng các phân tử ammonium sulfate trong dung dịch tăng lên thì số lượng các phân tử nước kết hợp với protein sẽ giảm xuống. Cuối cùng, không còn đủ nước kết hợp với protein để tạo thành dung dịch hoà tan và protein bắ t đầu kết tủa. Đây còn được gọi là tiến trình mất nước của protein. Sau khi nhỏ từ từ hết ammonium sulfate 100%S, tiếp tục khuấy 45 – 60 phút để hoà tan hoàn toàn ammonium sulfate. 25 Tiến hành 3.4.4.2. Hòa tan kháng thể Kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S được phục hồi bằng phương pháp thẩm tích. Nguyên tắc [12] Một trong những phương pháp dùng để loại muối ammonium sulfate 45%S là sử dụng bao thẩm tích. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ, chúng cho phép các phân tử muối nhỏ dễ dàng di chuyển qua lại nhưng không cho phép các Ly tâm lạnh tách kháng huyết thanh Cho dung dịch PBS 1X vào mỗi chai kháng huyết thanh (lượng PBS1X gấp ba lần lượng kháng huyết thanh) Tủa kháng huyết thanh thỏ bằng cách nhỏ từng giọt (NH 4 ) 2 SO 4 100%S vào hỗn hợp kháng huyết thanh và PBS 1X trên máy khuấy từ ở 4 o C. Thể tích (NH 4 ) 2 SO 4 100%S sử dụng bằng tổng thể tích của kháng huyết thanh thỏ và PBS 1X Tiếp tục khuấy trong 45 – 60 phút ở 4 o C Để qua đêm ở 4 o C Ly tâm lạnh tách kết tủa Rửa tủa 3 – 4 lần bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 45%S Bảo quản kháng thể trong (NH 4 ) 2 SO 4 45%S ở 4 o C Sơ đồ 3.1: Quy trình tách kháng thể với ammonium sulfate 100%S 26 phân tử protein lớn di chuyển qua lại. Khi những phân tử muối khuếch tán ra khỏi bao và đi vào dung dịch đệm, nồng độ ion của dung dịch protein giảm xuống. Quá trình này vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích ngang bằng nhau (sau 5 – 6 giờ). Tiếp tục đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm mới, thực hiện khoảng 3 lần. Phương pháp này không chỉ loại bỏ được muối mà cũng loại bỏ được các phân tử biến dưỡng nhỏ như ATP, coenzyme. Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích được cho vào cốc chứa EDTA 0,5M và đun sôi trong nửa giờ. Sau đó đổ bỏ dung dịch EDTA. Lập lại tiến trình trên nhưng thay thế dung dịch EDTA bằng nước cất (khoảng 8 lần). Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S vào bao thẩm tích đã được xử lý, dùng kẹp kẹp hai đầu bao thẩm tích lại. Đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệ m PBS - , để 5 – 6 giờ ở 4 o C. Thực hiện 3 lần thẩm tích như trên, thu kháng thể để xác định hiệu giá. Hình 3.1: Bao thẩm tích (Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977) . Minh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ. 3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1. Thú thí nghiệm: 5 con thỏ, tr ọng lượng từ 1,5 – 2. nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml. - Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng) - Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều. 50 µg MBP-VT2eB/ ml - Ngày 12 6: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4) - Ngày 14 0: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ ml - Ngày 15 4: lấy máu tim 24 3 .4. 2. Chuẩn bị dịch tiêm Chuẩn bị dịch Al(OH) 3