Ứng dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen Bt kháng sâu hại

Nghiên cứu cây bông chuyển gen kháng sâu hại

Cây bông chuyển gen kháng sâu (bông Bt) chứa một protein do gen CryIA qui định có nguồn gốc từ vi sinh vật đất tự nhiên là Bacillus thuringiensis (Bt). Với những lợi ích thực tiễn, cây bông Bt đã nhanh chóng đợc sử dụng và mang lại lợi ích to lớn ở nhiều nớc trên thế giới. Những nông dân trồng những giống bông này giảm đợc 20-23% chi phí sản xuất so với những giống bông không phải là cây bông Bt.

Từ năm 1997, ngày càng nhiều nông dân lựa chọn việc trồng bông Bt do lợi ích nh tăng năng suất và giảm lợng thuốc trừ sâu. Chẳng hạn, ở Inđônêxia, giống bông Bt u việt hơn các giống bông địa phơng ở tất cả 15 địa điểm đợc kiểm tra và hiên nay đang đợc trồng rộng rãi ở Nam Sulawesi. Từ những kinh nghiệm về bông Bt ở Trung Quốc, Nam Phi và Achentina, những năm gần đây, ở Việt Nam, các cán bộ ngành bông đã chú trọng thu thập, trao đổi các nguồn giống kháng đợc một số loại sâu hại chính ở trong nớc.

Tất cả các dòng bông này đều thuộc loài bông luồi (Gosipium hirsutum L.) là loài bông trồng trọt chính tại Việt Nam. Các dòng này đợc đánh giá là kháng đ- ợc sâu xanh (Helicoverpa armigera) và sâu hồng (Spodoptera gossypiella), hai loại sâu hại bông nguy hiểm nhất ở trong nớc. Trên cơ sở nguồn vật liệu ban đầu nh trên, các cán bộ khoa học đã tiến hành lai những dòng bông kháng sâu với giống trong nớc và đã chọn lọc ra đợc một số dòng có biểu hiện kháng sâu hồng và sâu xanh ở ngoài đồng ruộng.

Gần đây đã đa vào sản xuất thử nghiệm các dòng bông lai kháng sâu của Việt Nam nh VN15, VN01-4, VN01-2 trong điều kiện mật độ sâu cao vẫn cho năng suất cao hơn các giống lai F1 thế hệ trớc. Để phân tích các dòng bông kháng sâu ở mức độ phân tử, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR và lai Southern kiểm tra sự có mặt của gen CryIA và đánh giá số lợng các. Kết quả của những thực nghiệm này có ý nghĩa to lớn trong việc hoàn thiện quy trình lai Southern và nắm vững các thao tác kỹ thuật.

Đây là bớc đầu trong quá trình phân tích hàng loạt các dòng chuyển gen khác nhau mà phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện Công nghệ Sinh học đã tạo ra trong thời gian qua và trong tơng lai. PCR và lai Southern là hai kỹ thuật đợc sử dụng để tiến hành phân tích phân tử gen chuyển CryIA ở các cây bông kháng sâu. Các hoá chất, dung dịch cần chuẩn bị, thiết bị sử dụng và quy trình tiến hành các thí nghiệm liên quan đợc nêu chi tiết ở dới đây.

Tách chiết ADN từ lá bông 1. Hoá chất, dung dịch và thiết bị

- Cối, chày sứ (nếu không có dùng chén và đũa thủy tinh): số lợng bằng hoặc hơn lợng mẫu cần tách ADN. ADN tổng số đợc tách từ lá mầm hay lá non của cây bông trởng thành. Thiết bị: Nồi ổn nhiệt; máy ly tâm (Sigma), máy điện di (Biorad); máy soi gel (Gel Doc-Pharmacia), máy chụp ảnh (Poloriod).

Khi mầm cây đợc hai ngày tuổi thì thu lá mầm để tách ADN, nếu không tách ADN ngay thì làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu (-84oC). Cây mầm có thể đa ra trồng trong nhà lới để thu lá non của cây trởng để tách ADN. Quy trình tách chiết ADN tổng số thực hiện theo phơng pháp Haiwen và CS (2001).

- Đặt mẫu lá trong ống eppendorf 2 ml, đổ nitơ lỏng và nghiền nhanh, kỹ bằng đũa thuỷ tinh. Hàm lợng ADN có thể đợc xác định chính xác bằng chạy điện di trên gel agarose 0,6% khi so sánh với một lợng ADN đã đợc xác định trên cùng một bản gel. Trên bản gel ta còn xác định đợc độ sạch của ADN nh sạch ARN, không chứa các chất cao phân tử khác và không bị gẫy.

Phản ứng PCR nhân gen CryIA

Thiết bị: Máy PCR (Gene Amp* PCR System 9700 - Appied Biosystems); máy điện di (Biorad); máy soi gel (Gel Doc-Pharmacia), máy chụp ảnh (Poloriod).

