Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong cải tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào thực vật và có khoảng 400 loại cây tr
Khoá luận tốt nghiệp M UHin nay, trờn th gii vic chuyn gen vo thc vt ó tr thnh k thut thụng dng trong ci to ging cõy trng. ó cú hn 50 loi gen c chuyn vo thc vt v cú khong 400 loi cõy trng chuyn gen ó c kim tra ngoi ng rung. Nhiu sn phm chuyn gen ang c tiờu th trờn th trng nh bụng, ngụ, u tng cú kh nng khỏng sõu, khỏng cht dit c, ci du cú thnh phn du thay i, c chua chớn chm v.v nc ta, mt s phũng thớ nghim ó v ang ỏp dng k thut chuyn gen ci to nhiu loi ging cõy trng khỏc nhau. Trong ú, Phũng Cụng ngh T bo Thc vt, Vin Cụng ngh Sinh hc l mt trong nhng n v ang tin hnh theo hng nghiờn cu ny. Cho n nay, phũng ó to ra c mt s dũng cõy chuyn gen v ang a vo phõn tớch. Bờn cnh nhng ỏnh giỏ s biu hin ca gen chuyn nh chu hn, mn, khỏng sõu, khỏng bnh, nhng phõn tớch phõn t cng c tin hnh. Cho n nay, kt qu phõn tớch phõn t cõy chuyn gen ch dng li bng s dng k thut PCR. Lai Southern l k thut quan trng, cú giỏ tr khng nh s cú mt ca gen chuyn. Ngoi ra, vi k thut ny mi cú th ỏnh giỏ chớnh xỏc s im gn ca gen chuyn, thụng qua ú cú th phõn tớch c s liờn quan gia mc biu hin v kiu gn ca gen chuyn.Nhm a quy trỡnh lai Southern vo mc ớch ỏnh giỏ cõy chuyn gen, chỳng tụi s dng cỏc dũng bụng khỏng sõu lm nguyờn liu nghiờn cu v ỏp dng h thng phi phúng x DIG kim tra phõn tớch gen CryIA. Bn khoỏ lun ny bỏo cỏo li nhng kt qu nghiờn cu bc u v s dng k thut lai Southern trong phõn tớch cõy chuyn gen. õy l tin cho cỏc phõn tớch phõn t tip theo i vi cỏc cõy chuyn gen khỏc ó v ang c to ra. 1 Khoá luận tốt nghiệp Chơng 1: Tổng quan tài liệu1.1. Chuyển gen ở thực vật 1.1.1. Chuyển gen ở thực vật và những lợi ích đối với cải tạo giống cây trồngVào những năm đầu của thập kỉ 80, các nhà khoa học khám phá ra việc chuyển gen hay còn gọi là biến nạp gen vào thực vật để tạo ra đặc tính di truyền mới nh khả năng kháng bệnh hay vật gây hại. Nhiều kỹ thuật chuyển gen ra đời, đợc hoàn thiện và áp dụng rộng rãi nh: bắn gen trực tiếp, thông qua Agrobacterium, nhờ vào xung điện hoặc hoá học. Trong đó, hai phơng pháp bắn gen trực tiếp thông qua Agrobacterium tỏ ra hữu hiệu hơn cả. Vào năm 1983, cây biến nạp gen đầu tiên ra đời đó là cây thuốc lá kháng kháng sinh. Năm 1985, một số cây chuyển gen kháng sâu, bệnh virus và bệnh nấm lần lầu tiên đợc đa ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng. Đến nay, sự biến nạp gen vào cây trồng không còn là vấn đề phải tranh cãi nữa mà đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loại đã đợc kiểm tra ngoài đồng ruộng. Đối với các loài cây rau, chuyển gen đã thành công nh ở cà chua, cà rốt, khoai tây, rau diếp, cần tây, súp lơ, da chuột, dâu tây, cải xanh, cải bắp, măng tây, ở các cây trồng ngũ cốc nh lúa nớc, lúa mạch, lúa mỳ, ngô và cả những cây công nghiệp nh cây bông việc nghiên cứu chuyển gen cũng đã thu đợc nhiều kết quả khả quan [1].Những cây trồng đợc chuyển gen vẫn giống cây trồng truyền thống nhng chúng có thêm một số đặc điểm đợc cải thiện. Vì vậy ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nhằm cải tạo giống cây trồng đã đem lại nhiều lợi ích rõ rệt trong phát triển sản xuất nông nghiệp và phục vụ đời sống con ngời. Có thể điểm những lợi ích đó nh: - Tăng sản lợng.- Giảm chi phí sản xuất.- Tăng lợi nhuận nông nghiệp.2 Khoá luận tốt nghiệp - Cải thiện môi trờng.Ngày nay, các nhà khoa học đang hớng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ 2 có đặc điểm tăng giá trị dinh dỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến. Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt.- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột.- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây.- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng.- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [7].1.1.2. Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 11 triệu ha năm 1997, 27,8 triệu ha năm 1998, 39,9 triệu ha năm 1999 và tới hơn 44 triệu ha năm 2000. Các quốc gia trồng cây chuyển gen gồm có Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, urugoay và Mỹ. Hiện nay, những sản phẩm lơng thực, thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trờng. Các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật tập trung vào một số hớng nh: - Chịu chất diệt cỏNgời ta dùng gen tổng hợp EPSP chuyển vào cây trồng để chịu đợc Glyphosphat. Nhiều loài thực vật đã biến nạp và đang đợc thử nghiệm nh củ cải đờng, đậu tơng, nho. cải hạt dầu, bông, cà chua và thuốc lá. Cây đậu tơng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ khống chế cỏ dại tốt hơn, góp phần nâng cao hiệu quả của các trang trại nhờ tối u hoá năng suất và sử dụng hiệu quả đất trồng trọt, tiết kiệm thời gian cho nông dân. Giống mới này hoàn toàn giống các giống đậu tơng khác về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức chế biến thành thực phẩm và thức ăn gia súc. Đợc trồng nhiều ở Achentina, úc, Braxin, Canada, EU, Nhật bản, Hàn Quốc, Mexico, Nga, Thụy Điển, Mỹ và uruguay. Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ đợc trồng tại úc, Canada và Mỹ.3 Khoá luận tốt nghiệp - Kháng bệnh virus Ngời ta đang nghiên cứu các gen kháng bệnh virus ở thực vật. Ngoài ra đang nghiên cứu khả năng kháng virus bằng biến nạp gen từ động vật.Đu đủ đợc chuyển gen của virus mã hoá cho protein vỏ của virus đốm vòng. Protein này tạo cho cây khả năng tự bảo vệ chống lại bệnh đốm vòng. Một gen từ nguồn bệnh đã đợc sử dụng để kháng lại chính nó. Cây khoai tây đã đợc chuyển gen giúp kháng virus gây xoăn lá, cây bí chuyển gen giúp kháng virus gây bệnh. - Kháng các loài gây hạiChuyển gen độc tố từ Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo giống chịu côn trùng có hại. Cây bông chuyển gen Bt kháng sâu đục quả và ăn lá, đợc trồng phổ biến ở nhiều nớc nh Trung quốc, Nam phi, Achentina, . Các cây bông, lúa mang gen chuyển này có khả năng chống chịu sâu đục thân rất tốt.- Chống chịu các bệnh nấmNgời ta đang phân lập gen 1,3-glucanase (mã hóa enzym phân hủy thành tế bào của các mầm bệnh nấm) từ thực vật kháng bệnh để chuyển vào các loài cây mẫn cảm.- Thay đổi thành các axit béo Ngời ta làm tăng hàm lợng axit béo đơn không no và các thành phần dầu thực vật. Cây đậu tơng chuyển gen axit oleic có hàm lợng axit oleic cao, một axit béo có một liên kết không no. Theo các nhà dinh dỡng thì chất béo không no đợc xem là tốt hơn so với chất béo no, đợc tìm thấy ở thịt bò, lợn, phomat và một số thức ăn thờng ngày khác.Cải dầu chuyển gen có hàm lợng Laurate cao, đợc dùng trong công nghiệp thực phẩm để làm lớp phủ ngoài kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ, đợc trồng ở Canada và Mỹ. Cải dầu có hàm lợng axit oleic cao đợc trồng ở Canada.- Làm chậm chín quả ở cà chua4 Khoá luận tốt nghiệp Cây cà chua mang một gen chuyển làm chậm quá trình làm mềm quả tự nhiên khi quả chín. Đây là loại thực phẩm chuyển gen đầu tiê n đợc sản xuất ở các nớc phát triển. Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn. Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm.- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo, [7].ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen. Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã đợc thực hiện. Đó là: - Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu tryptopha.- Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp bằng súng bắn gen. Đến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ chuyển gen chín chậm và kháng virus đốm vòng đã đợc tạo ra. Các dòng cây chuyển gen này sẽ đợc đa vào phân tích phân tử- Chuẩn bị thiết bị để tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ việc đánh giá theo dõi cây chuyển gen nh PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. Nh vậy, có thể tiến hành chuyển gen và đa kỹ thuật này vào công việc tạo giống cây trồng ở Việt Nam [1].1.2. Các kỹ thuật Phân tích phân tử ADN cây chuyển genCùng với các phân tích và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các cây chuyển gen nh các chỉ tiêu hoá sinh, nông sinh, mức độ kháng sâu bệnh, chống chịu các điều kiện ngoại cảnh v.v., phân tích gen chuyển ở mức phân tử cũng đợc tiến hành song song bằng nhiều kỹ thuật khác nhau nh PCR, lai 5 Khoá luận tốt nghiệp Southern, Western blost. Chúng tôi xin giới thiệu hai kỹ thuật cơ bản và quan trọng để phân tích phân tử cây chuyển gen là PCR và lai Southern.1.2.1. Kỹ thuật PCRPhơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một ph-ơng pháp tạo dòng ADN invitro không cần có sự hiện diện của tế bào [5], [6].1.2.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCRTất cả các ADN polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những đoạn mồi. Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ xung với một đầu của mạch khuôn từ đó ADN polymeraza sẽ gắn các dNTP tự do để nối dài đoạn mồi, hình thành mạch mới. Do đó, nếu ta cung cấp hai đoạn mồi đặchiệu bắt cặp bổ xung với 2 đầu của một trình tự ADN (mồi xuôi và mồi ngợc) ta sẽ tổng hợp đoạn ADN nằm giữa 2 mồi đó [5], [9].1.2.1.2. Thành phần phản ứng PCR:Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm ADN khuôn tức là đoạn trình tự ADN cần đợc nhân lên; 2 đoạn mồi, mỗi mồi dài 18-24 nucleotid; ADN polymeraza (thờng hiện nay sử dụng là Taq polymeraza - là một loại enzym chịu nhiệt); bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) và dung dịch đệm và ion Mg2+ [12].Phản ứng PCR tối u khi ADN khuôn tinh sạch, nhng một u điểm lớn của phơng pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu ADN không đợc bảo quản tốt, đã bị phá huỷ từng phần nh những vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay của ngời đã chết .Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự khuyếch đại một đoạn ADN đặc trng. Mồi luôn gắn với ADN khuôn ở đầu 3 và ADN Polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp theo chiều 5 3 [5]. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR. Việc chọn mồi cũng phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:6 Khoá luận tốt nghiệp -Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngợc, và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi.-Tm của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt nhau một cách quá xa.Công thức nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:Tm=81,5 + 16,6(log10[J+] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA) Trong đó [J+] : Nồng độ các cation hoá trị 1FA : Chất dùng gây biến tính ADNI : Chiều dài mồi-Các mồi chọn phải đặc trng cho trình tự ADN cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.-Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn. Phản ứng PCR sẽ tối u nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb [5], [12].Trớc đây trong phản ứng PCR ngời ta thờng dùng ADN polymeraza I tách chiết từ E. coli và ADN polymeraza của Phage T4. Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân huỷ). Việc phát hiện ra các ADN polymeraza chịu nhiệt nh Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza, đã cho phép quá trình nhân bản đợc thực hiện một cách tự động hoá. Thông dụng nhất là Taq Polymerse đợc tách ra từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus sống ở suối nớc nóng 94-1000C. Enzym này có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 70-800C, có trọng lợng phân tử là 94kD, gồm 832 axit amin do gen có 2499 cặp bazơ tổng hợp nên [28]. Năm 1988, Saiki đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau 130 phút ở nhiệt độ 92,50C, sau 40 phút ở 950C và sau 5-6 phút ở 970C. Mặt khác, nồng độ ion Mg2+ và d NTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hởng rất nhiều đến hoạt tính của Taq polymeraza [14], [28].Ngày nay, nhiều enzym polymeraza chịu nhiệt khác đã đợc đa ra thị tr-ờng với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth pal là một enzyme tách từ Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một enzyme 7 Khoá luận tốt nghiệp phiên mã ngợc khi có mặt của ARN khuôn và Mg2+ , mặt khác Tth pal lại xúc tác phản ứng khuyếch đại ADN nếu trong môi trờng có ADN khuôn và Mg2+.Bốn loại nucleotit thờng đợc sử dụng ở nồng độ là 20 200 àM/mỗi loại nucleotit, nếu sự mất cân băng trong thành phần các nucleotit xẩy ra sẽ dẫn tới các lỗi sao chép của ADN polymeraza.Nồng độ ion Mg2+ cũng là nhân tố ảnh hởng mạnh đến phản ứng PCR. Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối u phải đ-ợc xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm.Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vợt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ nh vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong giai đoạn đầu số lợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lợng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm do các nguyên nhân sau:- Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao- Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng.- Các bản sao vừa đợc tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau - Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng [5].1.2.1.3. Các bớc của phản ứng PCRPhản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau:-Giai đoạn 1: Biến tính ADN ở nhiệt độ từ 94-950C trong thời gian ngắn 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.-Giai đoạn 2: Gắn mồi, nhiệt độ đợc hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động từ 40-600C tuỳ thuộc vào Tm của mồi mà thời gian bắt cặp khác nhau. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.-Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài. Nhiệt độ tăng lên 72 0C. Đó là điều kiện để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ xung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây [14].8 Khoá luận tốt nghiệp Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn nh trên, một phân tử ADN khuôn đợc nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa đợc nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lợng đoạn ADN đợc tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và nh vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu [6].1.2.1.4. ứng dụng của kỹ thuật PCRPCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích bộ genom của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lợng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu. PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, nh việc xác định trình tự của ADN đợc nhân bản, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể. Hiền nay PCR đợc xem là một phơng pháp nhanh và tơng đối đơn giản để phân tích sơ bộ cây chuyển gen [1].1.2.2. Kỹ thuật lai Southern và ứng dụng1.2.2.1. Nguyên lý của lai Southern Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) nói chung và lai Southern nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) đợc lu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lu giữ nh màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhng vẫn duy trì đợc khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác [1].