Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 40

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÊ THỊ THANH TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT CÚM A/H5N1 VÀ A/H3N2 BẰNG KĨ THUẬT DI TRUYỀN NGƢỢC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THỊ QUỲNH MAI Nội - 2012 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG I DANH MỤC HÌNH II CÁC CHỮ VIẾT TẮT III MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Khái quát virút cúm 1.2 Hệ gen virút cúm A 1.3 Quá trình nhân lên virút cúm A 1.4 Vai trò tƣợng trao đổi tích hợp vật liệu di truyền vụ đại dịch cúm giới 12 1.5 Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngƣợc tổng hợp virút cúm A 14 1.6 Cơ sở khoa học để thiết kế thực nghiên cứu 16 1.7 Vấn đề đạo đức An toàn sinh học nghiên cứu 19 CHƢƠNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1 Plasmid pHW2000 hệ thống plasmid chứng dương 20 2.2.2 Sinh phẩm hóa chất 21 2.2.3 Hệ thống cảm nhiễm virút cúm 25 2.2.4 Trang thiết bị dụng cụ 26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Lựa chọn chủng virút gốc 28 2.3.2 Chuẩn bị vector nhân dòng 28 2.3.3 Chuẩn bị ADN nhân dòng 28 2.3.4 Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000 30 2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 31 2.3.6 Chuẩn bị plasmid cho trình chuyển nhiễm 32 2.3.7 Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào 33 2.3.8 Khuếch đại virút 33 2.3.9 Xác định hiệu giá virút 34 2.3.10 Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) 36 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2 38 3.1.1 Lựa chọn chủng virút gốc 39 3.1.1.1 Virút A/H5N1 39 3.1.1.2 Virút A/H3N2 39 3.1.2 Chuẩn bị vector nhân dòng ADN đích 40 3.1.2.1 Chuẩn bị vector nhân dòng 40 3.1.2.2 Chuẩn bị ADN đích 41 3.1.3 Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm 45 3.1.3.1 Nhân dịng ADN đích 45 3.1.3.2 Hệ thống chuyển nhiễm tám plasmid tổng hợp virút cúm rgA/H5N1 50 3.1.4 Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid 55 3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 55 3.1.4.2 Hệ gen virút cúm rg-A/H5N1 58 3.2 Tìm hiểu đặc tính virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời) 61 3.2.1 Khả thích ứng virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK trứng gà có phơi 61 3.2.2 Định lượng virút rg-A/H5N1 kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử) 64 3.2.3 Khả gây bệnh virút cúm rg-A/H5N1 động vật thí nghiệm 66 KẾT LUẬN 68 ĐỀ XUẤT 69 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN protein virút cúm A Bảng 2.1 Hệ thống mồi dùng khuếch đại phân đoạn gen đích 22 Bảng 2.2 Hệ thống mồi dùng cho trình giải trình tự nucleotide 23 Bảng 3.1 Kết giải trình tự đoạn ADN đích trước nhân dịng 44 Bảng 3.2 Kích thước plasmid kiểm tra 49 Bảng 3.3 Tám plasmid lựa chọn cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm rg-A/H5N1 50 Bảng 3.4 Kết so sánh trình tự ADN đích sau nhân dịng với trình tự ADN đích trước nhân dịng 51 Bảng 3.5 Đánh giá chức plasmid hệ thống chuyển nhiễm 54 Bảng 3.6 Phát virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả ngưng kết hồng cầu 56 Bảng 3.7 Mức độ tinh mẫu ARN virút rg-A/H5N1 58 Bảng 3.8 Nguồn gốc phân đoạn gen virút rg-A/H5N160 Bảng 3.9 Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại tế bào MDCK trứng gà có phơi 62 Bảng 3.10 Định lượng virút rg-3 rg-4 kĩ thuật plaque 65 Bảng 3.11 Kết thí nghiệm xác định LD50 virút rg-4 chuột Swiss 66 i DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc virion virút cúm Hình 1.2 Chu trình nhân lên virút cúm 10 Hình 1.3 Nguồn gốc chủng virút cúm gây đại dịch 13 Hình 2.1 Mơ hình cấu trúc vector pHW2000 21 Hình 2.2 Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả tạo virút cúm A quy trình tổng hợp virút cúm từ virút cúm A/H5N1 A/H3N2 27 Hình 3.1 Quy trình tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 A/H3N2 kỹ thuật di truyền ngược 38 Hình 3.2 Sự lưu hành phân típ virút cúm mùa theo năm 40 Hình 3.3 Kiểm tra plasmid gel agarose 41 Hình 3.4 Tổng hợp ADN đích PCR 42 Hình 3.5 Sản phẩm ADN đích sau tinh 43 Hình 3.6 Xác định vi khuẩn chứa plasmid môi trường chọn lọc 46 Hình 3.7 Kiểm tra kích thước plasmid gel agarose 48 Hình 3.8 Kiểm tra mức độ tinh mẫu ARN virút rg-A/H5N1 59 Hình 3.9 Khả nhân lên virút rg-A/H5N1 hệ thống cảm nhiễm 63 ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN DeoxyRibonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid HA Haemagglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu) HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza (virút cúm gia cầm độc lực cao) MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (tế bào thận chó thường trực) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PTN Phịng thí nghiệm rg Reverse genetic (di truyền đảo ngược) RNP Ribonucleoprotein (phức hệ ribonucleoprotein) TCTTTG Tổ chức Y tế giới TPCK L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone vRNA ARN virut vRNP phức hệ ribonucleoprotein virút iii MỞ ĐẦU Trong lịch sử y học, đại dịch cúm xảy có nguyên virút cúm A (Infuenza A virus) Virút cúm gây đại dịch / dịch có thay đổi đặc tính kháng ngun Sự thay đổi theo kiểu biến thể kháng nguyên (antigenic drift) đột biến ngẫu nhiên xảy gen mã hóa cho haemagglutinin (HA) hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) [3] trao đổi tích hợp di truyền (reassortment) chủng virút cúm khác Từ đầu kỷ XX đến có đại dịch cúm ghi nhận, đại dịch (các năm 1957, 1968 2009) xảy xuất virut cúm nhờ tượng trao đổi tích hợp di truyền [2, 7, 14, 17, 25] Trao đổi tích hợp vật liệu di truyền (reassortment) đặc điểm virút cúm A Nhờ đó, có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt mặt di truyền, lúc xâm nhiễm vào tế bào tạo chủng virút có cấu trúc hệ gen pha trộn hệ gen virút “bố” “mẹ” chúng Virút (đặc tính kháng nguyên mới) kháng lại kháng thể hình thành đáp ứng miễn dịch lần trước có khả lây nhiễm vào vật chủ mà chủng “bố - mẹ” chúng khơng có khả gây nhiễm Chủng virút nguyên nhân gây dịch / đại dịch cúm [3] Ở Việt Nam, ngồi phân típ virút cúm A lưu hành người theo mùa (A/H3N2, A/H1N1) ghi nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI H5N1) [10, 12] Sự xuất virút cúm A/H5N1 thường xuyên đàn gia cầm với tập quán chăn nuôi gia cầm hộ gia đình người Việt Nam làm tăng nguy trao đổi tích hợp di truyền virút cúm gia cầm virút cúm người Ngoài ra, tần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên virút cúm A/H3N2 (4 lần) nhiều so với virút cúm A/H1N1 (2 lần) miền Bắc Việt nam (giai đoạn 2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả dễ trao đổi tích hợp virút cúm A/H3N2 với virút cúm A khác có điều kiện thuận lợi Trên sở tiến khoa học lĩnh vực sinh học phân tử, nhiều phương pháp áp dụng nghiên cứu virút cúm, số di truyền ngược (reverse genetic) Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động tổng hợp virút cúm có đặc điểm hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả xuất tự nhiên, khả gây bệnh cho người virut này, từ chủ động xây dựng biện pháp phịng chống hữu hiệu Trên giới, di truyền ngược áp dụng nhiều việc nghiên cứu độc lực virút phát triển vaccine cúm [30, 38, 45, 48, 51] Xuất phát từ lí trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Tổng hợp virút cúm từ virút cúm A/H5N1 A/H3N2 kỹ thuật di truyền ngƣợc” với mục đích: Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả tạo virút cúm A Tổng hợp virút cúm từ virút cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) A/H3N2 (cúm người) hệ thống chuyển nhiễm plasmid Tìm hiểu đặc tính virút cúm Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Khái quát virút cúm Đặc điểm chung Họ Orthomyxoviridae gồm năm chi: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, virút Isa virút Thogoto [21] Virút cúm A lưu hành phổ biến người, gia cầm, chim hoang dại số động vật khác lợn, ngựa, hải cẩu…, nguyên gây đại dịch cúm toàn cầu Virút cúm B C lưu hành chủ yếu người thường gây nên vụ dịch vừa nhỏ Virút cúm A chia thành phân típ (subtype) dựa hai glycoprotein bề mặt haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) HA chia thành 16 phân típ (từ H1 đến H16) NA chia thành phân típ (từ N1 đến N9) Các lồi chim thủy sinh ổ chứa tự nhiên tất phân típ virút cúm A Các phân típ gây bệnh cho người chủ yếu H1, H2, H3 N1, N2 [5] Danh pháp quốc tế quy định cho virút cúm gồm thơng tin sau: típ virút/viết tắt vật chủ (nếu động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập Với virút cúm A, bao gồm thêm thơng tin phân típ HA NA chủng virút [53] Ví dụ: A/swine/Taiwan/l/70 (H3N2) B/EnglADN/5/66 C/Paris/l/67 Hình thái cấu trúc virion virút cúm Virion virút cúm đa hình, hình cầu, hình trứng đơi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm * Quy trình nhiệt cho PCR Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Số chu kì 940C 2:00 940C 0:20 570C 0:30 680C 2:00 / 2:30 680C 7:00 35 Gắn ADN đích vào plasmid T4 DNA ligase Thành phần hỗn hợp Dung dịch đệm (10X) µl Vector 1,5 µl ADN đích – µl Enzyme µl Nước cất tinh (khơng có nuclease) Tổng thể tích vừa đủ 20 µl Điều kiện nhiệt độ: 160C qua đêm nhiệt độ phòng 10 phút 78 Phụ lục Kết xác định trình tự nucleotide tám phân đoạn DNA đích Đoạn PB2 (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn PB1 (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn PA (A/Hanoi/N062/2007) 79 Đoạn NP (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn M (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn NS (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn HA (A/Vienam/1203/2004) Đoạn NA (A/Vienam/1203/2004) 80 Phụ lục Nồng độ ADN đích vector sau q trình xử lí enzyme Nồng độ (ng/µl) Thể tích cần sử dụng (µl) Hàm lượng (ng) 50,1 1,5 75,15 NS 28,4 75,2 M 36,3 108,9 NP 31,3 125,2 PA 26,7 186,9 PB1 27,8 194,6 PB2 30,7 184,2 NA 40,2 120,6 HA 34,5 4,5 155,25 Mẫu đo A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) pHW2000 xử lí 81 Phụ lục Trình tự nucleotide tám đoạn ADN đích (chiều dài đủ) hệ thống chuyển nhiễm Đoạn PB2 (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn PB1 (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn PA (A/Hanoi/N062/2007) 82 Đoạn NP (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn M (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn NS (A/Hanoi/N062/2007) Đoạn HA (A/Vietnam/1203/2004) Đoạn NA (A/Vietnam/1203/2004) 83 Phụ lục Xác định nồng độ mức độ tinh plasmid hệ thống chuyển nhiễm Nồng độ (ug / µl) Backbone Kiểm tra ADN plasmid A280/260 pHW2000 + N062.NS 6,80 1.84 pHW2000 + N062.M 3,31 1.88 pHW2000 + N062.NP 4,32 1.85 pHW2000 + N062.PA 5,82 1.82 pHW2000 + N062.PB1 7,93 1.86 pHW2000 + N062.PB2 4,51 1.86 pHW2000 + VN1203.NA 5,08 1.83 pHW2000 + VN1203.HA 1,12 1.85 pHW2000 + PR8.NS 5,39 1.84 pHW2000 + PR8.M 6,37 1.91 pHW2000 + PR8.NA 7,68 1.85 pHW2000 + PR8.NP 8,87 1.83 pHW2000 + PR8.HA 4,08 1.86 pHW2000 + PR8.PA 6,46 1.87 pHW2000 + PR8.PB1 4,17 1.99 pHW2000 + PR8.PB2 5,88 1.90 84 Phụ lục Trình tự nucleotide tám phân đoạn gen virút rg-A/H5N1 (trình tự phần phân đoạn gen) Gen NS Gen M Gen NP Gen PA 85 Gen PB1 Gen PB2 Gen HA Gen NA 86 Phụ lục Thí nghiệm chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm Tế bào 293T trước thực chuyển nhiễm plasmid Tế bào 293T sau ngày thực chuyển nhiễm plasmid 87 Phụ lục Khả thích ứng virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK Tế bào MDCK lớp trước gây nhiễm Tế bào MDCK sau ngày gây nhiễm virút cúm 88 Phụ lục 10 Định lƣợng virút rg-A/H5N1 kĩ thuật plaque Virút rg-A/H5N1(E1M1) (rg-3) Virút rg-A/H5N1 (E2) (rg-4) 89 Phụ lục 11 Xác định LD50 virút rg-A/H5N1 động vật thí nghiệm Xác định giá trị LD50 theo phương pháp Reed – Muench Nhóm Virút gây nhiễm PFU/ml Số ĐVTN chết Số ĐVTN sống Số ĐVTN chết tích lũy Số ĐVTN sống tích lũy Tổng % số ĐVTN chết 103 11 14 78.6 102 15 60.0 101 15 46.7 100 11 15 26.7 10-1 14 16 12.5 ĐVTN: động vật thí nghiệm (chuột) Giá trị LD50 nằm khoảng 101 102 Xác định khoảng cách: = 60%−50% 60%−46,7 = 0,75 Như vậy, giá trị LD50 = 101,75 PFU/ml 90 Nhóm chuột đối chứng Tồn cá thể: phát triển bình thường (tăng cân, nhanh nhẹn) Nhóm chuột nghiên cứu sau ngày gây nhiễm (101 PFU/ml) Một số cá thể có biểu hiện: chậm chạp, khơng tăng cân, lơng xù) (mũi tên ) Nhóm nghiên cứu sau ngày gây nhiễm (101 PFU/ml) Chuột bị chết nhiễm virút cúm (mũi tên 91 ) 92