Nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen

Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong cải tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào thực vật và có khoảng 400 loại cây tr

MỞ ĐẦU

Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong cải tạo giống cây trồng Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào thực vật và có khoảng 400 loại cây trồng chuyển gen đã được kiểm tra ngoài đồng ruộng Nhiều sản phẩm chuyển gen đang được tiêu thụ trên thị trường như bông, ngô, đậu tương có khả năng kháng sâu, kháng chất diệt cỏ, cải dầu có thành phần dầu thay đổi, cà chua chín chậm v.v…

Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm đã và đang áp dụng kỹ thuật chuyển gen để cải tạo nhiều loại giống cây trồng khác nhau Trong đó, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học là một trong những đơn vị đang tiến hành theo hướng nghiên cứu này Cho đến nay, phòng đã tạo ra được một số dòng cây chuyển gen và đang đưa vào phân tích Bên cạnh những đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển như chịu hạn, mặn, kháng sâu, kháng bệnh, những phân tích phân tử cũng được tiến hành Cho đến nay, kết quả phân tích phân tử cây chuyển gen chỉ dừng lại bằng sử dụng kỹ thuật PCR Lai Southern là kỹ thuật quan trọng, có giá trị khẳng định sự có mặt của gen chuyển Ngoài ra, với kỹ thuật này mới có thể đánh giá chính xác số điểm gắn của gen chuyển, thông qua đó có thể phân tích được sự liên quan giữa mức biểu hiện và kiểu gắn của gen chuyển.

Nhằm đưa quy trình lai Southern vào mục đích đánh giá cây chuyển gen, chúng tôi sử dụng các dòng bông kháng sâu làm nguyên liệu nghiên cứu và áp dụng

hệ thống phi phóng xạ DIG để kiểm tra phân tích gen CryIA Bản khoá luận này báo

cáo lại những kết quả nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen Đây là tiền đề cho các phân tích phân tử tiếp theo đối với các cây chuyển gen khác đã và đang được tạo ra

Chơng 1: Tổng quan tài liệu

Đến nay, sự biến nạp gen vào cây trồng không còn là vấn đề phải tranh cãi nữa mà đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Đã có hơn 50 loại gen đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loại đã đợc kiểm tra ngoài đồng ruộng Đối với các loài cây rau, chuyển gen đã thành công nh ở cà chua, cà rốt, khoai tây, rau diếp, cần tây, súp lơ, da chuột, dâu tây, cải xanh, cải bắp, măng tây, … ở các cây trồng ngũ cốc nh lúa nớc, lúa mạch, lúa mỳ, ngô và cả những cây công nghiệp nh cây bông việc nghiên cứu chuyển gen cũng đã thu đợc nhiều kết quả khả quan [1].

Những cây trồng đợc chuyển gen vẫn giống cây trồng truyền thống nhng chúng có thêm một số đặc điểm đợc cải thiện Vì vậy ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nhằm cải tạo giống cây trồng đã đem lại nhiều lợi ích rõ rệt trong phát triển sản xuất nông nghiệp và phục vụ đời sống con ngời Có thể điểm những lợi ích đó nh:

- Tăng sản lợng.

- Giảm chi phí sản xuất.

- Tăng lợi nhuận nông nghiệp.

- Cải thiện môi trờng.

Ngày nay, các nhà khoa học đang hớng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ 2 có đặc điểm tăng giá trị dinh dỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:

- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt.- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột.- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây.

- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng.- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [7].

