Thẩm định phương pháp định lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử

Bài viết xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS).

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ MÁU BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Trần Thị Chi Mai*, Vũ Thị Tú Uyên**, Nguyễn Thị Huệ**, Vi Mai Lan*** TÓM TẮT Mở đầu: Định lượng chì máu tồn phần chấp nhận rộng rãi cơng cụ hữu ích sàng lọc chẩn đoán theo dõi điều trị ngộ độc chì Mục tiêu: Xây dựng thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ xác phương pháp đánh giá Kết quả: Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp tương ứng 0,0217 µmol/L 0,0724 µmol/L Khoảng tuyến tính phương pháp 0,1- mol/L Độ lặp lại mức nồng độ 0,223; 0,876 1,77 (mol/L) 1,93, 1,31 1,88 (%) Độ tái lặp ba mức nồng độ 11,1, 4,18 4,96 (%) Độ thu hồi mẫu QC nằm giới hạn cho phép Độ thu hồi mẫu thật thêm chuẩn 93,6% 97,4%, nằm khoảng 80- 110%; đạt tiêu chuẩn AOAC 2012 Kết luận: Phương pháp định lượng chì máu xây dựng phòng xét nghiệm quang phổ hấp thụ nguyên tử xác tin cậy, sử dụng chẩn đốn theo dõi ngộ độc chì Từ khố: Ngộ độc chì, định lượng chì máu, quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện ABSTRACT VALIDATION OF BLOOD LEAD MEASUREMENT BY GRAPHITE FURNACE ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRY Tran Thi Chi Mai, Vu Thi Tu Uyen, Nguyen Thi Hue, Vi Mai Lan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 22 - No 3- 2018: 190 - 195 Background: Whole blood lead measurement has gained wide acceptance as the most useful tool for screening, diagnostic testing and treatment monitoring of lead poisoning Objectives: The aim of this study was to develop and validate the blood lead quantitation method by graphite furnace atomic absorption spectrophotometry Method: The limit of detection, limit of quantitation, linear range, precision and accuracy of the blood lead quantitation by GFAAS were evaluated Results: The LOD and LOQ of this method were 0.0217 µmol/L and 0.0724 µmol/L respectively The method linearity was from 0.1 to (mol/L) The repeatability at the concentrations of 0,223; 0,876 1,77 (mol/L) were 1.93, 1.31 1.88 (%) respectively The reproducibility at the three concentrations above were 11.1, 4.18 4.96 (%) respectively The recovery of three QC levels fell into the acceptable ranges The recovery of spiked samples were 93.6% and 97.4%, fell in range of 80- 110%; acceptable following the AOAC 2012 criteria Conclusion: The developed direct method for blood lead quantitation by GFAAS was accurate and precise, can be used for diagnosis and treatment monitoring of lead poisoning * Trường Đại học Y Hà Nội ** Bệnh viện Nhi Trung Ương *** Công ty CP TB-VT KHKT DL Trung sơn T.S.S.E Tác giả liên lạc: TS.BS Trần Thi Chi Mai, ĐT: 0934220994 Email: tranchimai@hmu.edu.vn 190 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Key words: Lead poisoning, lead blood measurement, graphite furnace atomic absorption spectrophotometry phản ánh phơi nhiễm chì, nồng độ ĐẶT VẤN ĐỀ chì máu tồn phần chấp nhận rộng Chì hợp chất chì sử dụng rãi cơng cụ hữu ích sàng lọc nhiều lĩnh vực cơng nghiệp, y học, chẩn đốn ngộ độc chì(2,8) quân sự, lượng nguyên tử, kĩ thuật hạt Có nhiều phương pháp định lượng chì nhân Song song với lợi ích mà chì mang máu quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), lại ln mối đe dọa mơi trường đo điện (AVS) phổ khối (ICP-MS) Hiện nghiêm trọng đến sức khỏe người, đặc biệt phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử đô thị lớn Ảnh hưởng đáng lo ngại sử dụng lò điện (Graphite furnace atomic tác động chì đến phát triển trí tuệ absorption spectrometry) phương pháp hay phát