Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm a h5n1 bằng kỹ thuật di truyền ngược tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học PGS TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học học Hà Nội, 2019 Luận án hoàn thành Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trung Nam, Viện Công nghệ sinh học PGS TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án phiên thức Họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: phút, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trang web Bộ giáo dục đào tạo (website: http://luanvan.moet.gov.vn) - Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cúm A/H5N1 bệnh truyền nhiễm cấp tính người gia cầm, virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI H5N1) thường gây chết gia cầm hàng loạt, lây nhiễm sang người nên mối nguy hiểm tiềm ẩn chăn nuôi gia cầm sức khỏe cộng đồng Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu tiêm phòng vaccine Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch cúm virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến chủ yếu sử dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp di truyền ngược có nguồn gốc từ nước ngồi Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm Việt Nam thiếu tính chủ động gặp nhiều khó khăn Để chủ động đối phó với diễn biến phức tạp dịch cúm gia cầm có khả bùng phát, Việt Nam cần xây dựng làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để chủ động tạo chủng virus vaccine có hiệu bảo hộ cao với chủng virus lưu hành nước Trong số clade virus cúm HPAI H5N1 lưu hành Việt Nam, clade 1.1 clade 2.3.2.1c có tính tương đồng kháng nguyên đặc tính di truyền với nhiều clade virus gây dịch Việt Nam nên đáp ứng yêu cầu chủng dự tuyển vaccine phòng chống cúm A/H5N1 Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngược” Mục tiêu nghiên cứu Tạo chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược Nội dung nghiên cứu Phân lập cDNA phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M NS) mã hóa protein khung virus cúm A/PR/8/34 tách dòng riêng rẽ gen vào plasmid pHW2000 Thiết kế tách dòng hai gen H5 HA (đã loại bỏ amino acid kiềm vị trí vùng độc tránh lại độc) hai gen N1 NA chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) A/duck/Viet Nam/HT02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000 Chuyển nhiễm hệ thống + plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen khung + plasmid mang gen H5 N1 virus cúm A/H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Phân lập tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu chủng ứng viên vaccine: Có khả thích ứng nhân lên trứng gà có phơi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền Xác định khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá HI) hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c gà ngày tuổi Đóng góp luận án Là cơng trình khoa học chứng minh Việt Nam làm chủ công nghệ di truyền ngược để tái tạo hiệu chủng virus ứng viên vaccine cúm A Trong tương lai, sở nắm vững qui trình cơng nghệ tạo chủng virus gốc di truyền ngược, kiểm soát kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 gia cầm ứng dụng công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus ứng viên cho sản xuất vaccine có hiệu phòng vệ với biến chủng virus xuất Đã tối ưu số yếu tố cơng nghệ qui trình chuyển nhiễm hệ thống + plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 (rg-A/H5N1 clade 1.1 rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c) có khả thích ứng nhân lên với hiệu suất cao trứng gà có phơi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể gà ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ log tuần tuần sau tiêm phòng) Cấu trúc luận án Luận án gồm 150 trang, chia thành phần: - Mở đầu: trang - Chương Tổng quan tài liệu: 34 trang - Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu: 25 trang - Chương Kết nghiên cứu: 50 trang - Chương Bàn luận kết quả: 14 trang - Kết luận kiến nghị: trang - Các công trình cơng bố tác giả: trang - Tóm tắt nội dung luận án tiếng Anh: trang - Tài liệu tham khảo: 16 trang Luận án có 20 bảng số liệu, 36 hình 172 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm A/H5N1 Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có genome RNA sợi đơn, âm (ss(-)RNA), gồm phân đoạn genome, phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M NS) mã hóa protein tạo khung phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên (HA, NA) định vị bề mặt virion Nhóm virus cúm A phân thành nhiều subtype khác dựa kháng nguyên HA (Hemagglutinin) NA (Neuraminidase) với 18 subtype HA (H1- H18) 11 subtype NA (N1 - N11), có khả tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm subtype khác độc tính khả gây bệnh Trong số subtype virus cúm A, subtype H5N1 chứng minh có khả lây nhiễm từ động vật sang người Các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1- lây nhiễm nhanh nhiều loại gia cầm, động vật có vú người với khả đột biến cao tái tổ hợp di truyền lớn Protein HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm đơn phân (trimer), đơn phân (monomer) tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) HA2 (27 kDa) nối với đoạn oligopeptide ngắn giàu amino acid kiềm arginine (R) lysine (K) vị trí amino acid 338 – 345/346 Đặc điểm vị trí giàu amino acid kiềm HA1 HA2 quy định tính độc virus nên gọi “vùng độc”: Ở vị trí vùng độc, chủng virus A/H5N1 độc lực cao chứa nhóm amino acid kiềm, chủng virus A/H5N1 độc lực thấp chứa amino acid kiềm arginin lysine (Suzuki et al., 2005) Protein NA có hoạt tính enzyme Neuraminidase, xúc tác phản ứng cắt mối liên kết glycoside thụ thể chứa sialic acid bề mặt tế bào chủ gai glycoprotein vỏ virus, giúp virus xâm nhiễm vào tế bào chủ (Yano et al., 2008; da Silva et al., 2015) 1.2 Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 gia cầm Vaccine cúm A cần làm (thay đổi chủng giống) hàng năm để chắn có hiệu lực phòng vệ với chủng virus lưu hành hay xuất Đây trở ngại, thách thức gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine, cần thiết để thích ứng với khả tiến hóa nhanh, dễ xuất biến chủng chuyển dịch kháng nguyên, đột biến tái tổ hợp gen xảy phổ biến virus cúm (Pronker et al., 2012) Hướng dẫn WHO cho phát triển nhanh chủng virus vaccine vừa có đặc tính kháng nguyên (quy định phân đoạn gen HA NA) giống chủng virus lưu hành, vừa có khả nhân lên tạo hạt virus với hiệu suất cao tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên vaccine có gen lắp ráp nhân tạo theo công thức + (6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/1934(H1N1) phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên HA NA - virus hoang dại lưu hành) 1.3 Di truyền clade virus cúm A/H5N1 Việt Nam Quá trình hình thành clade cúm HPAI H5N1 gây dịch Việt Nam phức tạp với clade xuất phổ biến sau: - Giai đoạn năm 2003 đến 2006: Clade clade 2.3.2 xuất gây dịch phạm vi toàn quốc - Giai đoạn năm 2007 đến 2013: Xuất chủ yếu biến chủng thuộc ba clade: 1.1, 2.3.4 2.3.2.1 Trong đó: Clade 2.3.4 xuất năm 2007 gây dịch bệnh gia cầm giai đoạn 2007 - 2010, từ năm 2011 đến 2013 không thấy xuất hiện; clade 1.1 phát sinh từ clade 1, xuất năm 2007 gây bệnh chủ yếu tỉnh phía Nam, từ năm 2011 phân nhánh thành clade 1.1.1 clade 1.1.2; clade 2.3.2 xuất lần đầu năm 2005, từ năm 2009 phân nhánh thành clade 2.3.2.1, sau tiếp tục phân thành nhánh 2.3.2.1 nhóm A (clade 2.3.2.1a), 2.3.2.1 nhóm B (clade 2.3.2.1b) 2.3.2.1 nhóm C (clade 2.3.2.1c) Trong số clade thuộc nhánh 2.3.2.1, virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây dịch diện rộng (từ Bắc vào Nam) - Giai đoạn từ năm 2014 đến nay: Clade 2.3.2.1c tiếp tục lưu hành, clade 2.3.4 phân nhánh thành clade 2.3.4.4 clade 1.1 có nguy bùng phát trở lại (Chu et al., 2016, Nguyen et al., 2017; Mellor et al., 2018) 1.4 Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược nghiên cứu phòng chống virus cúm A Kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) ứng dụng phổ biến giới nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A từ cDNA virus tạo dòng vào plasmid Ưu điểm kỹ thuật cho phép thao tác với genome virus mức độ phân tử để tạo hạt virus mang đặc tính mong muốn (Chen et al., 2012; Palese & Shaw, 2007; Neumann et al., 2004) Trong số hệ thống di truyền ngược ứng dụng hiệu đáp ứng mục tiêu thời gian ngắn tạo chủng virus vaccine hiệu hệ thống gồm plasmid pHW2000 mang PolI-PolII Hoffmann đtg (2000) Sự có mặt phức hợp PolI-PolII plasmid cho phép sinh tổng hợp mRNA virus (nhờ PolII) vRNA (nhờ PolI) tế bào động vật từ phân đoạn cDNA virus dòng hóa vào plasmid, cho phép hạt virus tái tổ hợp tái tạo hiệu CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng NIBRG-14 Chủng NIBRG-14 NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp nguồn vật liệu cho phân lập phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Plasmid chủng khuẩn Plasmid pHW2000 cung cấp Dr Erich Hoffmann Dr Robert G Webster (Bệnh viện Nhi St Jude, Mỹ), plasmid chứa phức hợp PolI-PolII hai chiều Chủng E coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1∆ lac U169 (φ80 lacZM15)] hãng Invitrogen (Mỹ) dùng chọn dòng nhân dòng gen Cặp mồi sử dụng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu cho nhân xác định trình tự phân đoạn gen virus cúm A thiết kế theo Hoffmann đtg (2001) Tế bào Tế bào 293T tế bào MDCK cung cấp ATCC (American Type Culture Collection, Mỹ) Trứng gà có phơi gà ngày tuổi Trứng gà có phơi - 11 ngày tuổi gà ngày tuổi cung cấp Trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương (Viện Chăn nuôi), kiểm định virus/kháng thể đặc hiệu với virus A/H5N1 Newcastle 2.2 Địa điểm nghiên cứu Tất thí nghiệm biến nạp tái tạo virus A/H5N1 tái tổ hợp di truyền ngược, nhân giống virus, kiểm tra virus thực phòng thí nghiệm an tồn cấp + Viện Cơng nghệ sinh học Các thao tác tiến hành với virus (cấy truyền, thu nhận, xác định có mặt virus ) thực box cấy an toàn sinh học cấp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Tách chiết RNA tổng số chủng NIBRG-14 (mang phân đoạn gen khung từ virus A/PR/8/34 [PR8] kit Tripure Isolation Reagent (Invitrogen, Mỹ) Nhân sáu phân đoạn gen