1.1.2 Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc

Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 11 triệu ha năm 1997, 27,8 triệu ha năm 1998, 39,9 triệu ha năm 1999 và tới hơn 44 triệu ha năm 2000 Các quốc gia trồng cây chuyển gen gồm có Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, urugoay và Mỹ Hiện nay, những sản phẩm lơng thực, thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trờng

Các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật tập trung vào một số hớng nh:

- Chịu chất diệt cỏ

Ngời ta dùng gen tổng hợp EPSP chuyển vào cây trồng để chịu đợc Glyphosphat Nhiều loài thực vật đã biến nạp và đang đợc thử nghiệm nh củ cải đờng, đậu tơng, nho cải hạt dầu, bông, cà chua và thuốc lá

Cây đậu tơng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ khống chế cỏ dại tốt hơn, góp phần nâng cao hiệu quả của các trang trại nhờ tối u hoá năng suất và sử dụng hiệu quả đất trồng trọt, tiết kiệm thời gian cho nông dân Giống mới này hoàn toàn giống các giống đậu tơng khác về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức chế biến thành thực phẩm và thức ăn gia súc Đợc trồng nhiều ở Achentina, úc, Braxin, Canada, EU, Nhật bản, Hàn Quốc, Mexico, Nga, Thụy Điển, Mỹ và uruguay

Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ đợc trồng tại úc, Canada và Mỹ.

- Kháng bệnh virus

Ngời ta đang nghiên cứu các gen kháng bệnh virus ở thực vật Ngoài ra đang nghiên cứu khả năng kháng virus bằng biến nạp gen từ động vật.

Đu đủ đợc chuyển gen của virus mã hoá cho protein vỏ của virus đốm

vòng Protein này tạo cho cây khả năng tự bảo vệ chống lại bệnh đốm vòng Một gen từ nguồn bệnh đã đợc sử dụng để kháng lại chính nó

Cây khoai tây đã đợc chuyển gen giúp kháng virus gây xoăn lá, cây bí chuyển gen giúp kháng virus gây bệnh

- Kháng các loài gây hại

Chuyển gen độc tố từ Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo giống chịu côn

trùng có hại Cây bông chuyển gen Bt kháng sâu đục quả và ăn lá, đợc trồng phổ biến ở nhiều nớc nh Trung quốc, Nam phi, Achentina, Các cây bông, lúa mang gen chuyển này có khả năng chống chịu sâu đục thân rất tốt.

- Chống chịu các bệnh nấm

Ngời ta đang phân lập gen 1,3-glucanase (mã hóa enzym phân hủy thành tế bào của các mầm bệnh nấm) từ thực vật kháng bệnh để chuyển vào các loài cây mẫn cảm.

- Thay đổi thành các axit béo

Ngời ta làm tăng hàm lợng axit béo đơn không no và các thành phần dầu thực vật Cây đậu tơng chuyển gen axit oleic có hàm lợng axit oleic cao, một axit béo có một liên kết không no Theo các nhà dinh dỡng thì chất béo không no đợc xem là tốt hơn so với chất béo no, đợc tìm thấy ở thịt bò, lợn, phomat và một số thức ăn thờng ngày khác.

Cải dầu chuyển gen có hàm lợng Laurate cao, đợc dùng trong công nghiệp thực phẩm để làm lớp phủ ngoài kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ, đợc trồng ở Canada và Mỹ Cải dầu có hàm lợng axit oleic cao đợc trồng ở Canada.

- Làm chậm chín quả ở cà chua

Cây cà chua mang một gen chuyển làm chậm quá trình làm mềm quả tự nhiên khi quả chín Đây là loại thực phẩm chuyển gen đầu tiê n đợc sản xuất ở các nớc phát triển Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn

Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:

- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm.

- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo, [7].

ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã đợc thực hiện Đó là:

- Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi

khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu tryptopha.

- Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp bằng súng bắn gen Đến nay, nhiều dòng lúa

chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ chuyển gen chín chậm và kháng virus đốm vòng đã đợc tạo ra Các dòng cây chuyển gen này sẽ đợc đa vào phân tích phân tử

- Chuẩn bị thiết bị để tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ việc

đánh giá theo dõi cây chuyển gen nh PCR, lai Southern, RFLP, AFPD Nh vậy, có thể tiến hành chuyển gen và đa kỹ thuật này vào công việc tạo giống cây trồng ở Việt Nam [1].