Đối với ADN, phơng pháp này đợc Edwind M. Southern xây dựng và thử nghiệm thành công vào năm 1975. ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn ADN bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau. Các bớc tiến hành trong kỹ thuật này có thể đợc tóm tắt nh sau: -ADN bộ gen đợc cắt thành những đoạn có kích thớc khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và đợc phân tách bằng điện di trên bản gel.9 Khoá luận tốt nghiệp -ADN đợc biến tính ngay trên bản gel rồi đợc thấm truyền lên màng lai. Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn ADN trên màng lai đợc giữ nguyên nh trên bản gel.-ADN cố định trên màng đợc đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hoá học . Sau quá trình lai ngời ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.-Cuối cùng ngời ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang. Kỹ thuật này đợc gọi là kỹ thuật phân tích màng thấm chuyển Southern (Southern blot analysis), gọi tắt là lai Southern [1], [5].Khi ứng dụng lai Southern đối với các ARN, kỹ thuật này đợc đặt tên là lai Northern. Bớc phát hiện các băng ARN đợc tiến hành thông qua lai với mẫu ADN hoặc ARN đánh dấu. Còn khi tiến hành kỹ thuật này với protein thì gọi là lai Western để phát hiện các băng protien bằng kháng thể đánh dấu. Tới nay đã có nhiều phơng pháp cải tiến, hình thành nhiều kỹ thuật phối hợp nh Southwestern, phát hiện băng protein bằng ADN đánh dấu hoặc Western xa, dùng mẫu protein không phải kháng thể (non-antibody) [5].Về nguyên tắc, kỹ thuật thấm chuyển không thay đổi nhiều từ khi đợc phát minh, nhng chủng loại các màng và kỹ thuật phát hiện các loại đại phân tử thông qua lai đánh dấu hay miễn dịch đánh dấu kèm với các bộ kit luôn đợc cải tiến cho tiện lợi và an toàn. Màng nitrocellulose đợc dùng rất nhiều, nhng gần đây trong hai loại màng nylon trung tính và màng tích điện thì loại màng sau do tích điện nên có sức gắn ADN cao hơn. Đơng nhiên trong kỹ thuật Western, chất liệu nitrocellulose vẫn đang đợc sử dụng rộng rãi, ngoài ra còn có màng polyvinylidene diflouride (PVDF) và màng nylon [6].Việc phát hiện các phân tử trên màng đợc tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu. Trong nhiều năm kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã đợc ứng dụng một cách rộng rãi, phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP. Ưu điểm lớn của phơng pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện đợc vết ADN ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn. Tuy nhiên phơng pháp đánh dấu phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo 10 [...]... một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn - Phát hiện sinh vật chuyển gen, đánh giá số lợng bản gen và điểm gắn của gen chuyển Trong bản luận văn này chúng tôi đi sâu vào các chi tiết tiến hành và kết quả phân tích phân tử các dòng cây bông chuyển gen thông qua kỹ thuật lai Southern bằng hệ thống DIG [1] 1.3 nghiên cứu cải tạo cây bông ở Việt Nam 1.3.1 Sự phát triển trong sản xuất và nghiên cứu. .. bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên và DIG 1.2.2.3 ứng dụng của kỹ thuật lai Southern Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử rất quan trọng và đợc sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử nh: 12 Khoá luận tốt nghiệp - Lập bản đồ giới hạn của một gen - Phát hiện các đa hình độ dài (fragment polymorphism) của cùng một gen ở các chủng khác hay giữa các cá thể khác nhau qua... cm