khung virus PR8 từ mẫu vRNA tổng số phương pháp RT-PCR hai bước để chuyển hóa vRNA thành cDNA (bước 1) PCR khuếch đại cDNA (bước 2) theo phương pháp Hoffmann đtg (2001) 2.3.2 Thiết kế gen kháng nguyên HA NA virus A/H5N1 clade 1.1 2.3.2.1c Hai gen HA hai gen NA hai clade virus (clade 1.1 2.3.2.1c) thiết kế có cấu trúc: Tương ứng hai đầu gen hai đoạn nucleotide khơng mã hóa chứa điểm bắt cặp đặc hiệu mồi xuôi mồi ngược phản ứng PCR nhân gen; vùng mã hóa chứa trình tự nucleotide gen H5 HA gen N1 NA tương ứng Đặc biệt, để đảm bảo virus tái tổ hợp lắp ráp di truyền ngược virus độc lực thấp, hai phân đoạn gen H5 HA hai clade virus loại vùng độc (loại nucleotide mã hóa amino acid kiềm arginine (R) lysine (K) vị trí HA1 HA2) tránh lại độc (Hình 2.1) Hình 2.1 Trình tự nucleotide amino acid gen HA clade 1.1 HA clade 2.3.2.1c trước sau xử lý loại vùng độc tránh lại độc 2.3.3 Ghép nối phân đoạn gen virus cúm A vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen 10 mẫu DNA plasmid dòng khuẩn lạc chọn dòng (6 dòng dương tính với plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn gen khung + dòng dương tính với gen kháng ngun H5 N1 clade 1.1 + dòng mang gen kháng nguyên H5 N1 clade 2.3.2.1c) tách tinh sạch, sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức) Các plasmid tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn, thu nhận gen đích ghép nối gen vào plasmid pHW2000 theo phương pháp Hoffmann đtg (2001) 2.3.4 Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Thực công thức chuyển nhiễm + plasmid vào tế bào 293T: (i) plasmid mang phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với plasmid mang gen kháng nguyên H5 N1 từ clalde 1.1; (ii) plasmid mang phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với plasmid mang gen kháng nguyên H5 N1 từ clalde 2.3.2.1c Xác định có mặt virus tái tổ hợp dịch nuôi cấy bế bào sau chuyển nhiễm plasmid kỹ thuật RT-PCR bước Các mẫu có kết RT-PCR dương tính với có mặt virus tái tổ hợp hệ P0 thu nhận riêng rẽ ghi ký hiệu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tương ứng) 2.3.5 Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trứng gà có phơi Các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c tái tổ hợp cấy nhân giống trứng gà có phôi - 11 ngày tuổi Ủ trứng tủ ấm 35°C, độ ẩm 60% 48h Thu hoạch dịch niệu trứng (chứa virus tái tổ hợp hệ P1) riêng rẽ vào ống vô trùng Xác định có mặt virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c dịch niệu trứng phương pháp: (i) Xác định hiệu giá HA, (ii) xác định hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) khả tạo plaque đĩa nuôi cấy tế bào MDCK thí nghiệm plaque assay theo hướng dẫn WHO (2011) 2.3.6 Phân lập chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c phân lập từ mẫu virus hệ P1 có kết kiểm tra hiệu giá HA hiệu giá virus cao Thí nghiệm phân lập virus thực theo hướng dẫn WHO (2011) 2.3.7 Ni cấy thích nghi chủng virus trứng gà có phơi xác định tính ổn định di truyền chủng virus Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P1 cấy truyền vào trứng gà có phơi thêm lần để thu nhận virus hệ từ P2 - P5 Xác định hiệu giá HA, tính đầy đủ di truyền (thể có mặt phân đoạn gen genome virus) tính ổn định di truyền gen kháng nguyên (thể trình tự gen kháng nguyên H5 HA N1 NA không bị biến đổi) chủng virus hệ P5 2.3.8 Tạo vaccine phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Dịch niệu trứng thu hoạch từ hệ P2 đến P5 hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí chủng virus ứng viên vaccine (có khả thích ứng nhân lên trứng gà có phơi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên H5 N1) làm đồng đến hiệu giá HA 1: 1024 Tiến hành vô hoạt virus, tạo hai loại vaccine cúm vô hoạt nhũ dầu từ hai chủng virus 2.3.9 Xác định khả kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu gà ngày tuổi virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Vaccine từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau kiểm tra đảm bảo tính an tồn tiêm phòng cho gà ngày tuổi theo công thức: (i) Tiêm liều 0,5 ml vaccine cho gà ngày tuổi; (ii) tiêm liều: Liều tiêm 0,2 ml vaccine cho gà ngày tuổi, tiêm nhắc lại (liều 2) 0,5 ml vaccine lúc gà 13 ngày tuổi Mỗi cơng thức thí nghiệm tiêm 20 gà Xác định hiệu sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu loại vaccine phương pháp xác định hiệu giá HI (hiệu giá ức chế khả gây ngưng kết hồng cầu) sau tuần tuần tiêm phòng CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Kiểm tra chất lượng mẫu vRNA tổng số sau tách chiết đo nồng độ độ tinh máy Nanodrop cho kết nồng độ vRNA 30,1 - 46,2 ng/µl độ tinh thể tỷ số A260/280 khoảng 1,86 - 1,92 3.1.2 Khuếch đại, xác định trình tự chọn dòng sáu phân đoạn gen khung Sáu phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 [PR8] nhân kỹ thuật RT-PCR hai bước theo phương pháp Hoffmann đtg (2001): Bước - chuyển hóa vRNA → cDNA; bước - PCR khuếch đại cDNA → dsDNA Trong phản ứng bước 1, sử dụng Reverse transcriptase với mồi Uni12 để chuyển toàn phân đoạn ssRNA sợi âm genome virus thành phân đoạn cDNA