- Chạy điện di ADN cắt giới hạn trên gel agarose 0,8%, điện thế 4050V, 1214 giờ.
3.3.Kết quả phân tích các dòng bông kháng sâu bằng lai Southern
3.3.1. Chuẩn bị mẫu dò
Mẫu dò trong thực nghiệm lai Southern phân tích cây bông kháng sâu là gen CryIA. Chúng tôi dùng sản phẩm PCR nhân gen này từ plasmit
p2300 mang gen CryIA(b). Plasmit p2300 có bản đồ phân tử đợc nêu ở hình 7.
Để chuẩn bị mẫu dò, bớc đầu tiên chúng tôi phải nhân dòng tế bào E.coli mang plasmit p2300 và bớc tiếp theo là tách ADN plasmit. Kết quả tách chiết ADN plasmit đạt yêu cầu, khi điện di trên gel agarose 0,8% ta thấy plasmit tách thành những băng khác nhau đặc trng cho các dạng khác nhau của plasmit đó là: dạng dãn vòng, dạng soắn và dạng siêu soắn (hình 8a). Sản phẩm PCR nhân gen CryIA bằng cặp mồi T1 và T2 có độ dài 1,1 kb (hình 8b), đợc làm sạch, xác định nồng độ và sử dụng để đánh dấu với DIG.
Hình 7: Bản đồ phân tử của plasmit p2300-CryIA(b)
Kanamycin(R) p2300-CryIA(b) 11.5Kb Kpn I Hind III T-Border(L) T-Border(R) Sac I Xba I CryIA(b) Nos ter 35S promoter Kanamycin(R) 35S Promoter
a b
Hình 8: Chuẩn bị mẫu dò. a. ADN plasmit mang gen CryIA(b) đuợc tách từ các dòng tế bào E.coli; b. Sản phẩm PCR nhân gen CryIA
Chúng tôi dùng 30 ng CryIA để đa vào phản ứng lai với hỗn hợp các đoạn mồi 6 nucleotit ngẫu nhiên và DIG-UTP trong thời gian dài tối đa cho phép là 20 giờ. Dùng lợng ADN khuôn mẫu ít và đánh dấu trong thời gian dài cho chúng ta thu đợc dung dịch mẫu dò có thành phần đợc đánh dấu là chủ yếu, giảm bớt các phân tử ADN cha đợc đánh dấu, tối u quá trình lai của các đoạn dò mang DIG đánh dấu. Sau 20 giờ lợng ADN đánh dấu là 1050 ng trong 20 àl, nồng độ 52 ng/àl [16].