1.2 Các kỹ thuật Phân tích phân tử ADN cây chuyển gen

Cùng với các phân tích và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các cây chuyển gen nh các chỉ tiêu hoá sinh, nông sinh, mức độ kháng sâu bệnh, chống chịu các điều kiện ngoại cảnh v.v., phân tích gen chuyển ở mức phân tử cũng đợc tiến hành song song bằng nhiều kỹ thuật khác nhau nh PCR, lai

Southern, Western blost Chúng tôi xin giới thiệu hai kỹ thuật cơ bản và quan trọng để phân tích phân tử cây chuyển gen là PCR và lai Southern.

1.2.1 Kỹ thuật PCR

Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Thực chất đây là một ph-ơng pháp tạo dòng ADN invitro không cần có sự hiện diện của tế bào [5], [6].

1.2.1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR

Tất cả các ADN polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những đoạn mồi Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ xung với một đầu của mạch khuôn từ đó ADN polymeraza sẽ gắn các dNTP tự do để nối dài đoạn mồi, hình thành mạch mới Do đó, nếu ta cung cấp hai đoạn mồi đặchiệu bắt cặp bổ xung với 2 đầu của một trình tự ADN (mồi xuôi và mồi ngợc) ta sẽ tổng hợp đoạn ADN nằm giữa 2 mồi đó [5], [9].

1.2.1.2 Thành phần phản ứng PCR:

Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm ADN khuôn tức là đoạn trình tự ADN cần đợc nhân lên; 2 đoạn mồi, mỗi mồi dài 18-24 nucleotid; ADN polymeraza (thờng hiện nay sử dụng là Taq polymeraza - là một loại enzym chịu nhiệt); bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) và dung dịch đệm và ion Mg2+ [12].

Phản ứng PCR tối u khi ADN khuôn tinh sạch, nhng một u điểm lớn của phơng pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu ADN không đợc bảo quản tốt, đã bị phá huỷ từng phần nh những vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay của ngời đã chết

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự khuyếch đại một đoạn ADN đặc trng Mồi luôn gắn với ADN khuôn ở đầu 3’ và ADN Polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp theo chiều 5’ → 3’ [5] Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR Việc chọn mồi cũng phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:

-Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngợc”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi.

-Tm của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt nhau một cách quá xa.Công thức nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:

Tm=81,5 + 16,6(log10[J+] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA) Trong đó [J+] : Nồng độ các cation hoá trị 1

FA : Chất dùng gây biến tính ADNI : Chiều dài mồi

-Các mồi chọn phải đặc trng cho trình tự ADN cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.

-Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn Phản ứng PCR sẽ tối u nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb [5], [12].

Trớc đây trong phản ứng PCR ngời ta thờng dùng ADN polymeraza I tách chiết từ E coli và ADN polymeraza của Phage T4 Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân huỷ) Việc phát hiện ra các ADN polymeraza chịu nhiệt nh Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza, đã cho phép quá trình nhân bản đợc thực hiện một cách tự động hoá Thông dụng nhất là Taq Polymerse đợc tách ra từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus sống ở suối nớc nóng 94-1000C Enzym này có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 70-800C, có trọng lợng phân tử là 94kD, gồm 832 axit amin do gen có 2499 cặp bazơ tổng hợp nên [28]

Năm 1988, Saiki đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau 130 phút ở nhiệt độ 92,50C, sau 40 phút ở 950C và sau 5-6 phút ở 970C Mặt khác, nồng độ ion Mg2+ và d NTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hởng rất nhiều đến hoạt tính của Taq polymeraza [14], [28].

Ngày nay, nhiều enzym polymeraza chịu nhiệt khác đã đợc đa ra thị ờng với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth pal là một enzyme tách từ Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một enzyme

tr-phiên mã ngợc khi có mặt của ARN khuôn và Mg2+ , mặt khác Tth pal lại xúc tác phản ứng khuyếch đại ADN nếu trong môi trờng có ADN khuôn và Mg2+.

Bốn loại nucleotit thờng đợc sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 àM/mỗi loại nucleotit, nếu sự mất cân băng trong thành phần các nucleotit xẩy ra sẽ dẫn tới các lỗi sao chép của ADN polymeraza.