Mồi Uni 12 có chiều dài 12 nucleotide (5’-AGCAAAAGCAGG- 3’), bắt cặp bổ sung với 12 nucleotide bảo thủ có tất đầu 3’ phân đoạn gen virus Các phân đoạn cDNA sản phẩm bước sử dụng làm khuôn cho bước 2: Thực phản ứng PCR khuếch đại gen khung với cặp mồi đặc hiệu cho nhân gen khung Quá trình RT-PCR hai bước sơ đồ hóa Hình 3.1 Hình 3.1 Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung virus A/PR/8/34 ứng dụng kỹ thuật RT-PCR hai bước với mồi Uni12 Kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân riêng rẽ phân đoạn gen khung điện di gel agarose 1,5% (Hình 3.2) cho thấy: phân đoạn gen khung PB2, PB1, PA, NP, M NS - nhân thành công từ mẫu vRNA chủng NIBRG-14, với sản phẩm RT-PCR phân đoạn gen khung chứa mẫu nhân thành cơng băng vạch đặc hiệu, sáng, rõ nét, kích thước tương ứng với kích thước tính tốn theo lý thuyết gen Các sản phẩm RT-PCR sáu phân đoạn gen khung tách dòng vào plasmid pBT, biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α Sàng lọc dòng khuẩn mang plasmid pBT tái tổ hợp phương pháp conoly-PCR DNA plasmid dòng vi khuẩn dương tính với phản ứng conoly-PCR tách chiết, tinh xác định trình tự nucleotide gen đích với hai loại mồi mồi đặc hiệu gen mồi bắt cặp plasmid Mỗi phân đoạn gen xác định trình tự nucleotide theo chiều xi chiều ngược Kết trình tự nucletide so sánh để xác định trình tự đầy đủ gen Trên sở trình tự nucleotide gen nhận được, tiến hành so sánh với trình tự nucleotide phân đoạn gen tương ứng virus PR8 ngân hàng sở liệu NCBI Bên cạnh đó, kết trình tự nucleotide chuyển sang trình tự amino acid suy diễn so sánh có hay khơng sai khác trình tự amino acid gen tách dòng plasmid pBT với trình tự amino acid đầy đủ đảm bảo để thực chức gen khung từ chủng PR8 A D B C E F Hình 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân sáu phân đoạn gen mã hóa protein khung virus NIBRG-14 Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas) A Phân đoạn gen PB2 có mẫu (1, 2, 3) nhân băng kích thước tương ứng gen PB2 B Phân đoạn gen PB1 có mẫu (1, 2) nhân băng kích thước tương ứng gen PB1 C Phân đoạn gen PA có mẫu nhân băng đặc hiệu kích thước tương ứng gen PA D Phân đoạn gen NP có mẫu (1, 2, 3) nhân băng kích thước tương ứng gen NP E Phân đoạn gen M có mẫu (2, 3) nhân băng kích thước tương ứng gen M F Phân đoạn gen NS có mẫu (1, 2, 3) nhân băng kích thước tương ứng gen NS Kết so sánh trình tự nucleotide amino acid làm sở cho chọn dòng plasmid trình bày Bảng 3.1 cho thấy: Tương ứng với phân đoạn gen khung, chọn lọc - dòng khuẩn mang cDNA có trình tự nucleotide mã hóa trình tự amino acid khộng thay đổi (giống 100%) so với trình tự sáu gen khung virus PR8 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) Số lượng dòng khuẩn chuyển nạp plasmid tái tổ hợp mang gen quan tâm có trình tự nucleotide khơng thay đổi so với trình tự gen tương ứng chủng PR8 sau: Gen PB2 - dòng; gen PB1 - dòng; gen PA - dòng; gen NP - dòng; gen M - dòng gen NS - dòng Bên cạnh dòng mang gen đích có trình tự nucleotide khơng thay đổi so với virus PR8, có số dòng có trình tự nucleotide xuất đột biến điểm làm thay đổi bp gen, dẫn đến thay đổi amino acid protein gen mã hóa khơng thay đổi trình tự amino acid (trường hợp thay đổi nucleotide ba nucleotide thay đổi mã hóa amino acid) Sự biến đổi có khả xuất phát từ đột biến điểm xảy hệ genome quần thể virus NIBRG-14 dịch niệu trứng, kết sai sót xảy chép genome phức hợp polymerase - RdRp - virus cúm A (loại virus điển hình khả tiến hóa nhanh, dễ biến đổi di truyền xuất đột biến điểm trình chép genome polymerase hoạt động có tần số xuất đột biến cao) Bảng 3.1 So sánh trình tự nucleotide amino acid sáu phân đoạn gen khung phân lập với gen tương ứng chủng PR8 Gen Ký hiệu Kích thước Vị trí thay đổi so với trình tự gen dòng khuẩn gen tương ứng chủng PR8 lạc (nucleotide) Vị trí nucleotide Vị trí amino acid thay đổi thay đổi cl1 T1855C F619L PB2 cl2 KTĐ KTĐ 2341+29 cl3 KTĐ KTĐ cl4 A1574G E525G cl1 KTĐ KTĐ PB1 cl2 T290C L97S 2341+29 cl3 KTĐ KTĐ cl4 KTĐ KTĐ PA cl1 2233+29 G861A, T1879C W627R cl2 KTĐ KTĐ cl1 G567A KTĐ NP 1565+29 cl2 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ cl1 KTĐ KTĐ M 1027+29 cl2 C395T T132I cl3 KTĐ KTĐ NS cl1 890+29 KTĐ KTĐ cl2 KTĐ KTĐ KTĐ: Không thay đổi; 29: Các nucleotide thiết kế thêm hai đầu mồi nhân gen Để tạo plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn gen khung có trình tự nucleotide đầy đủ khơng thay đổi so với trình tự gen khung virus PR8, luận án lựa chọn tương ứng với gen khung dòng DNA plasmid có trình tự nucleotide gen đích giống 100% so với phân đoạn gen khung tương ứng virus PR8 ngân hàng NCBI để dòng hóa vào plasmid pHW2000 3.1.3 Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 Sáu phân đoạn gen khung cắt thu nhận từ plasmid pBT tái tổ hợp để tách dòng vào plasmid pHW2000 theo phương pháp Hoffmann đtg (2001) Sáu plasmid pBT tái tổ hợp cắt BsmBI BsaI Sản phẩm phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose 2% (Hình 3.3) Các băng vạch có kích thước với kích thước lý thuyết gen khung điện di cắt thu nhận phương pháp gel, tinh