Nghiên cứu tạo IL 2 tái tổ hợp dùng trong điều trị bệnh ung thư

Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn viện khoa học công nghệ việt nam viện công nghệ sinh học Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp nhà nớc Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung th M số KC 04.33 Chủ nhiệm đề tài: PGs, ts trơng nam hải 6702 24/12/2007 hà nội - 2007 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bộ Khoa học Công nghệ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học Báo cáo tổng kết Đề tài độc lập cấp Nhà nớc M số: KC 04 33 Nghiên cứu tạo interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung th Chủ nhiệm Đề tài: PGS TS Trơng nam hải 01 / 2005 06 / 2007 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn B KHOA HC VIN KHOA HC V CễNG NGH V CễNG NGH VIT NAM VIN CễNG NGH SINH HC BKHCN V.CNSH BKHCN V.CNSH VKHCNVN V.CNSH BỏocỏotngktKhoahcvKthutti NGHIấN CU TO INTERLEUKIN-2 TI T HP DNG CHO IU TR UNG TH Mós: KC.04.33 Chnhimti: PGS.TS.TRNGNAMHI Cquanchtrỡ: VinCụngnghsinhhc Cquanchqun: VinKhoahcvCụngnghVitNam Thigianthchin: 01/200506/2007 H Ni - 2007 Bn bỏo cỏo vit xong ngy 15 / 12/ 2007 Ti liu ny c chun b trờn c s kt qu thc hin ti cp Nh nc, mó s KC 04 33 Mi chộp phi c s ng ý ca Vin Cụng ngh sinh hc Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Lời cảm ơn Ch nhim ti KC 04.33 xin chõn thnh cm n cỏc cỏn b nghiờn cu thuc c quan nghiờn cu khoa hc l (i) Vin Cụng ngh sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam, (ii) Trng i hc Khoa hc t nhiờn, HQGHN, B Giỏo dc v o to v (iii) Vin Kim nh Quc gia Vacxin v Sinh phm y t, B Y t ó tham gia thc hin ti Ch nhim ti KC 04.33 xin chõn thnh cỏm n Lónh o Vin Cụng ngh sinh hc, Trng i hc khoa hc t nhiờn v Vin Kim nh Quc gia Vacxin v Sinh phm y t ó ng h v to iu kin thun li v trang thit b v kinh phớ cho cỏc th cỏn b ch trỡ v tham gia thc hin ti ny Ch nhim v th cỏn b nghiờn cu thc hin ti xin chõn thnh cm n V Qun lý Khoa hc v Cụng ngh cỏc ngnh KT-KT ca B Khoa hc v Cụng ngh v Ban ch nhim chng trỡnh KC 04 ó to iu kin thun li v kinh phớ v qun lý sut thi gian thc hin ti C QUAN CH TRè TI CH NHIM TI PGS TS TRNG NAM HI Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 MC LC DANH SCH NHNG NGI CH TRè THC HIN DANH SCH NHNG NGI THAM GIA THC HIN V C QUAN PHI HP BI TểM TT 11 LI M U 15 CHNG TNG QUAN TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG V NGOI NC 17 1.1 TèNH HèNH NGHIấN CU NC NGOI 17 1.1.1 Ung th v cỏc liu phỏp cha tr ung th 17 1.1.2 Ung th thn v u hc t .18 1.1.3 Cỏc liu phỏp cha tr ung th 19 1.1.4 Interleukin-2 v ng dng iu tr ung th 19 1.2 TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG NC 23 CHNG LA CHN I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 26 2.1 MC TIấU CA TI 26 2.2 NI DUNG NGHIấN CU CN THC HIN 26 2.2.1 To dũng gen IL-2 26 2.2.2 To t bin im ca gen IL-2 .26 2.2.3 Biu hin gen IL-2 cỏc h biu hin khỏc 27 2.2.4 Nghiờn cu v ti u iu kin lờn men cho cỏc chng vi sinh vt tỏi t hp mang gen IL-2 27 2.2.5 Tỏch chit, tinh ch IL-2 t dch lờn men v nghiờn cu tớnh cht ca IL-2 27 2.2.6 ỏnh giỏ cht lng IL-2 27 2.3 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU .29 2.3.1 Vt liu 29 2.3.2 Phng phỏp nghiờn cu 30 CHNG NHNG NI DUNG V KT QU THC HIN 47 3.1 KT QU TO DềNG GEN IL-2 47 3.1.1 Tỏch chit RNA tng s t ngi v tng hp cDNA mó húa gen IL-2 .47 3.1.2 Gn sn phm PCR vo vector tỏch dũng pCR 2.1-TA 48 3.1.3 Xỏc nh trỡnh t nucleotide ca gen IL-2 49 3.1.4 Kt lun 50 3.2 KT QU TO T BIN GEN IL-2 .51 3.2.1 To t bin im lm mt im glycosyl húa v thay th Cys125 bng Ser125 51 3.2.2 Gõy hi bin Ser25 thnh Leu25 54 3.2.3 Kt lun 58 3.3 KT QU BIU HIN IL-2 TRONG CC H BIU HIN KHC NHAU 59 3.3.1 Biu hin gen lai Trx-rhIL2MN t bo vi khun E coli 59 3.3.2 Biu hin gen lai Trx-rhIL2MN nm men P pastoris .63 3.3.3 Biu hin gen rhIL2 dng riờng l nm men P pastoris 65 3.3.4 Kt lun 68 Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 3.4 KT QU NGHIấN CU IU KIN LấN MEN CC CHNG VI SINH VT TI T HP MANG GEN IL-2 BèNH TAM GIC V TRONG H THNG LấN MEN 5L, 14L .69 3.4.1 Kt qu lờn men tng hp IL-2 tỏi t hp bỡnh tam giỏc .69 3.4.2 Kt qu lờn men sn xut IL-2 tỏi t hp h thng Bioflo 110 dung tớch 5, 14L .73 3.4.3 Kt lun 74 3.5 KT QU TCH CHIT, TINH CH IL-2 T DCH LấN MEN V NGHIấN CU TNH CHT 75 3.5.1 Tỏch chit v tinh ch IL-2 bng sc ký ỏi lc 75 3.5.2 Ct protein lai bng Enterokinase v lc IL-2 qua ct sc ký ỏi lc v kim tra kh nng bt cp c hiu ca IL-2 bng Western blot 76 3.5.3 Kt lun 77 3.6 KT QU BC U V BO QUN MU IL-2 78 3.7 TH NGHIM IL-2 TI T HP TRấN Mễ HèNH T BO NUễI CY CTLL-2 79 3.7.1 iu kin ti u nhõn v bo qun dũng t bo CTLL-2 79 3.7.2 Xỏc nh hot tớnh sinh hc ca cỏc mu rhIL2MN biu hin E coli BL21 .80 3.7.3 Xỏc nh hot tớnh sinh hc ca mu rhIL2 biu hin P pastoris .82 3.7.4 Kt lun 83 3.8 TH NGHIM IL-2 TI T HP TRấN Mễ HèNH T BO NG VT 84 3.8.1 Kt qu nghiờn cu 84 3.8.2 Kt lun 97 3.9 KT QU NH GI CHT LNG IL-2 .98 3.9.1 Hiu giỏ ca sn phm IL-2 98 3.9.2 Tớnh vụ trựng ca sn phm IL-2 98 3.9.3 Tớnh an ton ca sn phm IL-2 98 3.9.4 Cht gõy st ca sn phm IL-2 98 3.9.5 Tớnh cht lý húa ca sn phm 99 3.9.6 Kt lun 99 CHNG TNG QUT HO V NH GI KT QU THU C 100 4.1 KT QU V KHOA HC 100 4.2 TNG HP CC SN PHM T C SO VI NG Kí 102 4.3 TRèNH CễNG NGH .104 4.4 KH NNG P DNG 104 4.5 O TO 105 4.6 HP TC QUC T 105 4.7 TèNH HèNH S DNG KINH PH 106 4.8 DANH SCH CC CễNG TRèNH CễNG B .106 4.9 HN CH CA TI 107 CHNG KT LUN V NGH 110 5.1 KT LUN 110 5.2 NGH 111 TI LIU THAM KHO 112 Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 MC LC CC HèNH Hỡnh S phỏt trin ca t bo ung th 18 Hỡnh Cu trỳc khụng gian ca Interleukin-2 20 Hỡnh S tỏc ng ca ProleukinRIL-2 lờn t bo ung th 23 Hỡnh Túm tt cỏc ni dung nghiờn cu theo s .28 Hỡnh in di cỏc RNA tng s tỏch t mu mụ lỏch ngi Vit Nam 47 Hỡnh Sn phm PCR nhõn gen IL-2 .48 Hỡnh Kt qu ct kim tra DNA cỏc plasmid bng enzyme EcoR I .48 Hỡnh Kt qu so sỏnh trỡnh t IL-2 nhn c vi trỡnh t trờn ngõn hng gen quc t NCBI 49 Hỡnh So sỏnh trỡnh t amino acid ó c dch mó ca gen IL-2 nhn c .50 Protein_IL-2) v trỡnh t amino acid ó ng kớ trờn ngõn hng d liu gen 50 quc t vi s ng ký NP_000577 50 Hỡnh 10 in di sn phm PCR trờn gel agarose 0,8% 52 Hỡnh 11 Kt qu ct kim tra DNA plasmid cỏc dũng bin np bng Not I v Nco I .53 Hỡnh 12 Kt qu c trỡnh t nucleotide ca dũng s cha gen rhIL2 54 Hỡnh 13 Cu trỳc ca hai plasmid pTZ600 v pTZ900 56 Hỡnh 14 S mụ t quỏ trỡnh to t bin im nh hng to gen Trx-rhIL2-MN 57 Hỡnh 15 