Phương pháp định lượng Vitamin A bằng HPLC

TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM Tp.HCM PHÂN TÍCH HĨA LÝ HIỆN ĐẠI XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC GV HD: Cơ Vũ Hồng Yến Nhóm sinh viên thực  Lê Thị Huỳnh Như  Phan Thanh Duy  Nguyễn Thị Hương Lý chọn đề tài • Vai trị vitamin A sức khỏe người • Một số phương pháp định lượng vitamin A Sơ lược vitamin A • Vitamin A tồn hai dạng: • Vitamin A1 C20H30O • Vitamin A2 Tính chất vật lý • Vitamin A tan dầu dung môi hữu cơ,dễ bị oxi hóa tiếp xúc với oxi ngồi khơng khí,tuy nhiên lại bền với acid bazo (điều kiện khơng tiếp xúc với oxi) • Vitamin A1 có quang phổ hấp thu tối đa bước sóng 610 đến 620 nm,vitamin A2 có bước sóng 692 đến 696 nmứng dụng phương pháp đo quang để xác định hàm lượng vitamin A Tăng trưởng Thị giác Vai trò Bảo vệ biểu mơ Miễn dịch Tăng đề kháng,phịng ngừa ung thư Khô da Viêm loét dày Triệu chứng thiếu hụt Vitamin A Đục thuỷ tinh thể Nhu cầu vitamin cho thể • Nhu cầu hàng ngày khuyến cáo (RDI) vitamin A theo nhu cầu tham chiếu ăn uống Hoa Kỳ là: • 900 microgam (3.000 IU) nam giới • 700 microgam (2.300 IU) nữ giới • Giới hạn – 3.000 microgam (10.000 IU) Một số phương pháp xác định hàm lượng vitamin A • Phương pháp Sắc kí lỏng hiệu cao • Phương pháp so màu • Phương pháp hóa học • Máy đo phổ UV (hoặc UV-nhìn thấy), có khả đo độ hấp thụ bước sóng xác định 9.6, trang bị cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm • Nồi cách thủy đun sôi • Bộ cô quay chân khơng, có nồi cách thủy 40 0C • Bộ chiết bao gồm phận sau đây: – ống chiết hình trụ dung tích lít có cổ thủy tinh mài có nút đậy; – khớp nối thủy tinh mài, gắn với ống chiết trang bị ống điều chỉnh qua tâm; – ống nối bên cạnh • Ống điều chỉnh cần phải có đầu hình chữ U vịi phun phía cho lớp chất lỏng phía ống chiết chuyển sang phễu chiết dung tích lít • Có thể sử dụng dụng cụ chiết khác bình nón phễu chiết thay cho thiết bị nêu Hình với điều kiện đạt độ thu hồi vitamin A • Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 m, để lọc pha động dung dịch mẫu thử • Lấy mẫu • Mẫu gửi đến phịng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản • Bảo quản mẫu cho khơng làm thay đổi thành phần giảm chất lượng mẫu Dung mơi, hóa chất • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Các loại hoá chất sử dụng thuộc loại tinh khiết Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích Nước, phù hợp với loại TCVN 4851 (ISO 3696) Dung dịch kali hydroxit (KOH) Hòa tan 500 g kali hydroxit nước pha lỗng nước đến lít Etanol, w(C2H5OH) = 95% (theo thể tích), dùng cồn metyl hóa cơng nghiệp tương đương 2-propanol (C3H7OH) Dầu nhẹ, có điểm sơi khoảng từ 400C đến 600C Lượng cặn lại sau bay phải nhỏ 20 mg/l Chất chuẩn vitamin A All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết 90% All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết 90% Metanol, dùng cho HPLC Pha động dùng cho sắc ký lỏng Trộn metanol với nước theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích) Lọc qua lọc màng cần Natri sulfat (Na2SO4), dạng khan Dung dịch natri ascorbat,  = 100 g/l Khí trơ, ví dụ: nitơ Cách tiến hành Yêu cầu chung • Vì vitamin A nhạy với xạ tia cực tím khơng khí, nên cần thực tất thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên mạnh Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu Hồn thành phép thử ngày làm việc Thực việc xà phịng hóa chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn mẫu thức ăn chăn ni lúc Xà phịng hóa • Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm chuẩn bị, xác đến 0,1 g, cho vào bình nón lít • Thêm 200 ml etanol Xoay bình để làm phân tán mẫu • Thêm ml natri ascorbat 50 ml dung dịch kali hydroxitvà xoay bình để trộn • Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sơi • Để lượng chứa bình cầu hồi lưu 60 phút, xoay bình • Tháo bình cầu để nguội đến nhiệt độ phòng nhanh tốt dòng nước lạnh Chiết xuất vitamin A (retinol) • Chuyển lượng chứa bình cầu sang ống chiết hình trụ • Rửa bình cầu hai lần, lần dùng 25 ml etanol cồn metyl công nghiệp chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ • Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, lần dùng 125 ml dầu nhẹ phần 250 ml nước ,mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ • Đậy nắp ống chiết hình trụ lắc min, ý giải phóng áp suất • Làm nguội ống chiết hình trụ dòng nước lạnh đợi tách hai pha lỏng, trước tháo bỏ nắp • Khi tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt nắp vài mililit dầu nhẹ chèn ống điều chỉnh ,chỉnh vị trí đầu cho mức phân lớp • Bằng cách áp dụng áp lực nhẹ khí trơ vào ống bên cạnh, chuyển lớp dầu nhẹ phía sang phễu chiết lít • Thêm 125 ml dầu nhẹ vào ống chiết hình trụ, đậy nắp lắc phút • Để tách lớp lại chuyển lớp sang phễu chiết cách sử dụng ống điều chỉnh • Thêm tiếp 125ml dầu nhẹ vào ống chiết hình trụ, đậy nắp lắc phút • Lại tách lớp chuyển lớp sang phễu chiết cách sử dụng ống điều chỉnh • Rửa dịch chiết dầu nhẹ với bốn phần, phần 100 ml nước, lúc đầu nhẹ nhàng đảo ngược sau lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương mức tối thiểu • Chuyển dịch chiết rửa qua giấy lọc trung bình/nhanh có chứa 60 g natri sulfat khan vào bình cầu thích hợp để bay chân khơng • Rửa phễu chiết hai lần, lần dùng 20 ml dầu nhẹ cho nước rửa qua lọc vào bình cầu làm bay • Rửa lọc tiếp hai lần, lần dùng 25 ml dầu nhẹ cho nước rửa vào bình làm bay • Làm bay dịch chiết dầu nhẹ đến khô chân không nhiệt độ không 40 0C • Khơi phục lại áp suất khí cách nạp khí trơ Sắc ký lỏng hiệu cao • Hòa tan cặn lượng tối thiểu 2-propanol chuyển định lượng sang bình định mức 20 ml • Rửa bình cầu làm bay có ba phần nhỏ 2-propanol ,chuyển nước rửa vào bình định mức Pha loãng đến vạch 2-propanol trộn Đối với vật liệu có chứa 100 000 IU/kg, cần phải pha lỗng tiếp • Chú thích: IU = Đơn vị quốc tế; IU vitamin A = 0,300 m all-transretinol • Nếu cần, lọc dịch chiết mẫu qua lọc màng • Nếu khơng thể tránh khỏi việc trì hỗn, bảo quản dịch chiết khí trơ tủ lạnh nhiệt độ 0C sau đưa trở lại nhiệt độ phịng nơi tối • Bơm 10 l dịch chiết mẫu vào cột sắc ký lỏng đo diện tích pic retinol • Tính diện tích pic trung bình thu từ lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu xác định nồng độ retinol dịch chiết cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm lần bơm lặp lại chuẩn retinol có nồng độ tương tự Thời gian lưu retinol khoảng phút Thực lần bơm thay dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn • Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn • Chuẩn bị dung dịch all-trans-retinyl axetat etanol cho ml chứa khoảng 15 000 IU vitamin A • Dùng buret ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch sang bình cầu 150 ml • Thêm 20 ml etanol, ml dung dịch kali hydroxit ml dung dịch natri ascorbat • Lắp bình ngưng vào bình cầu Nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi để hồi lưu 60 phút • Làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng dòng nước lạnh chuyển lượng chứa bình sang phễu chiết • Tráng bình cầu 50 ml nước 25 ml etanol cho nước tráng sang phễu chiết • Chiết pha nước phần 80 ml dầu nhẹ sau chiết tiếp hai lần lần 50 ml dầu nhẹ • Gộp tất dịch chiết dầu nhẹ, sau rửa hai lần lần 50 ml nước Thêm g natri sulfat khan • Chuyển dịch chiết dầu nhẹ sang bình định mức 250 ml pha lỗng đến vạch Nồng độ retinol dung dịch (dung dịch 1) khoảng 150 IU/ml Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn • Dùng pipet lấy ml ± 0,03 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml loại bỏ dung môi nhiệt độ mơi trường dịng khí trơ • Hịa tan cặn 2-propanol sau thêm 2-propanol đến vạch • Đo độ hấp thụ (A) dung dịch, sử dụng 2-propanol làm đối chứng, bước sóng 310 nm, 325 nm 334 nm Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ từ 0,7 đến 0,8 Có thể sử dụng dung dịch trung gian, cần • Sử dụng cơng thức sau đây, tính hấp thụ hiệu chỉnh bước sóng 325 nm: • A325, corr = 6,815 x A325 - 2,555 x A310 - 4,26 x A334 • Nếu A325,corr/A325 nhỏ 0,97, sử dụng giá trị A325,corr để chuẩn hóa, khơng sử dụng A325 • Nồng độ retinol dung dịch đưa bằng: • nồng độ (IU/ml) = A325 x 183 IU/ml, • nồng độ (IU/ml) = A325,corr x 183 IU/ml Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký • Chuẩn bị dung dịch retinol 2-propanol có nồng độ xấp xỉ nồng độ dự kiến dịch chiết mẫu Đối với 000 IU vitamin A kilogam mẫu, nồng độ retinol dự kiến có dịch chiết 2,5 IU/ml • Cho bay thể tích dung dịch đến khơ nhiệt độ mơi trường dịng khí trơ Hịa tan cặn lượng thích hợp 2-propanol để có nồng độ retinol theo yêu cầu trộn • Lọc dung dịch chuẩn qua lọc màng cần Biểu thị kết •Tính   hàm lượng vitamin A mẫu thử, công thức sau: WA = 20 000 x • Trong đó: • wA hàm lượng vitamin A mẫu thử, tính đơn vị quốc tế kilogam (IU/kg); • c nồng độ retinol dịch chiết, tính đơn vị quốc tế mililit (IU/ml); • m khối lượng mẫu thử, tính gam (g) TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:7081-1:2002 Sữa bột gầy,xác định hàm lượng vitamin A • Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8674:2011 Thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng vitamin a phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao • Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:6400:1998 ISO 707:1997 Hướng dẫn lấy mẫu sữa • Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN sữa bột • http://ods.od.nih.gov/factsheets/vitamina.asp Hết đó,cảm ơn người lắng nghe ... Như  Phan Thanh Duy  Nguyễn Thị Hương Lý chọn đề tài • Vai trị vitamin A sức khỏe người • Một số phương pháp định lượng vitamin A Sơ lược vitamin A • Vitamin A tồn hai dạng: • Vitamin A1 C20H30O... 600C Lượng cặn lại sau bay phải nhỏ 20 mg/l Chất chuẩn vitamin A All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết 90% All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O),... microgam (3.000 IU) nam giới • 700 microgam (2.300 IU) nữ giới • Giới hạn – 3.000 microgam (10.000 IU) Một số phương pháp xác định hàm lượng vitamin A • Phương pháp Sắc kí lỏng hiệu cao • Phương pháp