Nồng độ ion Mg2+ cũng là nhân tố ảnh hởng mạnh đến phản ứng PCR Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối u phải đ-ợc xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm.

Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vợt quá 40 chu kỳ Sở dĩ nh vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn Trong giai đoạn đầu số lợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lợng mẫu ban đầu Sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm do các nguyên nhân sau:

- Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao

-Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài Nhiệt độ tăng lên 72 0C Đó là điều kiện để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ xung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây [14].

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn nh trên, một phân tử ADN khuôn đợc nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa đợc nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi Do đó sau mỗi chu kỳ số lợng đoạn ADN đợc tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và nh vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu [6].

1.2.1.4 ứng dụng của kỹ thuật PCR

PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích bộ genom của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lợng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, nh việc xác định trình tự của ADN đợc nhân bản, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể Hiền nay PCR đợc xem là một phơng pháp nhanh và tơng đối đơn giản để phân tích sơ bộ cây chuyển gen [1].

1.2.2 Kỹ thuật lai Southern và ứng dụng

1.2.2.1 Nguyên lý của lai Southern

Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) nói chung và lai Southern nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) đợc lu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trng Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lu giữ nh màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhng vẫn duy trì đợc khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác [1].

Đối với ADN, phơng pháp này đợc Edwind M Southern xây dựng và thử nghiệm thành công vào năm 1975 ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn ADN bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau Các bớc tiến hành trong kỹ thuật này có thể đợc tóm tắt nh sau:

-ADN bộ gen đợc cắt thành những đoạn có kích thớc khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và đợc phân tách bằng điện di trên bản gel.

-ADN đợc biến tính ngay trên bản gel rồi đợc thấm truyền lên màng lai Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn ADN trên màng lai đợc giữ nguyên nh trên bản gel.

-ADN cố định trên màng đợc đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hoá học Sau quá trình lai ngời ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.

-Cuối cùng ngời ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang.

Kỹ thuật này đợc gọi là kỹ thuật phân tích màng thấm chuyển Southern

(Southern blot analysis), gọi tắt là lai Southern [1], [5].

Khi ứng dụng lai Southern đối với các ARN, kỹ thuật này đợc đặt tên là lai Northern Bớc phát hiện các băng ARN đợc tiến hành thông qua lai với

mẫu ADN hoặc ARN đánh dấu Còn khi tiến hành kỹ thuật này với protein thì gọi là lai Western để phát hiện các băng protien bằng kháng thể đánh dấu Tới

nay đã có nhiều phơng pháp cải tiến, hình thành nhiều kỹ thuật phối hợp nh

Southwestern, phát hiện băng protein bằng ADN đánh dấu hoặc Western xa,

dùng mẫu protein không phải kháng thể (non-antibody) [5].

Về nguyên tắc, kỹ thuật thấm chuyển không thay đổi nhiều từ khi đợc phát minh, nhng chủng loại các màng và kỹ thuật phát hiện các loại đại phân tử thông qua lai đánh dấu hay miễn dịch đánh dấu kèm với các bộ kit luôn đợc cải tiến cho tiện lợi và an toàn Màng nitrocellulose đợc dùng rất nhiều, nhng gần đây trong hai loại màng nylon trung tính và màng tích điện thì loại màng sau do tích điện nên có sức gắn ADN cao hơn Đơng nhiên trong kỹ thuật Western, chất liệu nitrocellulose vẫn đang đợc sử dụng rộng rãi, ngoài ra còn có màng polyvinylidene diflouride (PVDF) và màng nylon [6].

Việc phát hiện các phân tử trên màng đợc tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu Trong nhiều năm kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã đợc ứng dụng một cách rộng rãi, phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP Ưu điểm lớn của phơng pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện đợc vết ADN ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn Tuy nhiên phơng pháp đánh dấu phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo

đảm an toàn phóng xạ đồng bộ Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang từng bớc thay thế kỹ thuật phóng xạ Trong đó nổi bật là kỹ thuật phát quang hoá học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) và kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG) [1].