Kt qu c trỡnh t gen ó hi bin (phi) so vi gen cha hi bin (trỏi) 58 Hỡnh 16 in di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trờn gel polyacrylamide 12,5% .60 Hỡnh 17 Western blot vi khỏng th khỏng hIL-2 61 Hỡnh 18 in di protein rhIL2 dng tan v khụng tan trờn gel polyacrylamide 12,5% 61 Hỡnh 19 nh ph MS/MS ca mnh peptide 634,4 dalton mang in tớch +2 ca Trx c nhn dng A ph TOF MS, B ph MS/MS 62 Hỡnh 20 nh ph TOF MS v MS/MS ca mnh peptide 874,6 dalton mang in tớch 2+ ca IL-2 c nhn dng A ph TOF MS, B ph MS/MS 63 Hỡnh 21 Cỏc peptide nhn dng c qua ph t bng protein .63 cú kớch thc 32 kDa .63 Hỡnh 22 nh biu hin gen Trx-rhIL2MN 64 Hỡnh 23 nh Western Blot vi khỏng th khỏng IL-2 64 Hỡnh 24 in di sn phm PCR trờn gel agarose 0,8% 66 Hỡnh 25 in di SDS-PAGE sn phm biu hin rhIL2 nm men P pastoris 67 Hỡnh 26 nh Western Blot vi khỏng th khỏng IL-2 67 Hỡnh 27 nh hng ca IPTG ti s biu hin ca protein rhIL2MN 70 Hỡnh 28 nh hng ca nng Amp ti s biu hin ca protein .71 Hỡnh 29 Kho sỏt nh hng ca nhit nuụi cy 71 Hỡnh 30 Kho sỏt thi gian thu mu biu hin .72 Hỡnh 31 Quỏ trỡnh phỏt trin ca chng E coli Bl21 v sinh tng hp Interleukin-2 73 Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Hỡnh 32 in di protein tỏi t hp Trx-rhIL2-MN trờn polyacryamide gel 12,5% .73 Hỡnh 33 in di protein tinh sch ln 755 Hỡnh 34 in di protein tinh sch ln 755 Hỡnh 35 in di sn phm protein ct bng enterokinase trờn gel polyacrylamide 12,5% 766 Hỡnh 36 Mu Trx-rhIL2MN gi dng ụng khụ sau cỏc khong thi gian 78 bo qun khỏc 78 Hỡnh 37 Hỡnh nh t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro 79 Hỡnh 38 Xỏc nh v so sỏnh hot tớnh ca cỏc mu IL-2 th nghim 81 Hỡnh 39 th minh ho s phỏt trin ca t bo CTLL-2 di tỏc ng 82 ca cỏc IL-2 khỏc (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quc, US: M) 82 Hỡnh 40 Niờm mc i trng chut nht trng bỡnh thng (Chp di kớnh lỳp) 85 Hỡnh 41 Niờm mc i trng chut nht trng b ung th .86 Hỡnh 42 Niờm mc i trng chut nht trng bỡnh thng 86 Hỡnh 43 Niờm mc i trng chut nht trng b ung th .87 Hỡnh 44 Tiờu bn hin vi mụ hc lụng nhung rut chut nht trng bỡnh thng: 87 Hỡnh 45 Tiờu bn hin vi mụ bnh hc lụng nhung rut chut nht trng b ung th di tỏc ng ca AOM: 88 Hỡnh 46 T bo biu mụ niờm mc b gii bit húa, ang chuyn dng 88 thnh ung th, cú nhõn ln v tng sc bt mu kim m (P: 100 x 10) .88 Hỡnh 47 T bo mụ liờn kt lừi lụng nhung b gii bit húa, phõn b ln xn, ang chuyn dng thnh ung th, cú nhõn ln v tng sc (P: 100 x 10) .89 Hỡnh 48 Chut nht trng Swiss kho mnh (a) v mang u bỏng Sarcoma 180 90 sau 12 ngy cy truyn (b) .90 Hỡnh 49 nh minh sinh t bo ung th Sarcoma 180: 91 Hỡnh 50 S gim sinh u bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 tỏi t hp 92 Hỡnh 51 Biu so sỏnh t s phỏt trin u gia cỏc lụ thớ nghim 92 Hỡnh 52 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 lụ i chng (x1000) 93 Hỡnh 53 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 lụ tiờm ch phm IL2.VN .93 Hỡnh 54 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca ch phm IL2.TQ 94 Hỡnh 55 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 bỡnh thng di kớnh .94 hin vi in t truyn qua (x10.000) 94 Hỡnh 56 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 VN (x10.000) .95 T bo cht theo kiu hoi th 95 Hỡnh 57 T bo u bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 TQ (x10.000) 95 Hỡnh 58 th biu din thi gian sng thờm ca cỏc lụ chut thớ nghim 96 Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 MC LC CC BNG Bng Danh sỏch nhng ngi ch trỡ thc hin Bng Kt qu tinh ch IL-2 tỏi t hp t dch thụ 77 Bng D liu kim tra hot tớnh ca cỏc mu rhIL-2MN tỏi t hp .80 Bng n v hot tớnh ca cỏc mu IL-2 th nghim 81 Bng Kh nng hot hoỏ t bo CTLL-2 phỏt trin ca mu nng th khỏc .82 Bng n v hot tớnh ca cỏc mu rhIL-2 th nghim 82 Bng S trung bỡnh ca u rut chut cỏc lụ thớ nghim 85 Bng nh lng cỏc u bỏng Sarcoma 180 m chut thớ nghim 90 Bng Tỏc ng ca ch phm IL2-TQ v IL2-VN lờn thi gian sng thờm .96 ca chut nht trng Swiss mang u bỏng Sarcoma 180 96 Bng 10 Cỏc dũng gen v dũng vector to ca ti 102 Bng 11 Sn phm khoa hc ca ti 102 Bng 12 Danh sỏch cỏc hc viờn c o to 105 Bng 13 Danh sỏch cỏc cỏn b c nõng cao trỡnh .105 Bng 14 Danh sỏch cỏc c quan hp tỏc quc t 105 Bng 15 Kinh phớ phõn b cho cỏc hng mc 106 Bng 16 Túm tt cỏc ni dung cụng vic thc hin v ni dung xin iu chnh 108 Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 DANH SCH NHNG NGI CH TRè THC HIN S TT H v tờn Hc hm, hc v PGS TS Trng Nam Hi PGS TS Phan Vn Chi TS Phm Th Bớch Hp PGS TS Khc Hiu TS inh Duy Khỏng PGS TS Trn Cụng Yờn GS TS Nguyn ỡnh Bng Trn Bỡnh Duyờn GS TS Nguyn Bỏ c Chc v, n v Phú Vin trng, Trng phũng K thut di truyn, Vin CNSH Trỏch nhim ti Chng mc bỏo cỏo Ch nhim ti Ton b ni Ch mc dung bỏo cỏo Phú Vin trng, Trng phũng Hoỏ sinh protein, Ch mc Vin CNSH Phú Phũng Cụng ngh lờn men Vin CNSH Trng phũng T bo ng vt, Vin CNSH Trng phũng Vi sinh phõn t, Vin CNSH Trng i hc khoa hc t nhiờn, HQGHN Trung tõm Quc gia Kim nh Vaccin v sinh phm y hc Cụng ty CP dc TW Mediplantex Bnh vin K H Ni Ch mc Ch mc Ch mc Ch mc Ch trỡ ti nhỏnh Ch trỡ ti Cha thc nhỏnh hin Ch trỡ ti Cha thc nhỏnh hin Bng Danh sỏch nhng ngi ch trỡ thc hin Taihin: lieu01/2005 chia se mien Thi gian thc 06/2007phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Bng 10 Sn phm khoa hc ca ti TT Tờn sn phm ng ký Quy trỡnh to chng E coli cú kh nng tng hp IL-2 tỏi t hp Quy trỡnh to chng P pastoris cú kh nng tng hp IL-2 tỏi t hp dng ngoi bo S lng 01 01 Cỏc thụng s v iu kin cm ng biu hin gen IL-2 E coli Quy trỡnh biu hin gen IL-2 E coli 01 Quy trỡnh biu hin gen IL-2 P pastoris 01 Quy trỡnh lờn men chng E coli tỏi t hp 01 Quy trỡnh lờn men chng P pastoris tỏi t hp 01 K hoch Kt qu t c Quy trỡnh to chng 01 quy trỡnh to chng E coli biu E coli t 40 g hin gen IL-2 t khong 90 mg/L ILprotein/lit 2, cao gp 2000 ln so vi d kin Quy trỡnh to chng P pastoris t 50 g protein tỏi t hp/lit Quy trỡnh tỏch chit v tinh ch protein tỏi t hp t chng E coli Quy trỡnh cụng ngh tng hp sn xut interleukin-2 Ch tiờu kinh t - k thut 01 01 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 01 quy trỡnh to chng P pastoris tỏi t hp cú kh nng tng hp IL-2 t khong mg/L, cao gp 100 ln so vi d kin 01 quy trỡnh biu hin gen IL-2 E coli vi cỏc iu kin thớch hp nh cm ng vi nng IPTG mM, nhit nuụi cy 30oC v thi gian thu mu sau gi cm ng 01 quy trỡnh biu hin gen IL-2 Cỏc thụng s v iu P pastoris vi iu kin cm ng kin cm ng biu biu hin nhit 300C, nng