Kü thuËt lai Southern

- Thấm ớt 3 lớp giấy thấm trong bể thấm chuyển, đặt lên vật đỡ là tấm kính hay một vật cứng khác tạo thành cầu giấy có chiều dài đủ ngập trong dung dịch và rộng khít với chiều rộng của bản gel. Việc dò định vị các điểm lai giữa mẫu dò và ADN genom đợc tiến hành dựa trên cơ sở phản ứng liên hợp phosphatase kiềm giữa kháng thể của DIG và chất nền phát quang. Để thực hiện đợc các phân tích phân tử cây bông kháng sâu bằng kỹ thuật PCR và lai Southern, ADN tách chiết phải đảm bảo độ tinh sạch và hàm lợng cao.

Kết quả kiểm tra ADN cho thấy các mẫu ADN thu đợc đều có chất lợng tốt và nồng độ cao, đủ điều kiện để tiến hành các công việc nghiên cứu tiếp theo. Nồng độ ADN xác định trên bản gel điện di thấp hơn so với nồng độ tính theo độ hấp phụ quang phổ đợc giải thích do lợng ARN còn cao trong các mẫu ADN. Khi áp dụng cặp mồi này vào phản ứng PCR đối với các dòng bông kháng sâu, chúng tôi nhận đợc sản phẩm PCR với độ lớn nêu trên, dòngnh sản phẩm nhân đợc từ mẫu đối chứng là plasmit mang gen CryIA(c) hay CryIA(b).

Kết quả PCR nhân gen CryIA ở các dòng bông kháng sâu trong hình 6a và 6b chỉ ra rằng các cây chuyển gen này mang từ một đến hơn một bản gen CryIA. Điều này có thể đợc giả thích bởi quá trình đóng mở của các sợi chromatin trong các mạch ADN của các dòng bông kháng sâu làm cản trở quá trình bắt cặp mồi nhân gen CryIA, trong khi ở đối chứng dơng, CryIA nằm trong plasmit có độ dài chỉ 11.5 kb, nên quá trình tháo xoắn ADN xảy ra dễ dàng và nhanh hơn, gây thuận lợi cho PCR. Dùng lợng ADN khuôn mẫu ít và đánh dấu trong thời gian dài cho chúng ta thu đợc dung dịch mẫu dò có thành phần đợc đánh dấu là chủ yếu, giảm bớt các phân tử ADN cha đợc đánh dấu, tối u quá trình lai của các đoạn dò mang DIG đánh dấu.

Khi dùng enzym hạn chế để cắt genom thành các đoạn ngắn, ta phải bảo đảm enzym đó không cắt vụn, làm loại mất gen định dò tìm ra khỏi các đoạn ADN có thể. Vì vậy, trớc khi thực nghiệm cắt ADN genom bằng enzym hạn chế để tiến hành lai Southern, chúng tôi nghiên cứu bản đồ enzym cắt hạn chế của gen CryIA(b) và CryIA(c). Trong thực nghiệm thấm chuyển ADN lên màng lai, chúng tôi dùng loại giấy lọc có sẵn trong phòng thí nghiệm để làm cầu dẫn dung dịch chuyển, mà không dùng đúng chủng loại Whatman nh quy trình chuẩn khuyên dùng.

Trong điều kiện này, quá trình thấm chuyển chậm lại, sau 10-12 giờ độ dài thấm ớt của tầng giấy thấm là 6-7 cm, đợc coi là bình thờng theo kinh nghiệm. Các công bố về kết quả phân tích gen chuyển bằng lai Southern ở cây lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch chỉ ra rằng số lợng điểm gắn của gen chuyển thay đổi phụ thuộc vào kỹ thuật đã áp dụng khi chuyển gen [15], [26]. Trong thí nghiệm của chúng tôi, để tăng tính đặc hiệu quá trình lai giữa mẫu dò gen CryIA và genom bông chuyển gen, chúng tôi tiến hành lai ở nhiệt độ cao là 67 0C.

Khi tăng nồng độ mẫu dò lên tối đa là 50 ng/ml dung dịch lai trong thí nghiệm lần thứ 2, đã thu đợc các băng lai ở 4/12 dòng trên màng lai, trong đó một dòng mang gen chuyển ở hai điểm khác nhau, số còn lại có gen chuyển ở một điểm (hình 12). Chọn HindIII làm enzym cắt ADN genom bông; ADN phân giải đều trên bản gel điện di và đợc thấm chuyển hoàn toàn lên màng lai nylon; đánh dấu mẫu dò bằng hệ thống phi phóng xạ DIG và thu đợc kết quả ở 5 dòng, trong đó 1 dòng mang 2 điểm gắn gen, số còn lại mang 1 điểm gắn.