1.2.2.2 Hệ thống phi phóng xạ DIG

Hệ thống phi phóng xạ DIG là phơng pháp đánh dấu và phát hiện axít nucleic rất nhạy và hữu hiệu Hệ thống này mang nhiều tính u việt nh an toàn, mẫu dò đánh dấu có độ bền cao và dung dịch lai có thể dùng lại vài lần So với phơng pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ, phơng pháp này cũng có thuận lợi nh độ nhạy cao và phông nền sạch Nhng lại tránh đợc những bất lợi nh sự rủi ro trong khi sử dụng chất phóng xạ, chất thải độc hại, thời gian hiện phim lâu, tính không bền của mẫu dò đã đánh dấu

Hình 1: Cấu trúc của Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP

Trong hệ thống DIG, mẫu dò là ADN, ARN đợc đánh dấu bằng cách gắn với digoxigenin (DIG) Đối với mẫu dò là ADN, yếu tố DIG-11-dUTP đợc dùng để đánh dấu và đợc gắn kết với phân tử ADN thông qua phản ứng PCR hay lai với các đoạn nucleotit ngẫu nhiên (hình 1).

ở phơng pháp thứ nhất (hình 2a), với DIG-dUTP có trong hỗn hợp phản ứng PCR, sản phẩm mẫu dò đợc tạo ra rất đặc hiệu và có độ nhạy cao Chỉ cần 10 pg đối với ADN plasmit hoặc 10 ng đối với ADN genom là đủ để tạo ra mẫu dò lai Southern Phơng pháp đánh dấu ADN bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm genom hay ARN thông tin hiếm trên màng thấm Northern

+ Taq ADN polymeraza + Mồi

+ Klenow

Trong phơng pháp thứ hai (hình 2b), enzym Klenow sao chép khuôn mẫu ADN với sự có mặt của các đoạn mồi 6 nucleotit ngẫu nhiên, các nucleotit tự do trong đó có DIG-dUTP Trung bình cứ 20-25 nucleotit trên mạch ADN mới tổng hợp có một phân tử DIG gắn vào Nh vậy, mẫu dò tạo ra đợc đánh dấu đồng đều, rất nhạy, có thể dò tìm đích trong 0.10-0.03 pg ADN Sản phẩm mẫu dò là tổ hợp của các đoạn có độ dài khác nhau Không giống nh đáng dấu bằng PCR, phơng pháp này đỏi hỏi phải có khuôn mẫu ADN rất sạch.

Tín hiệu từ mẫu dò sau khi đã lai với axit nucleic trên màng đợc phát hiện nhờ kỹ thuật hoá miễn dịch Đó là phản ứng liên kết giữa kháng thể của Digoxigenin và Digoxigenin gắn trong mẫu dò Tiếp theo, các phân tử liên kết này đợc nhìn thấy nhờ vào phản ứng với hợp chất tạo sắc hoặc phát quang Các hợp chất tạo sắc tạo ra tín hiệu mầu trực tiếp trên màng Còn các hợp chất phát quang có độ nhạy cao thì sản sinh ra ánh sáng rằng có thể ghi nhận lại trên phim X-quang giống nh ở phơng pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ 32P hay 35S [16]

a b

Hình 2: Các phơng pháp đánh dẫu của DIG: a: Đánh dấu bằng PCR,

b: Đánh dấu bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên và DIG

1.2.2.3 ứng dụng của kỹ thuật lai Southern

Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử rất quan trọng và đợc sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử nh:

- Lập bản đồ giới hạn của một gen

- Phát hiện các đa hình độ dài (fragment polymorphism) của cùng một gen ở các chủng khác hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn giữa chúng

- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn

- Phát hiện sinh vật chuyển gen, đánh giá số lợng bản gen và điểm gắn của gen chuyển

Trong bản luận văn này chúng tôi đi sâu vào các chi tiết tiến hành và kết quả phân tích phân tử các dòng cây bông chuyển gen thông qua kỹ thuật lai Southern bằng hệ thống DIG [1].