hin gen IL-2 methanol 0,5% v thu mu sau 72 P pastoris gi cm ng 01 quy trỡnh lờn men chng E coli tỏi t hp cha gen IL-2 h thng lờn men Bioflo110 dung tớch Cỏc thụng s v L v 14 L vi cỏc thụng s ti u iu kin lờn men cho quỏ trỡnh lờn men nh pH mụi ti u i vi trng 6,0; nhit 37oC; sc khớ chng E coli tỏi t 0,5 vvm (lớt khớ/ lớt mụi trng/ hp phỳt); tc khuy 200 vũng/ phỳt, nhit cm ng l 300C OD bt u t 0,6 01 quy trỡnh lờn men chng P pastoris tỏi t hp cha gen IL-2 h thng lờn men Bioflo110 Cỏc thụng s v dung tớch L v 14 L vi cỏc iu kin lờn men thụng s ti u cho quỏ trỡnh lờn ti u i vi men nh pH mụi trng 6,0; nhit chng P pastoris 30 oC; sc khớ vvm (lớt khớ/ lớt tỏi t hp mụi trng/ phỳt); tc khuy 200 vũng/ phỳt, nhit cm ng l 300C OD bt u t Quy trỡnh tỏch chit 01 quy trỡnh tỏch chit v tinh ch v tinh ch protein protein tỏi t hp t chng E coli t tỏi t hp sch tinh sch 99% v c hiu vi v c hiu cao khỏng th khỏng IL-2 ca ngi Quy trỡnh tng th 01 quy trỡnh tng th sn xut IL-2 v sn xut IL-2 tỏi tỏi t hp t bo E coli v P t hp pastoris phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 32 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 10 Phng phỏp nghiờn cu tỏc ng ca IL-2 tỏi t hp lờn ng vt thc nghim v trờn t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro 01 ỏnh giỏ cht lng IL-2 tỏi t hp theo tiờu chun quc t Cỏc thụng s v tỏc dng ca IL-2 i vi ng vt thc nghim 01 phng phỏp nghiờn cu tỏc ng ca IL-2 tỏi t hp lờn ng vt thc nghim v 01 phng phỏp nghiờn cu tỏc ng ca IL-2 tỏi t hp trờn t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro Ch phm IL-2 an ton, khụng cú cht gõy st, m bo iu kin vụ trựng Trung tõm Quc gia kim nh vacxin ó ỏnh giỏ ch phm IL-2 t tiờu chun v hiu giỏ, tớnh vụ trựng, tớnh an ton, t yờu cu v tớnh cht lý húa v hm lng cht gõy st ngng cho phộp 11 Interleukin-2 tỏi t hp dng t bin thng phm Proleukin-2 tinh khit t 99% Liu lng th nghim vi 10 200 mg bnh nhõn ung th ng tiờu húa giai on mun pha II 12 Chng E coli mang gen IL-2 chng 40 g IL-2/L 13 Chng P pastoris mang gen IL-2 chng 50 g IL-2/L 14 o to 15 Bi bỏo 16 Tng kt v ỏnh giỏ ti ó tng hp 200 mg IL-2 tỏi t hp t tinh khit 99% a i th nghim trờn ng vt thc nghim, trờn t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro v ỏnh giỏ cht lng IL-2 01 chng E coli mang gen IL-2 t hiu sut 90 mg IL-2/L 01 chng P pastoris mang gen IL2 t hiu sut mg IL-2/L, tng 100 ln so vi ng ký - thc s (s bo v nm 02 thc s 2007 v 2008) 06 c nhõn - c nhõn - k thut viờn nõng cao trỡnh - Trong nc: ó ng bi, s Trong nc: 3-5 bi ng thờm bi v ó ng ký Nc ngoi: 1-2 bi Bng c quyn gii phỏp hu ớch Bỏo cỏo tng kt ti ó c c hi ng khoa hi ng nghim thu cp c s hc chp nhn chp nhn 4.3 TRèNH CễNG NGH Trong quỏ trỡnh thc hin ti trỡnh cụng ngh v phõn lp v biu hin gen cỏc h biu hin khỏc nh E coli, nm men P pastoris ca cỏn b tham gia ti ó t trỡnh quc t Ln u tiờn Vit Nam ó hon thin c cỏc quy trỡnh biu hin, lờn men, tỏch chit, tinh ch IL-2 tỏi t hp t cỏc chng vi khun v nm men õy l c s quan trng xõy dng c quy trỡnh cụng ngh tng hp sn xut IL-2 tin ti phc v cho vic sn xut ch phm IL-2 tỏi t hp trờn quy mụ cụng nghip nc ta Cỏc phng phỏp nghiờn cu s dng ti t khõu phõn lp gen, n biu hin, thu hi v tinh ch, nghiờn cu tỏc ng ca IL-2 tỏi t hp lờn mụ hỡnh ng vt thớ nghim v trờn t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro u t trỡnh quc t, cỏc s liu, hỡnh nh v bng biu bỏo cỏo c a l ỏng tin cy lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 33 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Cỏc kt qu nghiờn cu thu c ca ti khng nh trỡnh ca cỏc cỏn b nghiờn cu khoa hc nc ta trờn lnh vc cụng ngh sinh hc hin i ngang tm vi cỏc nc khu vc v trờn th gii Cỏc kt qu khoa hc ca ti khụng ch cú ý ngha khoa hc m cũn cú ý ngha thc tin cao, gúp phn phc v cho nn y hc ca Vit Nam tng lai 4.4 KH NNG P DNG Ch phm Interleukin-2 ti to ti Vin CNSH ó c chng minh l cú hot tớnh tng ng vi sn phm nc ngoi iu ny m trin vng sn xut v ng dng ch phm ny vic iu tr bnh ung th i vi cỏc bnh nhõn Vit Nam 4.5 O TO Bng 11 Danh sỏch cỏc hc viờn c o to TT Nm H v tờn Tờn lun ỏn Bc o to o to thc s 20052007 Lờ Th Thanh 2006V Minh c 2008 20063 ng Trn Hong 2008 o to c nhõn 2006 Nguyn Lờ Hi Ly 2006 V ỡnh Quang 2006 Kiu Th Thu H TT Gõy to mụ hỡnh ung th ng rut chut nht trng dũng Swiss bng húa cht v nghiờn cu mụ bnh hc ca nú Nghiờn cu biu hin Interleukin-2 h nm men P pastoris GS115 Nghiờn cu biu hin Interleukin-2 E coli BL21 (DE3) Nghiờn cu iu kin lờn men chng E coli tỏi t hp dựng cho sn xut Interleukin-2 ca ngi Gõy u thc nghim ng rut trờn chut bng húa cht Azoxymethane S bin i cu trỳc niờm mc rut non chut nht trng Swiss di tỏc ng ca húa cht Azoxymethane v hiu ng khỏng u ca ch phm Interleukin-2 tỏi t hp Bng 12 Danh sỏch cỏc cỏn b c nõng cao trỡnh Thi gian H v tờn Ni dung o to o to Nõng cao k thut lm 2005-2007 Nguyn Th Nga Bioassay v nuụi cy t bo ng vt invitro Nõng cao k thut lm 2005-2007 Nguyn Th Trang Bioassay v nuụi cy t bo ng vt invitro lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Thc s Thc s Thc s C nhõn C nhõn C nhõn C quan Vin CNSH Vin CNSH 34 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 4.6 HP TC QUC T Bng 13 Danh sỏch cỏc c quan hp tỏc quc t C quan Tờn i tỏc Ni lai tỏc Vin CNSH - Biomedical Center, - Hp tỏc nghiờn cu cụng ngh lờn Fermentation Pilot Plant of men cỏc chng vi sinh tỏi t hp v Uppsala University, Sweden thu hi sn phm Vin CNSH GS J.M Pezzuto, trng i - Cung cp dũng t bo CTLL-2 hc Hawaii, Hoa k th nghim hot tớnh sinh hc ca IL2 tỏi t hp 4.7 TèNH HèNH S DNG KINH PH Tng kinh phớ SNKH: 100 000 000 ng (Hai t mt trm triu ng) Kinh phớ ti ó nhn: - Nm 2005: 450 000 000 ng - Thỏng 1/ 2006 - 6/2007: 550 000 000 ng Tng kinh phớ ó quyt toỏn: 000 000 000 ng Bng 14 Kinh phớ phõn b cho cỏc hng mc STT Mc Hng mc chi S tin(ng) Ghi chỳ 114 (*) Thuờ khoỏn chuyờn mụn 493 000 000 (*) theo biu H5 s CV 102+119 Nguyờn vt liu + Nng lng 312 904 700 204/cnsh ngy 7/6/2007 v 117 Sa cha nh 10 500 000 quyt nh s 1202/Q145 Thit b mỏy múc 21 000 000 BKHCN ngy 03/7/07 102+111+112(*) Chi phớ khỏc 162 595 300 +115+134 Tng 000 000 000 4.8 DANH SCH CC CễNG TRèNH CễNG B ng Trn Hong, V Minh c, Phựng Thu Nguyt, Trng Nam Hi (2005), Biu hin gen Interleukin-2 ca ngi b t bin ti cỏc im glycosyl húa v gc Cys 125 E coli Tp Cụng ngh sinh hc 3(2): 149-154 ng Trn Hong, Bựi Th Huyn, V Minh c, ng Thnh Nam, Trn Th Hng, Nguyn Hng Thanh, Phan Vn Chi, Trng Nam Hi (2005), Biu hin gen