gen Ghép nối riêng rẽ phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 cắt mở vòng BsmBI tạo plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen khung Kiểm tra có mặt phân đoạn gen khung mẫu plasmid pHW2000 tái tổ hợp phương pháp PCR với hai loại mồi mồi đặc hiệu cho nhân phân đoạn gen mồi bắt cặp plasmid Sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen mồi đặc Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp với cặp enzyme NheI SmaI điện di xuất băng vạch: Băng thứ có kích thước lớn tương ứng với kích thước plasmid pHW2000 băng thứ hai kích thước nhỏ tương ứng với kích thước gen HA (khoảng 1800 bp) (Hình 3.6B) Kết xác định trình tự nucleotide gen đích chứng minh gen HA clade 1.1 HA clade 2.3.2.1c tạo dòng thành cơng vào plasmid pHW2000 với kích thước trình tự nucleotide xác 100% so với trình tự thiết kế DNA plasmid dòng dương tính với gen HA tách chiết tinh để sẵn sàng sử dụng cho thí nghiệm tái tạo chủng virus vaccine cúm A/H5N1 tái tổ hợp 3.3 Thiết kế tách dòng gen NA virus cúm A/H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 Trình tự nucleotide gen N1 NA clade 1.1 clade 2.3.2.1c thiết kế dựa trình tự nucleotide gen NA phân lập từ hai chủng virus cúm độc lực cao A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) A/duck/Vietnam/HT-02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) tương ứng, có kích thước cấu trúc gồm 1453 bp với: vùng mã hóa kích thước 1350 bp, 1347 bp (bắt đầu ba khởi đầu dịch mã - ATG) mã hóa 449 amino acid, bp tương ứng với ba kết thúc khơng mã hóa; vùng khơng mã hóa nằm hai đầu với kích thước trình tự nucleotide tương ứng 46 bp - 5’ tagtactaagcatattggtctcagggagcaaaagcaggagttcaaa 3’ 57 bp 5’tttgttcaaaaaactccttgtttctactaatacgagaccatattagtactaagcata 3’, nucleotide in nghiêng vị trí gắn đặc hiệu mồi xi ngược phản ứng PCR nhân gen,và nucleotide gạch chân vị trí nhận biết/trình tự bổ sung với vị trí nhận biết BsaI Với cấu trúc gen NA thiết kế hai clade, thực phản ứng PCR nhân gen NA tạo sản phẩm đặc hiệu có kích thước gồm vùng mã hóa hai đoạn nucleotide khơng mã hóa hai đầu gen, bắt đầu vị trí gắn mồi đặc hiệu, với tổng số nucleotide 1434 bp (1350 bp + 84 bp) So sánh tương đồng trình tự amino acid suy diễn gen NA clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c mã hóa chương trình ClustalW BLAST độ tương đồng hai trình tự 92% Đặc biệt, protein gen NA clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c mã hóa gồm 449 amino acid (Hình 3.7) với đầy đủ vị trí quan trọng đảm bảo chức tính kháng nguyên protein NA như: Hình 3.7 Trình tự amino acid gen NA clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c Các amino acid đánh dấu khung hình bầu dục gồm amino acid tạo thành vị trí thực chức xúc tác neuraminidase, nucleotide khung hình vng/chữ nhật vị trí Nglycosyl hóa gen Vị trí thực chức xúc tác (catalytic site) neuraminidase: Ở hai clade hợp thành từ amino acid nằm vị trí, phân bố bề mặt tiểu đơn vị hợp thành đầu tetramer dạng cầu NA, gồm: Arg (R) - 98, Asp (D) - 131, Glu (E) 258, Arg (R) - 273, Arg (R) - 348, Tyr (Y) - 382, Glu (E) - 405 Các cơng bố trình tự gen NA virus H5N1 clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c ngân hàng NCBI khẳng định vai trò vị trí việc đảm bảo chức thực hoạt tính enzyme protein NA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/408717469) Vị trí N-glycosyl hóa (glycosylation site): Ở protein NA clade 1.1 có vị trí glycosyl hóa 68NSS 126NGT Protein gen NA clade 2.3.2.1c mã hóa có vị trí glycosyl hóa với vị trí có trình tự thứ tự amino acid giống protein NA clade 1.1 thêm vị trí 215NGS Vùng cuống (stalk region): Ở subtype N1 NA, vùng cuống tạo thành khoảng gần 50 amino acid, tương ứng với vị trí amino acid 40 - 90 tính từ đầu tận N protein, cần có gốc Cys (C) vị trí glycosyl hóa (Reid et al., 2000) Các đặc điểm có protein mã hóa hai trình tự gen NA thiết kế Cụ thể, vùng amino acid vị trí 40 - 90 mã hóa gen NA clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c có gốc Cys amino acid 72 vị trí glycosyl hóa 68NSS Sau tách dòng kiểm tra có mặt gen NA plasmid pHW2000 PCR với hai loại mồi mồi đặc hiệu gen mồi đặc hiệu plasmid, kết biến nạp thành công hai gen NA tương ứng với hai clade vào hai plasmid pHW2000 (Hình 3.8A) Kết tạo dòng kiểm tra phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn: Cắt cặp NheI SmaI, cắt SacI Sản phẩm phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose cho thấy: Sản phẩm cắt pHW2000-NA clade 1.1 pHW2000-NA clade 2.3.2.1c cặp NheI SmaI (Hình 3.8B) hay SacI (Hình 3.8C) xuất hai băng vạch: Băng thứ có kích thước lớn tương ứng với kích thước plasmid pHW2000, băng thứ hai kích thước nhỏ tương ứng kích thước gen NA Bên cạnh đó, điểm cắt SacI plasmid pHW2000 nằm xa so với điểm cắt NheI SmaI pHW2000 tính từ vị trí gắn gen NA, nên sản phẩm phản ứng cắt cho băng vạch tương ứng chứa gen NA cắt SacI có kích thước lớn so với cắt NheI SmaI A B C Hình 3.8 Kiểm tra kết tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000 M: Marker 1kb; M1: Marker HighRanger 1kb DNA Ladder A PCR nhân