1.3 nghiên cứu cải tạo cây bông ở Việt Nam

1.3.1 Sự phát triển trong sản xuất và nghiên cứu cải tạo các giống bông ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, sản xuất bông ở Việt Nam không ngừng tăng trởng về diện tích, năng suất và sản lợng Đặc biệt, trong vụ trồng bông 2001/2002, diện tích đạt xấp xỉ 30.000 ha, cao nhất từ trớc đến nay, tăng hơn 20% so với năm 2000 và gấp 3 lần so với các năm từ 1990 đến 1996 Đồng thời sản lợng đạt trên 10.000 tấn xơ, gấp 5 lần so với các năm từ 1990 đến 1996.

Có thể khẳng định sự tăng trởng không ngừng về mọi mặt của ngành bông ở nớc ta trong thời gian qua có sự đóng góp quan trọng của công tác nghiên cứu khoa học, tạo điều kiện cho sản xuất bông thực sự đem lại hiệu quả kinh tế cao và đủ sức cạnh tranh với các cây trồng khác trong hệ thống nông nghiệp nớc ta.

Trong các thành tựu của công tác nghiên cứu cây bông có thể kể đến việc xây dựng đợc ngân hàng gen cây bông gồm hơn 1.800 mẫu giống, lu giữ và cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu phong phú cho công tác giống.

Nhiều dòng, giống bông thuần đã đợc tạo ra để làm bố mẹ cho sản xuất hạt giống lai Nổi bật là từ năm 1995, đã lai tạo và đa vào sản xuất thành công 3 giống lai đơn F1 (L18, VN20 và VN35) Các giống này đều có u thế lai cao và ổn định, chống chịu đợc sâu bệnh hại và ngoại cảnh bất lợi, chất lợng xơ đạt

yêu cầu công nghiệp dệt, góp phần tạo nên bớc nhảy vọt về diện tích, năng suất và sản lợng

Quy trình sản xuất hạt giống lai đợc xây dựng hoàn thiện cho năng suất hạt cao (1,5 tấn hạt/ha) với chất lợng đảm bảo và giá thành sản xuất hạ chỉ bằng một nửa so với giá nhập từ nớc ngoài.

Nghiên cứu sử dụng tính bất dục đực cho thành công bớc đầu rất khả quan góp phần giảm đáng kể chi phí sản xuất từ 20% đến 30% tạo điều kiện tăng năng lực sản xuất hạt giống với giá thành hạ [3].

1.3.2 Nghiên cứu cây bông chuyển gen kháng sâu hại

Cây bông chuyển gen kháng sâu (bông Bt) chứa một protein do gen

CryIA qui định có nguồn gốc từ vi sinh vật đất tự nhiên là Bacillus thuringiensis (Bt) Protein Bt đem lại cho cây bông khả năng kháng sâu ổn

định Do tính kháng sâu cao, protein Bt đã đợc sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học an toàn trong hơn 40 năm qua Do vậy, đối với cây bông chuyển gen Bt thì nhu cầu sử dụng thuốc trừ sâu để diệt những sâu bệnh này sẽ đợc hạn chế hay giảm tối đa Ngoài ra, cây bông Bt cũng làm giảm sự nhiễm độc do nấm trên những vết thơng hở gây nên

Với những lợi ích thực tiễn, cây bông Bt đã nhanh chóng đợc sử dụng và mang lại lợi ích to lớn ở nhiều nớc trên thế giới Tại Trung Quốc, trồng bông Bt đã làm tăng gấp đôi thu nhập so với việc trồng cây bông thờng Những nông dân trồng những giống bông này giảm đợc 20-23% chi phí sản xuất so với những giống bông không phải là cây bông Bt Sử dụng bông Bt cũng làm giảm lợng thuốc trừ sâu khoảng 47 kg/ha.