triển hệ trẻ – tương lai xã hội dùng để định lượng chì máu(12) Mục Tổ chức Y tế giới ước tính ngộ độc chì tiêu nghiên cứu đề tài xây dựng thẩm nguyên nhân bệnh tật cho 13,9 triệu người năm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu 2012 gây chậm phát triển tinh thần mức nhẹ phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử đến trung bình cho 0,6 triệu trẻ em hàng năm(6,13) dụng lò điện (GFAAS) Tại nước phát triển, phơi nhiễm chì chủ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU yếu liên quan đến hoạt động nghề nghiệp luyện kim, khai thác mỏ tái chế Một Nghiên cứu tiến hành Khoa Hóa nghiên cứu gần nồng độ chì máu sinh- Bệnh viện Nhi trung ương, từ tháng 11yếu tố nguy phơi nhiễm chì trẻ em thành 02/2018 phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ trẻ có nồng độ Trang thiết bị hóa chất chì máu cao 7,1%; tương đương với nước - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAkhu vực Đông Nam Á(5) Tuy nhiên, mức độ chì 7000 với lò điện GFA-7000 hút mẫu tự máu cao trẻ em không đồng vùng động ASC-7000 Shimadzu nước Đáng lưu ý hầu hết trẻ em sống - Dung dịch chuẩn Pb 1g/L, axit nitric đặc vùng tái chế chì có nồng độ chì máu cao vượt 65% Merck, Triton X-100 Ammoni ngưỡng cho phép có tới 28% trẻ nồng độ chì (3) dihydro phosphate Sigma-Aldrich Khí máu ≥ 45 g/dL Kết sàng lọc ngộ độc chì Argon 99,999%, nước khử ion trẻ em đến khám điều trị Bệnh viện Nhi trung ương năm cho thấy ngộ độc chì khơng gặp (kết chưa công bố) Triệu chứng lâm sàng ngộ độc chì khó phát khơng có bệnh sử rõ ràng phơi nhiễm chì; ngộ độc chì khơng có triệu chứng; triệu chứng có thường khơng đặc hiệu Vì xét nghiệm thăm dò tin cậy để chẩn đốn ngộ độc chì đóng vai trò cốt lõi xác định quản lý ngộ độc chì, đánh giá phơi nhiễm nghề nghiệp hay phơi nhiễm mơi trường với chì(12) Hiện nay, đánh giá ngộ độc chì chủ yếu định lượng chì máu tồn phần Mặc dù định lượng chì mơ dịch thể tóc, răng, xương, nước tiểu - Mẫu đối chứng Whole blood controlClinCheck mức Recipe Mẫu máu toàn phần bệnh nhân có nồng độ chì thấp Ngun lý kỹ thuật phương pháp định lượng chì quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện: Một lượng nhỏ mẫu hóa nguyên tử hóa nhiệt độ cao ống graphit Các nguyên tử chì tự sinh ống graphit hấp thụ tia sáng đơn sắc từ đèn catot rỗng tạo thành phổ hấp thụ nguyên tử xác định detector nhân quang điện Việc định lượng chì mẫu thực với đường chuẩn xây dựng từ dãy dung dịch chuẩn chuẩn bị song song với 191 Nghiên cứu Y học mẻ mẫu Mẫu bệnh phẩm Máu toàn phần tĩnh mạch bệnh nhân nghi ngờ ngộ độc chì thu thập ống chống đơng EDTA Quy trình kỹ thuật Điều kiện phân tích thiết bị AA-7000 trình bày Bảng Bảng Bảng Điều kiện phân tích AA-7000 Điều kiện Cường độ dòng đèn catot rỗng Pb 10 mA Độ rộng khe đo 0,7 nm Chế độ bổ BGC-D2 Ống graphit Pyrolysis graphite tube Thể tích tiêm mẫu 10 µL Bảng Chương trình lò điện Giai Nhiệt Thời gian Phương pháp Tốc độ dòng khí đoạn độ (giây) gia nhiệt (ml/phút) 60 RAMP 0,1 120 20 RAMP 0,1 250 10 RAMP 0,1 700 10 RAMP 700 10 STEP 700 STEP 2000 STEP 2500 STEP Chuẩn bị dung dịch chuẩn mẫu đo Mẫu chuẩn, mẫu chứng máu tồn phần pha lỗng 10 lần dung dịch 0,5% Triton X-100; 0,2% NH4H2PO4 0,2% HNO3 (v/v) nước khử ion (dung dịch cải biến mẫu) Các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; µmol/L pha axit HNO3 1% Các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn mẫu đo chuẩn bị cách trộn 50 µL dung dịch chuẩn làm việc mẫu với 450 µL dung dịch pha loãng (pha loãng 10 lần) Thẩm định phương pháp Các thông số thẩm định áp dụng theo hướng dẫn AOAC 2012(4) Giới hạn phát (Limit of detection - LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Sử dụng mẫu bệnh nhân