Trong điều kiện này, quá trình thấm chuyển chậm lại, sau 10-12 giờ độ dài thấm ớt của tầng giấy thấm là 6-7 cm, đợc coi là bình thờng theo kinh nghiệm 3.3.4 Kết quả lai Southern Các công bố về kết quả phân tích gen chuyển bằng lai Southern ở cây lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch chỉ ra rằng số lợng điểm gắn của gen chuyển thay đổi phụ thuộc vào kỹ thuật đã áp dụng khi chuyển gen [15], [26] Khi tạo cây. .. quá trình lai gen CryIA trong genom cây bông ở cả 3 màng, ảnh lai các vạch của thang ADN chuẩn rất rõ Tài liệu tham khảo về các thí nghiệm phân tích lai Southern cây bông chuyển gen rất hạn chế Chúng tôi cha tìm đợc một công bố đầy đủ và cụ thể nào liên quan đến kết quả lai Southern ở cây bông trên các mạng lu trữ tài liệu khoa học nh PubMed, PNAS online Chúng tôi sẽ tiến hành lai Southern của gen CryIA(c)... đợc giải thích do lợng ARN còn cao trong các mẫu ADN Nh vậy, kết quả điện di và đo quang phổ hấp phụ các mẫu ADN cho thấy đã thu đợc ADN sạch và có trọng lợng phân tử lớn, đủ tiêu chuẩn để tiến hành các kỹ thuật PCR và lai Southern 3.2 Phân tích các dòng bông kháng sâu bằng kỹ thuật PCR Các dòng bông kháng sâu đợc đa vào phân tích phân tử do viện Nghiên cứu Cây bông và Cây có sợi cung cấp Đây là các dòng... sâu lớn [2] Để phân tích các dòng bông kháng sâu ở mức độ phân tử, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR và lai Southern kiểm tra sự có mặt của gen CryIA và đánh giá số lợng các điểm gắn kết và bản gen chuyển trong các dòng bông này Qua đó, có thể tìm hiểu mối liên quan giữa số lợng các bản gen chuyển nếu có và mức kháng sâu của cây bông Kết quả của những thực nghiệm này có ý nghĩa to lớn trong việc hoàn... tạo cây chuyển gen bằng bắn gen, điểm gắn gen chuyển thờng là đa điểm, thay đổi từ 1 đến nhiều điểm, 34 Khoá luận tốt nghiệp có khi tới 10 điểm khác nhau [10], [11], [13], [17] Trong khi đó, ở các cây chuyển gen thông qua Agrobacterium, gen chuyển đa phần gắn ở đơn điểm [21], [29], [30] Trong thí nghiệm của chúng tôi, để tăng tính đặc hiệu quá trình lai giữa mẫu dò gen CryIA và genom bông chuyển gen, ... lai ở 4/12 dòng trên màng lai, trong đó một dòng mang gen chuyển ở hai điểm khác nhau, số còn lại có gen chuyển ở một điểm (hình 12) ở đây quá trình lai giữa mẫu dò và gen CryIA trong cây bông chuyển gen đã xảy ra, nhng không phải ở tất cả các mẫu ADN Theo chúng tôi, có yếu tố đã cản trở quá trình lai trên genom cây bông Trên màng lai thứ 3, chúng tôi cũng chỉ nhận đợc băng lai ở 1/16 dòng Điều này... phản ứng trong 1 giờ, thu hoạch 130 ng ADN đánh dấu là đủ cho nhiều thí nghiệm lai Tiến hành lai Southern Lai Southern có thể đợc tiến hành trong ống thuỷ tinh hay hộp nhựa Nếu dùng ống thuỷ tinh thì cần phải có trục quay để quay đều ống trong suốt quá trình lai Nếu dùng hộp lai thì dùng máy lắc Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ống thuỷ tinh để lai và lò lai Qui trình lai mẫu dò trên màng Southern. .. 1.3.2 Nghiên cứu cây bông chuyển gen kháng sâu hại Cây bông chuyển gen kháng sâu (bông Bt) chứa một protein do gen CryIA qui định có nguồn gốc từ vi sinh vật đất tự nhiên là Bacillus thuringiensis (Bt) Protein Bt đem lại cho cây bông khả năng kháng sâu ổn định Do tính kháng sâu cao, protein Bt đã đợc sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học an toàn trong hơn 40 năm qua Do vậy, đối với cây bông chuyển gen Bt . ứng dụng của kỹ thuật lai SouthernKỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử rất quan trọng và đợc sử dụng nhiều trong các phân tích. đối đơn giản để phân tích sơ bộ cây chuyển gen [1].1.2.2. Kỹ thuật lai Southern và ứng dụng1 .2.2.1. Nguyên lý của lai Southern Kỹ thuật lai phân tử (molecular