ở Nam Phi, diện tích trồng bông khoảng trên 80.000 ha và hàng năm bị thiệt hại đáng kể do sâu bệnh gây nên Từ năm 1997, ngày càng nhiều nông dân lựa chọn việc trồng bông Bt do lợi ích nh tăng năng suất và giảm lợng thuốc trừ sâu Năm 1998-1999, diện tích trồng bông Bt là 200 ha, năm 1999-2000 lên tới 789 ha và năm 2000-2001 là 1250 ha

Việc trồng bông Bt ở Achentina cũng đem lại những lợi ích tơng tự cho những ngời nông dân địa phơng Trong mùa 1999-2000, lợi nhuận tăng

tới 65,05 đô la/ha Điều này có đợc là do tăng sản lợng, cải thiện chất lợng và tiết kiệm đợc chi phí sử dụng thuốc trừ sâu.

Các nghiên cứu thực địa ở châu á đều khẳng định những lợi ích của trồng bông Bt Chẳng hạn, ở Inđônêxia, giống bông Bt u việt hơn các giống bông địa phơng ở tất cả 15 địa điểm đợc kiểm tra và hiên nay đang đợc trồng rộng rãi ở Nam Sulawesi Ngoài ra các nghiên cứu ở ấn Độ, Philipin cũng cho những kết quả tơng tự [7].

Từ những kinh nghiệm về bông Bt ở Trung Quốc, Nam Phi và Achentina, những năm gần đây, ở Việt Nam, các cán bộ ngành bông đã chú trọng thu thập, trao đổi các nguồn giống kháng đợc một số loại sâu hại chính ở trong nớc Tất cả các dòng bông này đều thuộc loài bông luồi (Gosipium hirsutum L.) là

loài bông trồng trọt chính tại Việt Nam Các dòng này đợc đánh giá là kháng ợc sâu xanh (Helicoverpa armigera) và sâu hồng (Spodoptera gossypiella), hai

đ-loại sâu hại bông nguy hiểm nhất ở trong nớc

Trên cơ sở nguồn vật liệu ban đầu nh trên, các cán bộ khoa học đã tiến hành lai những dòng bông kháng sâu với giống trong nớc và đã chọn lọc ra đợc một số dòng có biểu hiện kháng sâu hồng và sâu xanh ở ngoài đồng ruộng Gần đây đã đa vào sản xuất thử nghiệm các dòng bông lai kháng sâu của Việt Nam nh VN15, VN01-4, VN01-2 trong điều kiện mật độ sâu cao vẫn cho năng suất cao hơn các giống lai F1 thế hệ trớc Chúng có thể trồng đợc ở các vụ, vùng có áp lực sâu lớn [2].

Để phân tích các dòng bông kháng sâu ở mức độ phân tử, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR và lai Southern kiểm tra sự có mặt của gen CryIA và đánh giá số lợng các điểm gắn kết và bản gen chuyển trong các dòng bông này Qua đó, có thể tìm hiểu mối liên quan giữa số lợng các bản gen chuyển nếu có và mức kháng sâu của cây bông Kết quả của những thực nghiệm này có ý nghĩa to lớn trong việc hoàn thiện quy trình lai Southern và nắm vững các thao tác kỹ thuật Đây là bớc đầu trong quá trình phân tích hàng loạt các dòng chuyển gen khác nhau mà phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện Công nghệ Sinh học đã tạo ra trong thời gian qua và trong tơng lai

I Dụng cụ tách chiết ADN:

- Cối, chày sứ (nếu không có dùng chén và đũa thủy tinh): số lợng bằng hoặc hơn lợng mẫu cần tách ADN.

- H20: nớc cất khử trùng 2 lần và đã đợc loại ion (deion) Cần 500ml dùng dần.

- ống effpendox khử trùng 1.5ml- giấy thấm khử trùng

II Quy trình tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số đợc tách từ lá mầm hay lá non của cây bông trởng thành PCR và lai Southern là hai kỹ thuật đợc sử dụng để tiến hành phân tích phân tử gen chuyển CryIA ở các cây bông kháng sâu Các hoá chất, dung dịch cần

chuẩn bị, thiết bị sử dụng và quy trình tiến hành các thí nghiệm liên quan đợc nêu chi tiết ở dới đây.