gen NA cặp mồi đặc hiệu gen cặp mồi đặc hiệu plasmid; 1, 2: Sản phẩm PCR nhân gen NA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen NA clade 2.3.2.1c B Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (5) clade 2.3.2.1c (6) NheI SmaI C Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (7) clade 2.3.2.1c (8) SacI Kết xác định trình tự nucleotide gen đích plasmid tái tổ hợp khẳng định gen NA clade 1.1 NA clade 2.3.2.1c tách dòng thành công vào hai plasmid pHW2000 3.4 Tạo chủng virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c di truyền ngược 3.4.1 Xác định loại hóa chất thời gian chuyển nhiễm thích hợp cho tái tạo virus rgA/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c tế bào 293T Ảnh hưởng loại hóa chất chuyển nhiễm Kết trình bày Bảng 3.2 cho thấy: Các công thức chuyển nhiễm sử dụng Lipofectamine-2000 TransIT-LT kích thích plasmid chuyển nhiễm vào tế bào 293T, từ tái tạo thành cơng virus tái tổ hợp, thể hiệu giá HA (log 2) đạt 4,5 - 7,0 công thức bổ sung chất kích thích chuyển nhiễm, cơng thức đối chứng (bổ sung đệm PBS thay chất chuyển nhiễm) cho kết hiệu giá HA âm tính Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Loại hóa chất Hiệu giá HA (log2) công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus chuyển nhiễm rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Đối chứng (PBS) Lipofectamine-2000 TransIT-LT 6,83a ± 1,17 4,5b ± 0,84 7,0a ± 0,89 5,17b ± 0,75 Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05; (-): Hiệu giá HA âm tính - khơng có khả gây ngưng kết hồng cầu Trong số loại chất chuyển nhiễm, Lipofectamine-2000 cho hiệu chuyển nhiễm (HA log2) tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 6,83 virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,0 - cao so với hiệu chuyển nhiễm TransIT-LT đạt HA log2 4,5 5,17 tương ứng với clade virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Kết so sánh phương pháp thống kê khác biệt cơng thức có ý nghĩa thống kê mức p < 0,05 Do vậy, luận án lựa chọn Lipofectamine-2000 làm yếu tố kích thích chuyển nhiễm plasmid ngoại lai vào tế bào 293T Ảnh hưởng thời gian chuyển nhiễm Tối ưu thời gian ủ plasmid với tế bào 293T có mặt Lipofectamine-2000 có khả nâng cao hiệu chuyển nhiễm Trong nghiên cứu này, cơng thức thí nghiệm chuyển nhiễm plasmid vào tế bào bố trí khoảng thời gian 10 - 60 phút Số liệu nhận (Bảng 3.3) cho thấy: Tương ứng với thời gian chuyển nhiễm khác nhận hiệu tái tạo virus tái tổ hợp thông qua hiệu giá HA khác Thời gian chuyển nhiễm 10 phút chưa đủ để đạt hiệu chuyển nhiễm cao plasmid vào tế bào - hiệu giá HA virus thấp Công thức có thời gian chuyển nhiễm 30 phút 60 phút cho hiệu giá HA (log 2) virus cao So sánh hiệu chuyển nhiễm hai khoảng thời gian 30 phút 60 phút cho phép lựa chọn thời gian chuyển nhiễm plasmid vào tế bào 293T có mặt Lipofectamine-2000 30 phút: Hiệu giá HA (log2) virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 7,17 virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian chuyển nhiễm đến hiệu tái tạo virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Thời gian chuyển Hiệu giá HA (log2) công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus nhiễm rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 10 phút 20 phút 30 phút 60 phút 2,33a ± 0,52 5,33b ± 0,52 7,17c ± 0,75 7,00c ± 0,89 2,50a ± 1,75 5,83b ± 0,75 7,33c ± 0,82 7,17c ± 0,98 Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 3.4.2 Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T Hai công thức chuyển nhiễm dựa nguyên tắc + plasmid thực để tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Các đĩa tế bào sau chuyển nhiễm plasmid ủ 37ºC, 5% CO 48h để thu nhận dịch sau biến nạp chứa hệ P0 virus tái tổ hợp Tương ứng với loại virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c, luận án thu nhận mẫu dịch sau biến nạp có khả có có mặt virus Ký hiệu mẫu virus hệ P0 Kết kiểm tra có mặt virus tái tổ hợp phản ứng RT-PCR nhân gen HA xác định trình tự gen HA trình bày Bảng 3.4 Hình 3.9 khẳng định tái tạo thành công virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Bảng 3.4 Kiểm tra có mặt đặc điểm di truyền gen HA virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 1.1 hệ P0 Công thức Thu Ký Kết kiểm tra có mặt virus tái chuyển nhận từ hiệu tổ hợp nhiễm cho lần mẫu RT-PCR Xác định Sự có mặt tái tạo virus chuyển virus trình tự gen amino acid kiềm nhiễm HA vùng độc P0.1.1 + KTĐ P0.1.2 + KTĐ P0.1.3 + KTĐ rg-A/H5N1 P0.2.1 + KTĐ clade 1.1 P0.2.2 + KTĐ P0.2.3 + KTĐ P0.3.1 + KTĐ P0.3.2 + KTĐ P0.3.3 + KTĐ P0.1.1 + KTĐ P0.1.2 + KTĐ P0.1.3 + KTĐ P0.2.1 + KTĐ rg2 P0.2.2 + KTĐ A/H5N1 P0.2.3 + KTĐ clade 2.3.2.1c P0.3.1 + KTĐ P0.3.2 + KTĐ P0.3.3 + KTĐ (+): Sản phẩm RT-PCR dương tính với băng đặc hiệu kích thước khoảng 1,8 kb; KTĐ: Trình tự nucleotide gen HA khơng thay đổi so với trình tự gen thiết kế; (-): Khơng có amino acid kiềm vị trí vùng độc gen HA So sánh trình tự gen HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 2.3.2.1c hệ P0 với hai trình tự gen HA thiết kế tương ứng với hai clade, nhận kết