mó húa Interleukin-2 ca ngi (rh-IL2MN) E coli bng h pET32 v nhn dng protein tỏi t hp bng phng phỏp ph Tp Cụng ngh sinh hc 3(4): 439-444 V Minh c, Nguyn Tin Minh, ng Trn Hong, Trn Th Hng, Nguyn Hng Thanh, inh Duy Khỏng, Trng Nam Hi (2005) Gõy hi bin thay th Ser25 thnh Leu v biu hin protein lai Thioredoxin rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) P pastoris Tp Cụng ngh sinh hc 3(4): 445-452 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 35 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Trn Th Hng, Nguyn Hng Thanh, ng Trn Hong, V Minh c, Phm Th Bớch Hp, Trng Nam Hi (2006) Nghiờn cu iu kin biu hin Interleukin-2 ca ngi chng E coli BL21 Tp Cụng ngh sinh hc 4(2): 1-8 Nguyn Nam Long, Nguyn Bớch Nhi, Phan Vn Chi (2005) Tỏch dũng gen mó húa Interleukin-2 ca ngi Tp Y hc Vit Nam, 310 (5): 26-30 Th Tho, Th Phng, V Minh c, ng Trn Hong, Trng Nam Hi (2006) Xỏc nh hot tớnh sinh hc ca Interleukin (IL-2) tỏi t hp bng phộp th sinh hc trờn t bo CTLL2 ó gi ng Tp Cụng ngh sinh hc Trn Cụng Yờn, Nguyn Th Qu, Lờ Th Thanh, Bựi Th Võn Khỏnh, Kiu Th Thu H, (2007) Nghiờn cu hot tớnh chng ung th ca Interleukin-2 tỏi t hp trờn mụ hỡnh ung th thc nghim in vivo S gi ng Sinh hc s c bit v Hi ngh Khoa hc Nhng nghiờn cu c bn Khoa hc S sng nm 2007 ó ng ký Bng c quyn gii phỏp hu ớch v Chng vi khun tỏi t hp cú kh nng tng hp Interleukin-2 ca ngi ti Cc s hu trớ tu, B Khoa hc v Cụng ngh (thỏng 10/2006) 4.9 HN CH CA TI Vi s c gng n lc ca th cỏc cỏn b nghiờn cu, ti ó hon thnh c hu ht cỏc ni dung nghiờn cu thuyt minh v hp ng nghiờn cu Cỏc kt qu thu c ca ti cú ý ngha quan trng vic trin khai sn xut v ng dng ch phm IL-2 iu tr cho cỏc bnh nhõn ung th Tuy nhiờn, thi gian quỏ ngn v kinh phớ c cung cp rt mun nờn vic thc hin ti ó gp mt s khú khn nh hng n vic thc hin cỏc ni dung ó ng ký Vỡ vy, mt s ni dung ca ti ó c iu chnh so vi ng ký ban u Kt qu t c ca ti mi ch l bc u, vỡ vy mt s ni dung ca ti cn phi c tip tc nghiờn cu hon thin Di õy l bng túm tt cỏc ni dung ó thc hin theo ng ký ban u v mt s ni dung xin iu chnh Bng 15 Túm tt cỏc ni dung cụng vic thc hin v ni dung xin iu chnh Ni dung ng ký TT Cỏc ni dung xin iu chnh (theo thuyt minh ti 01/2005) To dũng gen IL-2 Khụng To t bin gen IL-2 Khụng Biu hin gen IL-2 cỏc h biu hin khỏc Khụng Nghiờn cu iu kin lờn men cỏc chng vi sinh Khụng vt tỏi t hp mang gen IL-2 quy mụ v 14 lớt Tỏch chit v tinh ch IL-2 t dch lờn men v Khụng nghiờn cu tớnh cht ca nú Xõy dng cụng ngh thu hi, bo qun v úng Xin iu chnh cha thc hin gúi ch phm IL-2 Th nghim IL-2 trờn mụ hỡnh t bo nuụi cy Khụng CTLL-2 v ng vt thớ nghim ỏnh giỏ cht lng IL-2 theo tiờu chun quc t Khụng Nghiờn cu v th nghim kh nng s dng IL9 tỏi t hp iu tr cỏc bnh ung th Xin iu chnh cha thc hin ng tiờu hoỏ giai on mun ti bnh vin K lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 36 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Trong quỏ trỡnh thc hin ti chỳng tụi cú ngh iu chnh mt s ni dung ng ký ban u, c th nh sau: - Khụng thc hin tip phn to chng nm men mang gen Trx-rhIL2MN: lý l sau biu hin nm men protein lai Trx-rhIL2MN b protease ca t bo nm men phõn hy ú khụng th s dng chng nm men ny tng hp Il-2 v thc hin cỏc bc tip theo nh lờn men v tinh ch sn phm nhn c S iu chnh ny ó c B KH&CN chp thun t kim tra nh k vo cui nm 2005 (Bỏo cỏo nh k HD5 (k I) ngy 27/11/2005 ó c B KH&CN phờ duyt) - Do thi gian thc hin ti ch cú 30 thỏng nờn ti cha kp thc hin trn ni dung l Xõy dng cụng ngh thu hi, bo qun v úng gúi ch phm IL-2 v Nghiờn cu v th nghim kh nng s dng IL-2 tỏi t hp iu tr cỏc bnh ung th ng tiờu hoỏ giai on mun ti bnh vin K H s xin phộp Hi ng Y c ca B Y t v th nghim ch phm IL-2 trờn cỏc bnh nhõn ũi hi thi gian rt lõu, ớt nht l nm nờn ti khụng th thc hin kp Vic iu chnh ny ó c B KH&CN chp nhn (Quyt nh s 1202/Q-BKHCN ký ngy 03/07/2007 ca B KH&CN) Phn kinh phớ (100 triu ng) thc hin cỏc ni dung ny ó c hon tr li ngõn sỏch - Theo k hoch ti nh t chc i tham quan v hc ti CHLB c, nhng ó t chc i sang Cụng ty sn xut IL-2 ti thnh ph Thm Dng, Tnh Liờu Ninh Trung Quc B KH&CN ó chp thun iu chnh ny (Quyt nh s 1202/ Q-BKHCN ký ngy 03/07/2007 ca B KH&CN) lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 37 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 CHNG KT LUN V NGH 5.1 KT LUN ti ó t c cỏc kt qu sau: - Phõn lp c gen mó húa cho protein IL-2 ngi t ARN tng s tỏch t t bo lỏch ngi bng k thut RT-PCR - ó thnh cụng vic to gen IL-2 t bin mt kh nng glycosyl hoỏ ti u N v mt gc Cys v trớ 125 hn ch vic to sai cu disulfide phõn t Il-2 Hi bin thnh cụng t bin Ser v trớ 25 thnh Leu dũng gen IL-2 phõn lp t bnh nhõn Vit Nam - Thit k thnh cụng vector pET32-rhIL2MN cha gen IL-2 t bin biu hin E coli - Thit k thnh cụng vect pPIC-rhIL2MN biu hin IL-2 dng riờng l nm men P pastoris - ó to thnh cụng chng E coli tỏi t hp cú kh nng biu hin gen rhIL2MN vi lng IL-2 t khong 90 mg/L, cao gp 2000 ln so vi d kin - ó to thnh cụng chng P pastoris tỏi t hp cú kh nng tng hp rhIL2MN t khong mg/L, cao gp 100 ln so vi d kin - ó xõy dng quy trỡnh biu hin IL-2 tỏi t hp E coli v P pastorisvi qui mụ lờn men dung tớch 5L v 14L vi cỏc iu kin thớch hp cho quỏ trỡnh lờn men - ó xõy dng quy trỡnh tỏch chit v tinh ch protein tỏi t hp t chng E coli t tinh sch cao (99%) v c hiu vi khỏng th khỏng IL-2 ca ngi Ch phm IL-2 nhn c ỏp ng c cỏc iu kin kim nh v cú hot tớnh tng ng vi sn phm ca nc ngoi - ó xõy dng c phng phỏp nghiờn cu tỏc ng ca IL-2 tỏi t hp lờn ng vt thc nghim v trờn t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro - ti ó cụng b c bi bỏo, bi ó gi ti cỏc khoa hc v s c ng thi gian ti ti ó tin hnh ng ký Bng c quyn gii phỏp hu ớch v Chng vi khun tỏi t hp cú kh nng tng hp Interleukin-2 ca ngi thỏng 10 nm 2006 v ó nhn c cụng ca Cc Sỏng ch nhn n xem xột - ti ó gúp phn vic o to Thc s khoa hc, C nhõn cụng ngh sinh hc v nghiờn cu viờn c nõng cao tay ngh 5.2 NGH cú th tip tc phỏt trin tip cỏc kt qu nghiờn cu, chỳng tụi xut mt s kin ngh sau: 01 Tip tc hon thin v nõng cao hiu qu quy trỡnh sn xut IL-2 tỏi t hp cỏc h biu hin E coli v t bo nm men P pastoris trờn quy mụ ln hn lm c s cho vic trin khai sn xut sn phm ny v ng dng thc tin 02 Tin hnh tip tc cỏc ni dung nghiờn cu l i) Cụng ngh thu hi, bo qun, úng gúi IL-2, ii) Th nghim lõm sng ch phm IL-2 tỏi t hp trờn bnh nhõn ung th ng tiờu húa giai on mun ti bnh vin K giai on tip theo lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 38 