2.2.1 Tách chiết ADN từ lá bông 2.2.1.1 Hoá chất, dung dịch và thiết bị

Hoá chất: Tris-HCl; NaCl; EDTA-Na2; Sorbitol; CTAB; Sodium bisulfite (NaH2PO4); Chloroform; Isomylalcohol; Isopropanol ; Ethanol; ARN-ase và n-ớc cất hai lần khử ion.

Các dung dịch mẹ: 1M Tris-HCl, pH 8.0; 5M NaCl; 0,5 EDTA-Na2; Sorbitol 2M; Chloroform isomylalcohol (CIA 24:1); Isopropanol lạnh (-20oC); Ethanol 70%; TE ( 10 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, pH 8,0).

Các dung dịch tách chiết ADN: bao gồm dung dịch đệm rửa và đệm

chiết có các thành phần và nồng độ đợc nêu ở bảng 2 và 3.Bảng 2: Dung dịch đệm rửa

Thiết bị: Nồi ổn nhiệt; máy ly tâm (Sigma), máy điện di (Biorad); máy

soi gel (Gel Doc-Pharmacia), máy chụp ảnh (Poloriod).

2.2.1.2 Quy trình tách chiết ADN

Thu lá và bảo quản lá bông

Những hạt bông chắc, đều đợc đặt trong cốc nhựa có lót giấy thấm Tới nớc ấm khoảng 60oC và để trong tủ ấm ở 37oC hai ngày Sau đó chuyển ra ngoài, tới ẩm hàng ngày

Khi mầm cây đợc hai ngày tuổi thì thu lá mầm để tách ADN, nếu không tách ADN ngay thì làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu (-84oC) Cây mầm có thể đa ra trồng trong nhà lới để thu lá non của cây trởng để tách ADN Trung bình 200-300 mg (2lá) cho thu hoạch 5-7 à ADN tổng số.

Tách ADN tổng số từ lá bông

Quy trình tách chiết ADN tổng số thực hiện theo phơng pháp Haiwen và CS (2001) Chúng tôi lợc bỏ bớc bổ xung sarcosine ở bớc 2.- Đặt mẫu lá trong ống eppendorf 2 ml, đổ nitơ lỏng và nghiền nhanh, kỹ

bằng đũa thuỷ tinh.

- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, vortex trong 40 giây.

- Ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi Có thể lặp lại bớc 2 và 3.

- Bổ sung 200 àl đệm rửa, vortex trong khoảng 40-60 giây, sau đó bổ sung thêm 2-4àl RNase (nồng độ 10mg/ml).

- Bổ sung 800 àl đệm chiết, đảo ngợc ống eppendorf khoảng 20-40 lần.- ủ ở 65 0C trong 30-45 phút.

- Bổ sung 600 àl CIA và lắc mạnh trong 15-20 phút cho đến khi dung dịch chuyển sang mầu sữa.

- Ly tâm 12.000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút, nhẹ nhàng hút và chuyển dịch chiết nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới Có thể lặp lại các bớc 8 và 9 nếu dịch chiết không trong.

- Bổ sung 700 àl Isopropanol lạnh, giữ dịch chiết ở -200C trong 30 phút có thể để qua đêm.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút.- Rửa cặn ADN trong Ethanol 70%.

- Làm khô và hoà tan cặn ADN bằng 50 đến 100 àl TE hoặc nớc khử ion.

Xác định hàm lợng và độ sạch của ADN bằng đo quang phổ

Hàm lợng và độ sạch của ADN đợc xác định bằng đo quang phổ mẫu ADN pha loãng 200 lần (995 àl nớc + 5 àl ADN) ở bớc sóng 260 nm và 280 nm theo các công thức dới đây:

Nếu độ sạch nằm trong khoảng từ 1,8-2,0 thì mẫu đợc coi là sạch.

Xác định hàm lợng và chất lợng ADN bằng điện di trên gel agarose