Định lượng vitamin a bằng phương pháp HPLC

Đinh lượng vitamin A bằng pp HPLC

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Tp.HCM

PHÂN TÍCH HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP

HPLC

Gvhd: Cô Vũ Hoàng Yến

Nhóm sinh viên thực hiện

 Lê Phạm Thảo Uyên

Lý do chọn đề tài

• Vai trò của vitamin A đối với sức khỏe con người.

• Một số phương pháp định lượng vitamin A

Sơ lược về vitamin A

• Vitamin A tồn tại dưới hai dạng:

• Vitamin A1 C20H30O

• Vitamin A2

Tính chất vật lý

• Vitamin A tan trong dầu và các dung môi hữu cơ,dễ bị oxi hóa khi tiếp xúc với oxi ngoài không khí,tuy nhiên lại khá bền với acid và bazo (điều kiện không tiếp xúc với oxi)

• Vitamin A1 có quang phổ hấp thu tối đa ở bước sóng 610 đến 620 nm,vitamin A2

có bước sóng 692 đến 696 nmứng dụng phương pháp đo quang để xác định hàm lượng vitamin A

Khô da Viêm loét dạ dày Đục thuỷ tinh thể

Triệu chứng khi thiếu hụt Vitamin A

Nhu cầu vitamin cho cơ thể

• Nhu cầu hàng ngày được khuyến cáo (RDI) về vitamin A theo nhu cầu tham chiếu ăn uống của Hoa Kỳ là:

• 900 microgam (3.000 IU) đối với nam giới

• 700 microgam (2.300 IU) đối với nữ giới

• Giới hạn trên – 3.000 microgam (10.000 IU)

Một số phương pháp xác định hàm lượng vitamin A

• Phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao

• Phương pháp so màu

• Phương pháp hóa học

Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Pha tĩnh trong HPLC

• Sắc ký pha thường:

_pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực

_pha động:các dung môi hữu cơ không phân cực như

tách các chất không phân cực hay ít phân cực

• Sắc ký pha ngược:

_pha tĩnh là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37

_pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril

tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

Detector trong HPLC

• Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS:

• Detector huỳnh quang RF:

• Detector độ dẫn

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Nguyên tắc

• Mẫu được xà phòng hóa với dung dịch kali hydroxit trong etanol và vitamin A được tách chiết trong dầu nhẹ Loại bỏ dầu nhẹ bằng cách cho bay hơi và phần cặn được hòa tan trong 2-propanol Nồng độ vitamin A trong dịch chiết 2-

propanol được xác định bằng sắc ký lỏng pha đảo dưới các điều kiện cho pic đơn

lẻ đối với tất cả các đồng phân retinol

Dụng cụ

• Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm các bộ phận sau:

• Bơm, được cài đặt ở tốc độ dòng ổn định 1 ml/min.

• Cột, dài 250 mm, đường kính trong 4,6mm, được nhồi bằng pha tĩnh gồm các nhóm octadecyl (C18) liên kết với silica.

• Cột có ít nhất 4 000 đĩa lý thuyết và giá trị k' = 0,6, cả hai cho thấy thỏa mãn đối với all-trans-retinol

Cỡ hạt không được nhỏ hơn 5 µ m và không lớn hơn 10 µ m Có thể sử dụng các hệ thống khác với điều kiện là tách hết được vitamin A ra khỏi các chất chiết cùng khác.

• Detector, cho phép đo bức xạ cực tím ở 325 nm và được trang bị máy tích phân/hệ thống xử lý dữ liệu.

• Máy đo phổ UV (hoặc UV-nhìn thấy), có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng xác định trong 9.6, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm.

• Nồi cách thủy đun sôi

• Bộ cô quay chân không, có nồi cách thủy ở 40 0C.

• Bộ chiết bao gồm các bộ phận sau đây:

– ống chiết hình trụ dung tích 1 lít có cổ bằng thủy tinh mài và có nút đậy;

– khớp nối thủy tinh mài, gắn với ống chiết và được trang bị một ống điều chỉnh đi qua tâm; và

Dung môi, hóa chất

• Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết.

• Thuốc thử

• Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.

• Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

• Dung dịch kali hydroxit (KOH)

• Hòa tan 500 g kali hydroxit trong nước và pha loãng bằng nước đến 1 lít.

• Etanol, w(C2H5OH) = 95% (theo thể tích), hoặc dùng cồn đã metyl hóa công nghiệp tương đương.

• 2-propanol (C3H7OH).

• Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khoảng từ 400 C đến 600C.

• Lượng cặn còn lại sau khi bay hơi phải nhỏ hơn 20 mg/l.

• Chất chuẩn vitamin A

• All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

• All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

• Metanol, dùng cho HPLC.

• Pha động dùng cho sắc ký lỏng

• Trộn metanol với nước theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích).

• Lọc qua bộ lọc màng nếu cần.

• Natri sulfat (Na2SO4), dạng khan.

• Dung dịch natri ascorbat, ρ = 100 g/l.

• Khí trơ, ví dụ: nitơ.

Cách tiến hành

Yêu cầu chung

• Vì vitamin A nhạy với bức xạ tia cực tím và không khí, nên cần thực hiện tất cả các thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên và mạnh Sử dụng dụng

cụ thủy tinh màu nâu khi có thể Hoàn thành phép thử trong một ngày làm việc Thực hiện việc xà phòng hóa và chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn và các mẫu thức ăn chăn nuôi cùng một lúc

Xà phòng hóa

• Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 1 lít

• Thêm 200 ml etanol Xoay bình để làm phân tán mẫu

• Thêm 2 ml natri ascorbat và 50 ml dung dịch kali hydroxitvà xoay bình để trộn

• Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu và nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi

• Để lượng chứa trong bình cầu hồi lưu trong 60 phút, thỉnh thoảng xoay bình

• Tháo bình cầu ra và để nguội đến nhiệt độ phòng càng nhanh càng tốt dưới dòng nước lạnh

Chiết xuất vitamin A (retinol)

• Chuyển lượng chứa trong bình cầu sang ống chiết hình trụ

• Rửa sạch bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 25 ml etanol hoặc cồn metyl công nghiệp

và chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ

• Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 125 ml dầu nhẹ và một phần 250

ml nước ,mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ

• Đậy nắp ống chiết hình trụ và lắc đều trong 1 min, thỉnh thoảng chú ý giải phóng

áp suất

• Làm nguội ống chiết hình trụ dưới dòng nước lạnh trong khi đợi tách hai pha

lỏng, trước khi tháo bỏ nắp

• Khi đã tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt trong nắp bằng một vài mililit dầu nhẹ và chèn ống có thể điều chỉnh ,chỉnh vị trí đầu dưới sao cho chỉ hơi trên mức phân lớp

• Bằng cách áp dụng một áp lực nhẹ của khí trơ vào ống bên cạnh, chuyển lớp dầu nhẹ phía trên sang phễu chiết 1 lít

• Thêm 125 ml dầu nhẹ vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 phút.

• Để tách lớp lại và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống có thể điều chỉnh như trên

• Thêm tiếp 125ml dầu nhẹ vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 phút

• Lại để cho tách lớp và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống điều chỉnh như trên

• Rửa sạch các dịch chiết dầu nhẹ với bốn phần, mỗi phần 100 ml nước, lúc đầu chỉ nhẹ nhàng đảo ngược sau đó lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương ở mức tối thiểu

• Chuyển dịch chiết đã rửa qua giấy lọc trung bình/nhanh có chứa 60 g natri sulfat khan vào một bình cầu thích hợp để bay hơi chân không

• Rửa sạch phễu chiết hai lần, mỗi lần dùng 20 ml dầu nhẹ và cho nước rửa qua bộ lọc vào bình cầu làm bay hơi

• Rửa bộ lọc tiếp hai lần, mỗi lần dùng 25 ml dầu nhẹ và cho nước rửa vào bình làm bay hơi

• Làm bay hơi dịch chiết dầu nhẹ đến khô dưới chân không ở nhiệt độ không quá 40 0C

• Khôi phục lại áp suất khí quyển bằng cách nạp khí trơ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Hòa tan cặn bằng một lượng tối thiểu 2-propanol và chuyển định lượng sang bình định mức 20 ml