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 TI LIU THAM KHO TI LIU TING VIT 10 Nguyn Thanh m (2004) Min dch iu tr bnh ung th Nh xut bn Y hc Nguyn Vn t, Nguyn Thanh Thu, Nguyn Huy Hong, Nụng Vn Hi, Lờ Trn Bỡnh, Trng Nam Hi, (2000) Biu hin gien mó hoỏ cho protein bt hot ribụxụm ca mp ng nm men P pastoris Bỏo cỏo khoa hc Hi ngh Sinh hc Quc Gia, 44-47 Nguyn Th Trung, Th Huyn, Nguyn Thanh Thu, Phm Thuý Hng, Trng Nam Hi, (2002) Biu hin gen mó húa cho -amylaza t ht u tng nm men P pastoris Tp ch Khoa hc v Cng ngh, 40(3): 14-19 H Vn Huõn, Lờ Th Bớch Tho, Phan Vn Chi (2003) Biu hin v tinh ch protein lai HSP2 Y hc Vit Nam 284(5): tr 6-9 Nguyn Thuý H, Nguyn Bớch Nhi, Khc Hiu & Phan Vn Chi (2003) Kh nng c ch cỏc dũng t bo ung th nuụi cy in vitro ca Trichobakin tỏi t hp Y hc Vit Nam 284(5): 26-30 Nguyn Nam Long, Nguyn Bớch Nhi, Phan Vn Chi (2005) Tỏch dũng gen mó húa Interleukin-2 ca ngi Tp Y hc Vit Nam 310(5): 26-30 ng Trn Hong, V Minh c, Phựng Thu Nguyt, Trng Nam Hi (2005) Biu hin gen Interleukin-2 ca ngi rhIL2 MM b t bin ti cỏc im glycosyl húa v gc Cys 125 E coli Tp Cụng ngh Sinh hc 3(2): 149-154 ng Trn Hong, Bựi Th Huyn, V Minh c, ng Thnh Nam, Trn Th Hng, Nguyn Hng Thanh, Phan Vn Chi, Trng Nam Hi (2005) Biu hin gen mó húa Interleukin-2 ca ngi (rh-IL2 MN) E colibng h pET32 v nhn dng protein tỏi t hp bng phng phỏp ph Tp rhIL2gh Sinh hc 3(4): 439-444 V Minh c, Nguyn Tin Minh, ng Trn Hong, Trn Th Hng, Nguyn Hng Thanh, inh Duy Khỏng, Trng Nam Hi (2005) Gõy hi bin thay th Ser 25 thnh Leu v biu hin protein dung hp thioredoxin-rhInterleukin-2 (Trx-rhIL2MN) P pastoris Tp Cụng ngh Sinh hc 3(4): 445-452 Trn Cụng Yờn, Nguyn Th Qu (2001) Mt chng ng nghiờn cu ung th thc nghim (1987-2001), Hi tho Quc t Sinh hc, H ni thỏng 7/2001 285-290 TI LIU TING ANH Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, Baldini E, Mereu C, VeRNA A, et al (1994) Biologic and clinical effects of continuous infusion interleukin-2 in patients with non-small cell lung cancer Cancer 73:13531360 Armstrong A, Eaton D, Ewing J (2001) Cellular immuno therapy for cancer Br Med J 323:12891293 Atzpodien J, Kirchner H (1990) Cancer, cytokine, and toxic cells: Interleukin-2 in the immuno therapy of human neoplasms Klin Wochenscher 68(1): 1-11 Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M (2001) IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial Br J Cancer 19;85(8):1130-6 Atzpodien J, Kirchner H, Illiger HJ, Metzner B, Ukena D, Schott H, Funke PJ, Gramatzki M, Jurgenson S, Wandert T, Patzelt T, Reitz M (2001) IL-2 in combination with IFN- alpha and 5-FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma: long-term results of a controlled randomized clinical trial Br J Cancer 19;85(8): 1130-6 Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotech 10:411-421 Bayer AL, Yu A, Adeegbe D, Malek TR (2005) Essential role for interleukin -2 for CD4+ CD25+ T regulatory cell development during the neonatal period J Exp Med 201: 769-777 Bazan, J.F (1992) Unraveling the structure of IL-2 Science 257: 410413 Bergmann L (1990) The clinical significance of interleukin-2 Onkologie, 13(6): 416-422 10 Bordin V, Giani L, Meregalli S, Bukovec R, Vaghi MM, Mandala M, Paolorossi F, Ardizzoia A, Tancini G, BRNAi S, Frigerio F, Fumagalli L, Bordoni A, Valsuani G, Di Felice G, Lissoni P (2000) Five-year survival results of subcutaneous low-dose immuno therapy with interleukin-2 alone in metastatic renal cell cancer patients Urol Int 64(1):3-8 11 Buzio C, Andrulli S, Santi R, Pavone L, Passalacqua R, Potenzoni D, Ferrozzi F, Giacosa R, Vaglio A (2001) Long-term immuno therapy with low-dose interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma Cancer 1;92(9):2286-2296 12 Brivio F, Lissoni P, Tisi E, Erba L, BRNAi S, Tancini G, et al.(1992) Effects of a preoperative therapy with interleukin-2 on surgeryinduced lymphocytopenia in cancer patients Oncology 49:215218 13 Buccheri G, Marino P, Preatoni A, Ferrigno D, Moroni GA (1991) Soluble interleukin-2 receptor in lung cancer An indirect marker of tumor activity Chest 99:14331437 14 Bukowski RM (1997) Natural history and therapy of metastatic renal cell carcinoma: the role of interleukin-2 Cancer 80:11981220 15 Chomczynski P, Sacchi N (1987) Anal Biochem 162:156160 16 Degrave W, Tavernier J, Duerinck F, Plaetinck G, Devos R, Fiers W (1983) Cloning and structure of the human interleukin chromosomal gen EMBO J 2(12): 2349- 2353 17 Devos R, Plaetinck G, Cheroute H, Simons H, Degrave W, Tavernier J, Remaut E, Fiers W (1983) Molecular cloning of human interleukin cDNA and its expression in E coli Nucleic Acids Res 11: 4307-4323 18 Dillman R.O., Church C., Barth N.M., Oldham R.K and Wiemann M.C (1997) Long-term survival after continuous infusion interleukin-2 Cancer Biother Radiopharm 12(4):243-248 19 Dore JM, Gras E, Wijdenes (1997) Expression and activity of a recombinant chimeric protein composed of pokeweed antiviral protein and of human interleukin-2 FEBS Letters 402(1): 50-52 20 De Vita F, Turitto G, Di Gracia M, Frattolillo A, Catalano G (1998) Analysis of interleukin-2/interleukin-2 receptor system in advanced non-small cell lung cancer Tumori 84:3338 21 Dutcher JP, Creekmore S, Weiss GR, Margolin K, Markowitz AB, Roper M, et al.(1989) A phase II study of interleukin-2 and LAK cells in patients with metastatic malignant melanoma J Clin Oncol 7:477485 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 39 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 22 Fujita T, Takaoka C, Matsui H, Taniguchi T (1983) Structure of the human interleukin gen Proc Natl Acad Sci 80:7437-7441 23 Fukushima K, Yamashita K (2001) Interleukin-2 carbonhydrate recognition modulates CTLL-2 cell proliferation J Biol Chem 276(10): 7351-7356 24 Fisher RI, Rosenberg SA, Fyfe G (2000) Long-term survival update for high-dose recombinant interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma Cancer J Sci Am (Suppl 1):S55S57 25 Gaffen SL, Liu KD (2004) Overview of interleukin -2 function, production and clinical applications Cytokine 28: 109- 123 26 Gez E, Rubinov R, Gaitini D, Meretyk S, Best LA, Native O, Stein A, Erlich N, Beny A, Zidan J, Haim N, Kuten A (2002) Interleukin-2, interferon-alpha, 5-fluorouracil, and vinblastine in the treatment of metastatic renal cell carcinoma: a prospective phase II study: the experience of Rambam and Lin Medical