quả: Trình tự gen HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P0 đồng (giống 100%) so với trình tự gen HA thiết kế Bên cạnh đó, trình tự gen HA nhân từ mẫu dịch virus không chứa vùng giàu amino acid kiềm độc Do RT-PCR phương pháp có độ nhạy tính xác cao, nên kết nhận cho phép khẳng định: (i) Đã tái tạo thành công hạt virus tái tổ hợp hai công thức chuyển nhiễm, với tỷ lệ chuyển nhiễm thành công đạt 100% (tất mẫu dịch sau chuyển nhiễm cho kết kiểm tra dương tính với phản ứng RT-PCR nhân gen HA); (ii) mẫu virus tái tạo an toàn mức độ phân tử (không chứa vùng độc gen HA); (iii) mẫu hệ P0 hai clade virus thể tính ổn định di truyền gen kháng nguyên Hình 3.9 Trình tự nucleotide gen HA hệ P0 virus A/H5N1 clade 1.1 virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c khơng chứa vùng độc A Trình tự nucleotide gen HA virus rg-A/H5N1 clade 1.1; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA chủng A/H5N1 clade 1.1 ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.1, HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.2, HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.3: Gen HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 khơng chứa vùng độc B Trình tự nucleotide gen HA virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA chủng A/H5N1 clade 2.3.2.1c ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.1, HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.2, HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.3: Gen HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc 3.5 Nhân giống virus trứng gà có phơi Tiêu chí để lựa chọn chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 gia cầm không vào đặc điểm di truyền tính kháng ngun, mà xét đến khả thích ứng nhân lên trứng gà có phơi, phương pháp nhân giống virus cho sản xuất vaccine cúm gia cầm chủ yếu nhân trứng Các mẫu chứa virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P0 thu nhận sau biến nạp, kiểm tra chắn an tồn mức độ phân tử (đều virus có độc lực thấp) cấy truyền vào trứng gà có phơi Sau 48h ủ trứng cấy giống virus 35°C, độ ẩm 60%, nước trứng có chứa virus tái tổ hợp ký hiệu hệ P1 thu hoạch riêng rẽ tiến hành kiểm tra vô trùng, xác định hiệu giá HA khả tạo thành vết tan tế bào MDCK mẫu Trong số mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c khảo sát khả thích ứng nhân lên trứng, luận án sàng lọc mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 (mẫu P1.1.1, P1.2.1 P1.3.3) có hiệu giá HA ≥ 1: 1024 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (P1.1.2, P1.2.2 P1.3.2 có hiệu giá HA ≥ 1: 512 Các mẫu virus lựa chọn cho phân lập chủng virus có khả thích ứng nhân lên trứng gà có phơi với hiệu giá HA cao (Hình 3.10) A B Hình 3.10 Kết xác định hiệu giá HA virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P1 thu nhận sau 48h nuôi cấy trứng gà có phơi ĐC: Mẫu đối chứng A Xác định hiệu giá HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 hệ P1 B Xác định hiệu giá HA mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P1 Kết xác định khả thích ứng nhân lên virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c tế bào MDCK trình bày Hình 3.11 Các đĩa giếng chứa tế bào MDCK cấy truyền virus thời điểm sau 24h, 48h ni cấy quan sát kính hiển vi soi ngược để quan sát động thái phát triển tế bào, so sánh với mẫu đối chứng (không lây nhiễm virus) Kết nhận cho thấy: Sau 24h cấy truyền virus, bề mặt đáy giếng định đĩa nuôi cấy loại virus xuất vùng mà tế bào bị phá hủy tạo hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE - Cytopathic effect), mẫu đối chứng (tế bào MDCK không cấy truyền virus) không xuất CPE (tế bào tiếp tục biệt hóa, phân chia với 90% tế bào sống) Bên cạnh đó, diện tích vùng có CPE quan sát kính hiển vi thời điểm sau 48h cấy truyền cho thấy vùng lan rộng số lượng CPE nhiều Các đĩa tế bào MDCK nuôi cấy virus nhuộm với gentian violet sự xuất plaque (vết tan tế bào) (Hình 3.11) A B C D E F Hình 3.11 Sự tạo thành CPE plaque nuôi cấy virus tế bào MDCK A, B, C Quan sát đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus để phát hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) kính hiển vi: Cơng thức đối chứng (tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất CPE (A); tế bào MDCK lây nhiễm virus rg-A/H5N1 clade 1.1 hệ P1 xuất CPE vị trí mũi tên màu đỏ giếng sau 24h (B) 48h (C) lây nhiễm virus D, E, F Nhuộm đĩa tế bào MDCK với gentian violet để xác định tạo thành plaque: Công thức đối chứng (đĩa tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất plaque (D); đĩa tế bào MDCK cấy truyền virus xuất plaque sau 24h (E) 48h (F) cấy truyền virus Kết nhận luận án phù hợp với nhiều công bố khoa học giới khẳng định MDCK loại tế bào thích hợp cho virus A/H5N1 lây nhiễm nhân lên theo phương thức nhiễm sinh sản (Chen et al., 2012; Milián et al., 2017) 3.6 Phân lập chủng virus kiểm tra tính ổn định di truyền giống Các chủng virus tái tổ hợp (rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c) phân lập tiếp tục cấy truyền lần liên tiếp vào trứng gà có phơi để thu nhận hệ virus P2, P3, P4 P5 Thu hoạch riêng rẽ hệ virus dịch niệu trứng để kiểm tra: (i) Hiệu giá HA hệ tương ứng với chủng; (ii) RT-PCR nhân phân đoạn gen genome virus với mồi đặc hiệu gen xác định trình tự nucleotide hai gen kháng nguyên (HA, NA) virus hệ P5; (iii) kiểm tra khả thích ứng nhân lên chủng virus hệ P5 tế bào MDCK Kết nhận thống kê Bảng 3.5 Kết xác định hiệu giá HA chủng virus dịch niệu trứng cho thấy: Trong số chủng virus, có 5/6 chủng (chủng 1.1, 2.1 3.3 clade 1.1 + chủng 1.2 3.2 clade 2.3.2.1c) có hiệu giá HA ln ổn định mức HA ≥ 1: 1024 hệ virus từ P2 đến P5 (100% dịch niệu trứng có hiệu giá HA ≥ 1: 1024) Yêu cầu chất lượng giống chủng virus ứng viên vaccine cần thể hiệu giá HA cao, mà cần đảm bảo đặc điểm di truyền biểu protein kháng nguyên đặc điểm di truyền qui định gen kháng nguyên ổn định qua hệ bị đột biến Kết kiểm tra nhanh có mặt đầy đủ phân đoạn vRNA chủng virus hệ P5 khẳng định hệ P5 chủng virus cho kết RT-PCR bước dương tính với phân đoạn vRNA Bảng 3.5 Kết kiểm tra khả thích ứng nhân lên trứng, tế bào MDCK tính ổn định di truyền chủng virus Clade Ký hiệu Tỷ lệ trứng có hiệu giá RTTrình Trì Khả chủng HA ≥ 1: 1024 PCR tự gen nh tự tạo CPE virus hệ (%) nhân HA gen NA gen MDCK P2 P3 P4 P5 1.1 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 1.1 2.1 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 3.3 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 1.2 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 2.3.2.1c 2.2 66,7 100 100 66,7 + KTĐ KTĐ + 3.2 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + (+): Sản phẩm PCR dương tính với phân đoạn gen có kích thước theo tính tốn/ có khả tạo plaque; (KTĐ): Trình tự gen khơng thay đổi Kết xác định trình tự gen H5 N1 chủng virus thuộc clade 1.1 chủng thuộc clade 2.3.2.1c hệ P5 ra: Gen kháng nguyên HA NA chủng không thay đổi so với trình tự gen HA NA thiết kế tương ứng với hai clade virus Bên cạnh đó, vị trí qui định độc lực virus trình tự gen H5 chủng rg-A/H5N1 clade 1.1 amino acid 338-344 QREGTR ↓ G, chủng rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c amino acid 338-343 QRETR ↓ G Kết nhận khẳng định chủng virus kiểm tra đặc điểm di truyền có tính kháng ngun giống chủng gốc, chứa gen H5 mã hóa protein HA khơng chứa vùng độc khơng bị lại độc Tiếp theo, để kiểm tra tính thích nghi chủng virus nhân giống tế bào MDCK, chủng virus tái tổ hợp nguồn gốc di truyền ngược thu nhận từ dịch trứng cấy truyền đĩa giếng nuôi cấy tế bào MDCK Kết nhận (Bảng 3.5) khẳng định: Các mẫu nước trứng thu hoạch sau pha loãng đệm PBS cấy truyền tế bào MDCK cho kết xuất hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE cytopathic effect) virus nhân lên phá hủy tế bào MDCK Hình ảnh thu thập trình nghiên cứu thể phần Hình 3.12 A B Hình 3.12 Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất cấy truyền virus rg-A/H5N1 vào tế bào MDCK A Quan sát CPE xuất đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus kính hiển vi quang học B Nhuộm phát CPE với gential violet Kết kiểm tra chủng virus tái tổ hợp hiệu suất nhân giống qua hệ nhân trứng, tính ổn định di truyền khả thích ứng nhân lên tế bào MDCK luận án tái tạo sàng lọc chủng virus đáp ứng yêu cầu chủng virus ứng viên vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm 3.7 Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm qui mơ phòng thí nghiệm xác định khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch vaccine Hai loại chế phẩm vaccine sản xuất từ hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1 có màu trắng đục, đồng nhất, khơng phân lớp Kết kiểm tra tiêu (hiệu giá HA, hiệu giá virus dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp trước vô hoạt sau vơ hoạt, tính vơ trùng vi khuẩn hiếu khí kỵ khí, nấm men, nấm mốc) hai chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Kiểm tra số tiêu kháng nguyên virus vaccine, tính vô hoạt vô trùng chế phẩm vaccine Nội dung kiểm tra Hiệu giá HA Hiệu giá virus (EID50/ml) Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn yếm khí Nấm Nấm men Trước vô hoạt Sau vô hoạt Trước vô hoạt Sau vô hoạt Trước vô hoạt Sau vô hoạt Trước vô hoạt Sau vô hoạt Trước vô hoạt Sau vô hoạt Trước vô hoạt Sau vô hoạt Kháng nguyên virus rg-A/H5N1 Clade 1.1 Clade 2.3.2.1c 1: 1024 1: 1024 108 108,6 - Số liệu Hình 3.13 trình bày kết xác định hiệu giá HI cá thể gà cơng thức tiêm phòng vaccine sản xuất từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Hình 3.13 Hiệu giá kháng thể (HI log2) lô gà tiêm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau tuần tiêm phòng Gà ngày tuổi tất lơ thí nghiệm trước tiêm phòng khơng có miễn dịch (huyết khơng chứa kháng thể thụ động) với virus cúm A/H5N1, thể hiệu giá kháng thể trung bình hình học (GMT - Geometric mean titer) < 1/2 log2 Sau tuần tiêm phòng, hiệu giá kháng thể 100% cá thể gà (20/20) lô tiêm chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1/ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tiêm liều tiêm liều) lô chứng dương đạt HI ≥ log2, 20/20 gà lơ chứng âm khơng có đáp ứng tạo kháng thể với HI