• Rửa sạch bình cầu làm bay hơi có ba phần nhỏ 2-propanol ,chuyển nước rửa vào bình định mức Pha loãng đến vạch bằng 2-propanol và trộn Đối với vật liệu có chứa trên

100 000 IU/kg, thì có thể cần phải pha loãng tiếp

• Chú thích: IU = Đơn vị quốc tế; 1 IU vitamin A = 0,300 µm của all-trans-retinol

• Nếu cần, lọc dịch chiết mẫu qua bộ lọc màng

• Nếu không thể tránh khỏi việc trì hoãn, thì bảo quản dịch chiết dưới khí trơ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 0C và sau đó đưa trở lại nhiệt độ phòng ở nơi tối

• Bơm 10 µl dịch chiết mẫu vào cột sắc ký lỏng và đo diện tích pic của retinol

• Tính diện tích pic trung bình thu được từ các lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu và xác định nồng độ retinol của dịch chiết bằng cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm được của các lần bơm lặp lại của chuẩn retinol có nồng độ tương tự Thời gian lưu của retinol là khoảng 5 phút Thực hiện các lần bơm thay thế của dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn

• Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn

• Chuẩn bị dung dịch của all-trans-retinyl axetat trong etanol sao cho 1 ml chứa

khoảng 15 000 IU vitamin A

• Dùng buret 5 ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch này sang bình cầu 150 ml

• Thêm 20 ml etanol, 1 ml dung dịch kali hydroxit và 5 ml dung dịch natri ascorbat

• Lắp bình ngưng vào bình cầu Nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi và để hồi lưu trong 60 phút

• Làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng dưới dòng nước lạnh và chuyển lượng chứa trong bình sang phễu chiết

• Tráng bình cầu bằng 50 ml nước tiếp theo là 25 ml etanol cho nước tráng sang phễu chiết

• Chiết pha nước bằng một phần 80 ml dầu nhẹ và sau đó chiết tiếp hai lần mỗi lần

Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn

• Dùng pipet lấy 5 ml ± 0,03 ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 50 ml và loại bỏ dung môi ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ

• Hòa tan cặn trong 2-propanol và sau đó thêm 2-propanol đến vạch.

• Đo độ hấp thụ (A) của dung dịch, sử dụng 2-propanol làm đối chứng, ở bước sóng 310 nm, 325 nm và 334 nm Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ từ 0,7 đến 0,8 Có thể sử dụng dung dịch trung gian, nếu cần.

• Sử dụng công thức sau đây, tính hấp thụ hiệu chỉnh ở bước sóng 325 nm:

• A325, corr = 6,815 x A325 - 2,555 x A310 - 4,26 x A334

• Nếu A325,corr/A325 nhỏ hơn 0,97, thì sử dụng giá trị A325,corr để chuẩn hóa, nếu không sử dụng A325.

• Nồng độ retinol của dung dịch 1 được đưa ra bằng:

• nồng độ (IU/ml) = A325 x 183 IU/ml, hoặc

• nồng độ (IU/ml) = A325,corr x 183 IU/ml

Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký

• Chuẩn bị dung dịch retinol trong 2-propanol có nồng độ xấp xỉ như nồng độ dự kiến trong dịch chiết mẫu Đối với mỗi 1 000 IU vitamin A trên kilogam mẫu, thì nồng độ retinol dự kiến có trong dịch chiết là 2,5 IU/ml

• Cho bay hơi một thể tích của dung dịch 1 đến khô ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ Hòa tan cặn trong một lượng thích hợp của 2-propanol để có được nồng độ retinol theo yêu cầu và trộn

• Lọc dung dịch chuẩn qua bộ lọc màng nếu cần

• c là nồng độ retinol của dịch chiết, tính bằng đơn vị quốc tế trên mililit (IU/ml);

• m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g)

•  

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:7081-1:2002 Sữa bột gầy,xác định hàm lượng

vitamin A

• Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8674:2011 Thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng vitamin a - phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

• Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:6400:1998 ISO 707:1997 Hướng dẫn lấy mẫu sữa

• Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN đối với sữa bột

• http://ods.od.nih.gov/factsheets/vitamina.asp

Hết rồi đó,cảm ơn mọi người đã lắng nghe Hết rồi đó,cảm ơn mọi người đã lắng nghe