Centers 1996-2000 Cancer 15;95(8):1644-1649 27 http://www.aidsmeds.com/news/ 28 http://www.cytoshop.com/ 29 http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html, 30 http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html 31 http://www.proleukin.com/index.html 32 http://www.proleukin.com/index.html 33 Javier CS, Foucras G, Guo L, Chiodetti L, Young HA, Jane HL, Zhu J, Paul WE (2004) Interleukin plays a central role in Th2 differentiation PNAS 101(11): 3880-3885 34 Jansen RL, Slingerland R, Goey SH, Franks CR, Bolhuis RL, Stoter G (1992) Interleukin-2 and interferon-alpha in the treatment of patients with advanced non small cell lung cancer J Immunol, 12:7073 35 Ju G et al (1987) Structure-function analysis of human interleukin J Bio Chem 262(12): 5723-5731 36 Kimura H, Yamaguchi Y (1995) Adjuvant immuno therapy with interleukin-2 and lymphokine-activated killer cells after noncurative resection of primary lung cancer Lung Cancer, 13:3144 37 Kradin RL, Kurnick JT, Lazarus DS, Preffer FI, Dubinett SM, Pinto CE, et al (1989); Tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in treatment of advanced cancer Lancet 18:577580 38 Krastev Z, Koltchakov V, Tomov B, Koten JW (2003), Non-melanoma and non-renal cell carcinoma malignancies treated with interleukin-2 Hepatogastroenterology 50:10061016 39 Liang SM, Lee N, Zoon KC, Manischewitz JF, Chollet A, Liang CM, Quinnan GV (1988) Biological characterization of human interleukin mutant proteins J Biol Chem 263(10): 4768-4772 40 Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B (1985) Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2 J Biol Chem 261(1): 334-337 41 Liu Y Liu Y, Su C, Hu YH, Ouyang KQ, Cai SX (2005) Studies on fermentation conditions and purification of mutant human interleukin -2 expressed in P pastoris Sheng Wu Gong Cheng Xued Bao 21(3): 430-434 42 Legha SS, Buzaid AC (1993) Role of recombinant interleukin-2 in combination with interferon and chemotherapy in the treatment of advanced melanoma Semin Oncol 2:2732 43 Lissoni P, BRNAi S, Ardizzoia A, Paolorossi F, Tisi E, Crispino S, Tancini G (1992) Intracavitary administration of interleukin-2 as palliative therapy for neoplastic effusions Tumori 78:118120 44 Lissoni P, BRNAi S, Rovelli F, Tancini G (1991) Lower survival in metastatic cancer patients with reduced interleuin-2 blood concentrations Preliminary report Oncology 48:125127 45 Lissoni P, BRNAi S, Tancini G, Ardizzoia A, Ricci G, Aldeghi R, et al (1994), A randomized study with subcutaneous low-dose interleukin-2 alone vs interleukin-2 plus the pineal neurohormone melatonin in advanced solid neoplasms other than renal cancer and melanoma Br J Cancer 69:196199 46 Lissoni P, Bordin M, Vaghi L, Fumagalli L, Bordoni A, Mengo S, et al (2002), Ten-year survival results in metastatic renal cell carcinoma patients treated with monoimmuno therapy with subcutaneous low-dose interleukin-2 Anticancer Res 22:10611064 47 Lissoni P, Mandala M, Curigliano G, Ferretti G, Moro C, Ardizzoia A, et al (2001), Progress report on the palliative therapy of 100 patients with neoplastic effusions by intracavitary low-dose interleukin-2 Oncology 60:308312 48 Lissoni P, Meregalli S, Fossati V, Paolorossi F, BRNAi S, Tancini G, Frigerio F (1994) A randomized study of immuno therapy with low-dose subcutaneous interleukin-2 plus melatonin vs chemotherapy with cisplatin and etoposide as first-line therapy for advanced nonsmall cell lung cancer Tumori 80:464467 49 McDermott D F, Atkins M B (2004) Application of IL-2 and other cytokines in renal cancer Expert Opin Bio Ther 4(4): 455-468 50 Mantovani G, Maccio A, Mulas C, Massa E, Madeddu C, Mura L, et al (2002) Dose-intense phase II study of weekly cisplatin and epidoxorubicin plus medroxyprogesterone acetate and recombinant interleukin-2 in stage IIIB-IV non-small cell lung cancer Oncology Rep 9:661670 51 Masotti A, Fumagalli L, Morandini GC (1997) Intrapleural administration of recombinant interleukin-2 in non-small cell lung cancer with neoplastic pleural effusion Monaldi Arch Chest Dis 52:225-228 52 Melioli G, Ratto GB, Ponte M, Guastella M, Semino C, Fantino G, et al (1999) Treatment of stage IIIB non-small-cell lung cancer with surgery followed by infusion of tumor infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2: a pilot study J Immunology 1996; 19:224230 53 Mier JW, Atkins MB (2001) Pharmacology of cancer biotherapeutics Interleukin-2 Cancer principles and practice of oncology, 6th edition Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; pp 471477 54 Nelson B H, Willerford D M (1998) Biology of the interleukin-2 receptor Adv Immunol 70: 1-81 55 Neri B, Doni L, Gemelli MT, Fulignati C, Turrini M, Di Cello V, Dominici A, Maleci M, Mottola A, Ponchietti R, Raugei A, Valsuani G, Cini G (2002) Phase II trial of weekly intravenous gemcitabine administration with interferon and interleukin-2 immuno therapy for metastatic renal cell cancer J Urol 168(3):956-958 56 Naumnik W, Chyczewska E (2001) The clinical significance of serum soluble interleukin receptor (s IL-2R) concentration in lung cancer Folia Histochem Cytobiol 39:185186 57 Parkinson D, Abrams J, Wiernick P, Rayner AA, Margolin KA, Van Echo DA, et al.(1990) Interleukin-2 therapy in patients with metastatic malignant melanoma: a phase II study J Clin Oncol 1990; 8:16501656 58 Pectasides D, Varthalitis J, Kostopoulou M, Mylonakis A, Triantaphyllis D, Papadopoulou M, Dimitriadis M, Athanassiou A lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 40 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 (1998) An outpatient phase II study of subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha-2b in combination with intravenous vinblastine in metastatic renal cell cancer Oncology 55(1):10-15 59 Ravaud A, Trufflandier N, Ferriere JM, Debled M, Palussiere J, Cany L, Gaston R, Mathoulin-Pelissier S, Bui BN (2003) Subcutaneous interleukin-2, interferon alpha-2b and 5-fluorouracil in metastatic renal cell carcinoma as second-line treatment after failure of previous immuno therapy: a phase II trial Br J Cancer 15;89(12):2213-8 60 Robb RJ, Kutny RM, Panico M, Morris HR, Chowdhry V (1984) Amino acid sequence and post-translational modification of human interleukin Proc Nat Acad Sci M.81: 6486-6490 61 Ryan CW, Vogelzang NJ, Stadler