- Chạy điện di ADN cắt giới hạn trên gel agarose 0,8%, điện thế 4050V, 1214 giờ.
3.2.Phân tích các dòng bông kháng sâu bằng kỹ thuật PCR
Các dòng bông kháng sâu đợc đa vào phân tích phân tử do viện Nghiên cứu Cây bông và Cây có sợi cung cấp. Đây là các dòng bông kháng sâu có nguồn gốc từ nớc ngoài, không có lý lịch chứng minh nguồn gen chuyển. Nói cách khác, chúng tôi không nắm đợc các dòngnày đợc chuyển gen CryIA(b) hay CryIA(c). Khả năng kháng sâu xanh của các dòng này đã đợc kiểm định khi thử nghiêm trong nhà lới và ngoài đồng ruộng. Số liệu đánh giá tỉ lệ sâu ăn lá chết trong phòng thí nghiệm của một số dòng đợc nêu trong bảng 1, mục 2.1.
Để phân tích cây bông kháng sâu bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu T1 và T2 có chiều dài và trình tự nh đã nêu ở chơng 2. Đây là cặp mồi đợc thiết kế để có thể nhân 1 đoạn ADN nh nhau có độ dài 1,1 kb từ gen CryIA(b) hoặc CryIA(c). Khi áp dụng cặp mồi này vào phản ứng PCR đối với các dòng bông kháng sâu, chúng tôi nhận đợc sản phẩm PCR với độ lớn nêu trên, dòngnh sản phẩm nhân đợc từ mẫu đối chứng là plasmit mang gen CryIA(c) hay CryIA(b).
Dựa vào lợng sản phẩm PCR, chúng tôi có thể đánh giá sơ bộ số lợng bản gen CryIA có trong các dòng bông kháng sâu. Kích thớc của plasmit mang CryIA khoảng 11.5kb và của genom bông khoảng 2118 Mb (2n). Tỉ lệ trọng luợng phân tử giữa chúng là 1/151000. Nghĩa là, nếu trộn 0,07 pg plasmit-CryIA với 25 ng genom bông ta có hỗn hợp tơng đơng 1 genome bông và 1 bản gen CryIA . Dựa trên tính toán đó, chúng tôi lập phản ứng
PCR đối chứng duơng là genom bông có 5, 3, 1 bản gen CryIA tơng ứng. Kết quả PCR nhân gen CryIA ở các dòng bông kháng sâu trong hình 6a và 6b chỉ ra rằng các cây chuyển gen này mang từ một đến hơn một bản gen
CryIA.
Hình 6a. Kết quả PCR nhân gen CryIA ở các dòng bông kháng sâu. 1: thang ADN chuẩn (Marker Mix), 2-4: đối trứng dơng (genom bông + 5, 3, 1 bản gen CryIA); 5: đối trứng âm (genom bông không chuyển gen), 6-21: các dòng kháng sâu.
Hình 6b. Kết quả PCR nhân gen CryIA ở các dòng bông kháng sâu. 1: thang ADN chuẩn (Marker Mix), 2-4: đối trứng dơng (genom bông + 5, 3, 1 bản gen CryIA); 5: đối trứng âm, genom bông không chuyển gen, 6-19: các dòng kháng sâu
Trong 30 dòng bông đa vào phân tích, chúng tôi thu đợc 26 dòng có kết quả PCR nhân gen CryIA dơng tính (bảng 6). Sự có mặt của gen CryIA sẽ đợc khẳng
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1.1 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
định bằng lai Southern. Ngoài ra, các vạch sản phẩm PCR trên bản gel điện di đôi khi mờ hơn cả đối chứng dơng của 1 bản gen CryIA. Điều này có thể đợc giả thích bởi quá trình đóng mở của các sợi chromatin trong các mạch ADN của các dòng bông kháng sâu làm cản trở quá trình bắt cặp mồi nhân gen CryIA, trong khi ở đối chứng dơng, CryIA nằm trong plasmit có độ dài chỉ 11.5 kb, nên quá trình tháo xoắn ADN xảy ra dễ dàng và nhanh hơn, gây thuận lợi cho PCR.
Bảng 6: Kết quả nhân gen CryIA(b) và CryIA(c) bằng PCR ở các dòng bông kháng sâu
STT Tên giống Kêt quả STT Tên giống Kết quả
1 CS00-1 + 16 CS01-29 + 2 CS00-2 + 17 CS01-30 - 3 CS00-3 + 18 CS01-31 + 4 CS00-10 + 19 CS01-32 + 5 CS00-11 + 20 CS01-33 + 6 CS00-15 + 21 CS01-34 - 7 CS00-19 + 22 CS01-35 + 8 CS00-20 + 23 CS01-36 + 9 CS00-22 + 24 CS01-38 + 10 CS00-23 - 25 CS01-39 + 11 CS00-24 + 26 CS01-40 + 12 1520 + 27 CS01-42 + 13 CS01-26 + 28 CS01-43 + 14 CS01-27 - 29 CS92 + 15 CS01-28 + 30 CS95 +
Ghi chú: + là kết quả PCR dơng tính - là kết quả PCR âm tính