WM (2002) A phase II trial of intravenous gemcitabine and 5-fluorouracil with subcutaneous interleukin-2 and interferon-alpha in patients with metastatic renal cell carcinoma Cancer 15; 94(10):2602-2609 62 Ratto GB, Melioli G, Zino P, Mereu C, Mirabelli S, Fantino G, et al (1995) Immuno therapy with the use tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 as adjuvant treatment in stage III non-small-cell lung cancer A pilot study J Thorac Cardiovasc Surg; 109:12121217 63 Ratto GB, Zino P, Mirabeli S, Minuti P, Aquilina R, Fantino G, et al (1996) A randomized trial of adoptive Immuno therapy with tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 versus standard therapy in the postoperative treatment of resected non-small cell lung carcinoma Cancer 78:244251 64 Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, et al (1997) A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone N Engl J Med 316:889 897 65 Rubin J (1993) Interleukin-2: its biology and clinical application in patients with cancer Cancer Invest 11:460472 66 Sambrook J, Russell DW (2001) Cold spring laboratory Harbor Press 67 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 68 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Habor laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York 69 Schiller JH, Morgan-Ihrig Ch, Levitt ML.(1995) Concomitant administration of interleukin-2 plus tumor necrosis factor in advanced non-small cell lung cancer Am J Clin Oncol 18:4751 70 Steiner G, Tschachler E, Tani M, Malek TR, Shevach EM, Holter W, et al (1986) Interleukin-2 receptors on cultured marine epidermal Langerhans cells J Immunol 137:155159 71 Smith KA, Cantrell DA (1985) Interleukin regulates its own receptors Proc Natl Acad Sci 82:864-868 72 Soori G, Dillman RO, Wiemann MC, Stark JJ, Tai F, DePriest CB, Church CK and Schulof R (2002) Phase II trial of subcutaneous interleukin-2, subcutaneous interferon-alfa, 5-fluorouracil and cis-retinoic acid in the treatment of renal cell carcinoma: final results of cancer biotherapy researcg group 94-10 Cancer Biother Radiopharm 17(2): 165-173 73 Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Hatakeyama M, Kashima N, Fuse A, Hamuro J, Nishi-Takaoka C, Yamada G (1986) Molecular analysis of the interleukin-2 system Immunol Rev 92: 121-133 74 Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R, Hamuro J (1983) Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 Nature 302: 305-310 75 Testa U, Montesoro E, Bulgarini D, Samoggia P, Masciulli R, Habetswallner D, Care A, Mariani G, Giannella G, Boccoli G, et al (1990) Interleukin-2 in cancer therapy Ann Ist Super Sanita 26(3-4): 283-334 76 Tester WJ, Kim KM, Krigel RL, Bonomi PD, Glick JH, Asbury RF, et al (1999) A randomized phase II study of interleukin-2 with or without beta-interferon for patients with advanced non-small cell lung cancer A Eastern Cooperative Oncology Group study (PZ586) Lung Cancer; 25:199206 77 Yang JC, Sherry RM, Steinberg SM, Topalian SL, Schwartzentruber DJ, Hwu P, et al (2003) Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer J Clin Oncol; 21:31273132 78 Yang SC, Gimm EA, Parkinson DR, Carinhas J, Fry KD, Mendiguren-Rodriguez A, et al (1991) Clinical and immunomodulatory effects of combination immuno therapy with low-dose interleukin-2 and tumor necrosis factor in patients with advanced non-small cell lung cancer: a phase I trial Cancer Res 51:36693676 79 Yano T, Sugio K, Yamazaki K, KAse S, Yamaguchi M, Ondo K, et al (1999) Postoperative adjuvant adoptive immuno therapy with lymph node-LAK cells and IL-2 for pathologic stage I non-small cell lung cancer Lung Cancer 26:143148 80 Yasumoto K, Miyazaki K, Nagashima A, Ishida T, Kuda T, Yano T, Sugimachi K, et al (1987) Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillation of recombinant interleukin-2 in patients with pleurisy due to lung cancer Cancer Res 47:21842187 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 41 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 MC LC LI M U CHNG TNG QUAN TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG V NGOI NC 1.1 TèNH HèNH NGHIấN CU NC NGOI 1.2 TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG NC CHNG 2.LA CHN I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 MC TIấU CA TI 2.2 NI DUNG NGHIấN CU CN THC HIN 2.3 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.3.1 Vt liu 2.3.2 Phng phỏp nghiờn cu CHNG NHNG NI DUNG V KT QU THC HIN 3.1 KT QU TO DềNG GEN IL-2 3.1.1 Kt qu tỏch chit RNA tng s t ngi v tng hp cDNA mó húa gen IL-2 3.1.2 Xỏc nh trỡnh t nucleotide ca gen IL-2 3.2 KT QU TO T BIN GEN IL-2 3.2.1 To t bin im lm mt im glycosyl húa v thay th Cys125 bng Ser125 3.2.2 Gõy hi bin Ser25 thnh Leu25 10 3.3 KT QU BIU HIN IL-2 TRONG CC H BIU HIN KHC NHAU 11 3.3.1 Biu hin gen lai Trx-rhIL2MN t bo E coli 11 3.3.2 Biu hin gen lai Trx-rhIL2MN nm men P pastoris 13 3.3.3 Kt qu biu hin gen rhIL2 dng t nhiờn nm men P pastoris 14 3.4 KT QU NGHIấN CU IU KIN LấN MEN CC CHNG TI T HP MANG GEN IL-2 BèNH TAM GIC V TRONG H THNG LấN MEN 5L, 14L 16 3.4.1 Kt qu lờn men tng hp IL-2 tỏi t hp bỡnh tam giỏc 16 3.4.2 Kt qu lờn men sn xut IL-2 tỏi t hp h thng Bioflo 110 dung tớch 5L v 14L 16 3.5 KT QU TCH CHIT, TINH CH IL-2 T DCH LấN MEN V NGHIấN CU TNH CHT 17 3.5.1 Tỏch chit v tinh ch IL-2 bng sc ký ỏi lc 17 3.5.2 Ct protein dung hp bng Enterokinase v lc IL-2 qua ct sc ký ỏi lc v kim tra kh nng bt cp c hiu ca IL-2 bng Western blot 17 3.6 KT QU BC U V BO QUN MU IL-2 19 3.7 TH NGHIM IL-2 TI T HP TRấN Mễ HèNH T BO CTLL2 19 3.7.1 iu kin ti u nhõn v bo qun dũng t bo CTLL2 19 3.7.2 Xỏc nh c hot tớnh sinh hc ca cỏc mu IL-2 tỏi t hp 20 3.7.3 Xỏc nh hot tớnh sinh hc ca mu rhIL2 biu hin P pastoris 21 3.8 TH NGHIM IL-2 TI T HP TRấN Mễ HèNH T BO NG VT 22 3.8.1 Gõy ung th thc nghim ng tiờu húa cho chut nht trng bng húa cht AOM .22 3.8.2 Kt qu nghiờn cu 24 3.9 KT QU NH GI CHT LNG IL-2 29 3.9.1 Hiu giỏ ca sn phm IL-2 29 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 42 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 3.9.2 Tớnh vụ trựng ca sn phm IL-2 29 3.9.3 Tớnh an ton ca sn phm IL-2 29 3.9.4 Cht gõy st ca sn phm IL-2 29 3.9.5 Tớnh cht lý húa ca sn phm 29 CHNG TNG QUT HO V NH GI KT QU THU C 30 4.1 KT QU V KHOA HC 30 4.2 TNG HP CC SN PHM T C SO VI NG Kí 31 4.3 TRèNH CễNG NGH 33 4.4 KH NNG P DNG 33 4.5 O TO 34 4.6 HP TC QUC T 35 4.7 TèNH HèNH S DNG KINH PH 35 4.8 DANH SCH CC CễNG TRèNH CễNG B 35 4.9 HN CH CA TI 36 CHNG KT LUN V NGH 38 5.1 KT LUN 38 5.2 NGH 38 TI LIU THAM KHO 39 MC LC CC BNG Bng Kt qu tinh ch IL-2 tỏi t hp t dch thụ 19 Bng D liu kim tra hot tớnh ca cỏc mu IL-2 tỏi t hp 20 Bng n v hot tớnh ca cỏc mu IL-2 th nghim .21 Bng Kh nng hot hoỏ t bo CTLL-2 phỏt trin ca cỏc mu thớ nghim cỏc nng th khỏc 21 Bng n v hot tớnh ca cỏc mu rhIL2 th nghim .22 Bng S trung bỡnh ca u rut chut cỏc lụ thớ nghim 24 Bng nh lng cỏc u bỏng Sarcoma 180 m chut thớ nghim 27 Bng Tỏc ng ca ch phm IL2-TQ v IL2-VN lờn thi gian sng thờm .28 ca chut nht trng Swiss mang u bỏng Sarcoma 180 28 Bng Cỏc dũng gen v dũng vector to ca ti 31 Bng 10 Sn phm khoa hc ca ti 32 Bng 11 Danh sỏch cỏc hc viờn c o to 34 Bng 12 Danh sỏch cỏc cỏn b c nõng cao trỡnh .34 Bng 13 Danh sỏch cỏc c quan hp tỏc quc t 35 Bng 14 Kinh phớ phõn b cho cỏc hng mc 35 Bng 15 Túm tt cỏc ni dung cụng vic thc hin v ni dung xin iu chnh 36 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 43 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 MC LC CC HèNH Hỡnh Túm tt ni dung nghiờn cu theo s .6 Hỡnh Sn phm PCR nhõn gen IL-2 .7 Hỡnh Kt qu ct kim tra DNA cỏc plasmid bng enzyme EcoR I Hỡnh Kt qu so sỏnh trỡnh t IL-2 nhn c vi trỡnh t trờn ngõn hng gen quc t NCBI Hỡnh So sỏnh trỡnh t amino acid ó c dch mó ca gen IL-2 nhn c (Protein_IL-2) v trỡnh t amino acid ó ng kớ trờn ngõn hng d liu gen quc t vi s ng ký NP_000577 Hỡnh in di sn phm PCR trờn gel agarose 0,8% .9 Hỡnh Kt qu ct kim tra DNA plasmid cỏc dũng bin np bng Not I v Nco I Hỡnh Kt qu c trỡnh t nucleotide ca dũng s cha gen rhIL2 10 Hỡnh Kt qu c trỡnh t gen ó hi bin (phi) so vi gen cha hi bin (trỏi) 11 Hỡnh 10 in di SDS-PAGE protein rhIL2 trờn gel polyacrylamide 12,5% 11 Hỡnh 11 in di protein rhIL2 dng tan v khụng tan trờn gel polyacrylamide 12,5% 11 Hỡnh 12 Western blot vi khỏng th khỏng hIL-2 12 Hỡnh 13 nh ph MS/MS ca mnh peptide 634,4 dalton mang in tớch +2 ca Trx c nhn dng A ph TOF MS, B ph MS/MS 12 Hỡnh 14 nh ph TOF MS v MS/MS ca mnh peptide 874,6 dalton mang in tớch 2+ ca IL-2 c nhn dng A ph TOF MS, B ph MS/MS .13 Hỡnh 15 Cỏc peptide nhn dng c qua ph t bng protein cú kớch thc 32 kDa .13 Hỡnh 16 nh biu hin gen Trx-rhIL-2MN .13 Hỡnh 17 nh Western Blot vi khỏng th khỏng IL-2 14 Hỡnh 18 in di sn phm PCR trờn gel agarose 0.8% 15 Hỡnh 19 in di SDS-PAGE sn phm biu hin rhIL2 nm men P pastoris 15 Hỡnh 20 nh Western Blot vi khỏng th khỏng IL-2 15 Hỡnh 21 Kho sỏt nng IPTG .16 Hỡnh 22 Kho sỏt nng Amp 16 Hỡnh 23 Kho sỏt nhit 16 Hỡnh 24 Thi gian thu mu 16 Hỡnh 25 Quỏ trỡnh phỏt trin ca chng E coli Bl21 v sinh tng hp Interleukin-2 17 Hỡnh 26 in di protein tỏi t hp Trx-rhIL2MN trờn polyacryamide gel 12,5% 17 Hỡnh 27 in di protein tinh sch ln 18 Hỡnh 28 in di protein tinh sch ln 18 Hỡnh 29 in di sn phm protein ct bng enterokinase .18 Hỡnh 30 Mu Trx-IL2MN gi dng ụng khụ sau cỏc khong thi gian bo qun khỏc 19 Hỡnh 31 Hỡnh nh t bo CTLL-2 nuụi cy in vitro 20 Hỡnh 32 Xỏc nh v so sỏnh hot tớnh ca cỏc mu IL-2 th nghim 20 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 44 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Hỡnh 33 th minh ho s phỏt trin ca t bo CTLL-2 di tỏc ng ca cht th .21 cỏc nng khỏc .21 Hỡnh 34 Niờm mc i trng chut nht trng bỡnh thng 24 Hỡnh 35 Niờm mc i trng chut nht trng b ung th .24 Hỡnh 36 Niờm mc i trng chut nht trng bỡnh thng 24 Hỡnh 37 Niờm mc i trng chut nht trng b ung th .24 Hỡnh 38 Tiờu bn hin vi mụ hc lụng nhung rut chut nht trng bỡnh thng: 25 Hỡnh 39 Tiờu bn hin vi mụ bnh hc lụng nhung rut chut nht trng b ung th di tỏc ng ca AOM 25 Hỡnh 40 T bo biu mụ niờm mc b gii bit húa, ang chuyn dng 25 Hỡnh 41 T bo mụ liờn kt lừi lụng nhung b gii bit húa, phõn b ln xn, ang chuyn dng thnh ung th, cú nhõn ln v tng sc (P: 100 x 10) 25 Hỡnh 42 Chut nht trng Swiss kho mnh (a) v mang u bỏng Sarcoma 180 sau 12 ngy cy truyn (b) 26 Hỡnh 43 nh minh sinh t bo ung th Sarcoma 180: 26 Hỡnh 44 S gim sinh u bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 tỏi t hp 26 Hỡnh 45 Biu so sỏnh t s phỏt trin u gia cỏc lụ thớ nghim 26 Hỡnh 46 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 lụ i chng (x1000) 27 Hỡnh 47 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 lụ tiờm ch phm IL2.VN .27 Hỡnh 48 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca ch phm IL2.TQ 27 Hỡnh 49 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 bỡnh thng di kớnh hin vi in t truyn qua 28 Hỡnh 50 T bo ung th bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 VN (x10.000) .28 Hỡnh 51 T bo u bỏng Sarcoma 180 di tỏc ng ca IL2 TQ (x10.000) 28 Hỡnh 52 th biu din thi gian sng thờm ca cỏc lụ chut thớ nghim 28 lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 45 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bỏo cỏo túm tt Tng kt Khoa hc v K thut ti KC.04.33 Lời cảm ơn Ch nhim ti KC 04.33 xin chõn thnh cm n cỏc cỏn b nghiờn cu thuc c quan nghiờn cu khoa hc l (i) Vin Cụng ngh sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam, (ii) Trng i hc Khoa hc t nhiờn, HQGHN, B Giỏo dc v o to v (iii) Vin Kim nh Quc gia Vacxin v Sinh phm y t, B Y t ó tham gia thc hin ti Ch nhim ti KC 04.33 xin chõn thnh cỏm n Lónh o Vin Cụng ngh sinh hc, Trng i hc khoa hc t nhiờn v Vin Kim nh Quc gia Vacxin v Sinh phm y t ó ng h v to iu kin thun li v trang thit b v kinh phớ cho cỏc th cỏn b ch trỡ v tham gia thc hin ti ny Ch nhim v th cỏn b nghiờn cu thc hin ti xin chõn thnh cm n V Qun lý Khoa hc v Cụng ngh cỏc ngnh KT-KT ca B Khoa hc v Cụng ngh v Ban ch nhim chng trỡnh KC 04 ó to iu kin thun li v kinh phớ v qun lý sut thi gian thc hin ti C QUAN CH TRè TI CH NHIM TI PGS TS TRNG NAM HI lieu chia se mien Thc hin tTai 01/2005 06/2007 phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 46 ... NGHIấN CU CN THC HIN 26 2. 2.1 To dũng gen IL- 2 26 2. 2 .2 To t bin im ca gen IL- 2 .26 2. 2.3 Biu hin gen IL- 2 cỏc h biu hin khỏc 27 2. 2.4 Nghiờn cu v ti u iu kin... mang gen IL- 2 27 2. 2.5 Tỏch chit, tinh ch IL- 2 t dch lờn men v nghiờn cu tớnh cht ca IL- 2 27 2. 2.6 ỏnh giỏ cht lng IL- 2 27 2. 3 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU .29 2. 3.1... tinh ch IL- 2 Trx His EnK rhIL2MN Ct bng enterokinase rhIL2MN Tinh ch rhIL2MN bng sc ký ỏi lc IL2 tỏi t hp tinh sch Th nghim IL- 2 trờn mụ hỡnh nuụi cy t bo CTLL -2 Th nghim IL- 2 trờn ng vt ung th