có nồng độ chì 192 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 thấp (nhỏ LOD dự kiến), thêm dung dịch chuẩn chì với nồng độ 0,1 µmol/L (nồng độ thấp dãy dung dịch chuẩn ) Chuẩn bị 10 lần mẫu độc lập theo qui trình pha lỗng Tính giá trị trung bình, SD Xác định LOD LOQ: LOD = 3SD LOQ= 10SD (SD = độ lệch chuẩn mẫu thêm chuẩn) Khoảng tuyến tính phương pháp Chuẩn bị dung dịch làm việc có nồng độ Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4, mol/L, sau pha lỗng theo tỉ lệ 1:10 dung dịch pha loãng Tiến hành đo lặp lại dung dịch lần Tính giá trị trung bình nồng độ Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy đa thức phần mền Lincheker Phillipe Marquis để đánh giá xem khoảng giá trị đánh giá có tuyến tính hay khơng Phân tích hồi quy đa biến phần mềm cho biết phương trình tương quan nồng độ đo Y với giá trị mong đợi x Nếu phương trình tương quan phương trình hồi quy bậc phương pháp tuyến tính(11) Đánh giá độ chụm (Precision) Tiến hành đánh giá độ lặp lại (repeatability) độ tái lặp (intermediate repeatability) Sử dụng mẫu QC mức nồng độ QC1, QC2, QC3 Độ lặp lại: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu Tiến hành phân tích mẻ Độ tái lặp: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu Tiến hành phân tích 10 ngày khác (10 mẻ) Tính TB, SD, độ lệch chuẩn tương đối (RSD hay CV) nồng độ Độ lệch chuẩn tương đối so sánh với tiêu chuẩn cho phép AOAC 2012 Đánh giá độ xác (Accuracy) Độ xác phương pháp xác định độ thu hồi mẫu QC mức 1, 2, độ thu hồi mẫu bệnh nhân thêm chuẩn Mỗi nồng độ chuẩn bị 10 mẫu đo Độ thu hồi thêm chuẩn tính theo cơng thức sau: % thu hồi = (Cs – C) x 100/Ca ; Trong đó: Cs nồng độ đo mẫu thêm chuẩn, C nồng độ đo mẫu không thêm chuẩn, Ca Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học nồng độ chuẩn thêm vào Độ thu hồi so sánh với tiêu chuẩn AOAC 2011 khoảng 54 – 425 µg/L, độ lặp độ tái lặp thu bảng chấp nhận KẾT QUẢ Bảng Đánh giá độ chụm phương pháp Bảng Kết xác định LOD LOQ phương pháp Trung bình (n = 10) SD LOD LOQ R = Trung bình/LOD Nồng độ chì Pb (µmol/L) 0,0904 0,0072 0,0217 0,0724 4,2 Giá trị R đánh giá LOD tính 4,2 nằm khoảng – 10(9), nồng độ Pb lựa chọn để đánh giá (0,1 µmol/L) phù hợp Phương pháp phân tích chì máu theo qui trình đưa có giới hạn phát LOD giới hạn định lượng tương ứng 0,0217 µmol/L 0,0724 µmol/L Độ lặp lại (n=10) Độ tái lặp (n=10) Mẫu Trung bình (µmol/L) SD CV (%) Trung bình (µmol/L) SD CV (%) QC1 0,223 0,0043 1,93 0,251 0,028 11,1 QC2 QC3 0,876 1,77 0,0115 0,033 1,31 1,88 0,981 1,87 0,041 0,092 4,18 4,96 Độ xác phương pháp QC 0.4 0.3 Pb (umol/L) Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 0.2 0.1 Khoảng tuyến tính phương pháp Bảng Đánh giá khoảng tuyến tính phương pháp Lần Lần Lần Trung bình Giá trị mong chạy chạy chạy (y) đợi (x) 0,093 0,093 0,093 0,09475 0,1 0,219 0,193 0,198 0,2025 0,2 0,513 0,498 0,51 0,50525 0,5 1,015 1,012 0,992 1,00475 1,927 2,042 1,999 1,992 2,991 2,982 3,009 2,9955 3,994 3,9 3,919 3,95325 Độ dốc a 0,9874 Giao điêm b 0,009543 Y=0,9874x Phương trình tương quan +0,009543 Nhận xét: Khoảng tuyến tính phương pháp 0,1- mol/L, phương trình tương quan y= 0,9874 x + 0,009543 10 n QC 1.5 1.25 Pb (umol/L) Mẫu 0.75 0.5 0.25 0 10 n Độ chụm phương pháp Theo tiêu chuẩn đánh giá AOAC, nồng độ chất phân tích khoảng 100 – 1000 µg/L CV cho phép 11 – 15% Ba mẫu phân tích thí nghiệm có nồng độ chì 193 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học QC 3 BÀN LUẬN Pb (umol/L) 2.5 1.5 0.5 0 10 n Hình Độ thu hồi mẫu QC Giá trị đo Linear (Trung bình mẫu QC) Linear (Giới hạn mẫu QC) Linear (Giới hạn mẫu QC) Bảng Độ thu hồi mẫu QC Nồng độ mẫu QC Mẫu Nồng độ TB đo CV Trung bình Khoảng cho QC (µmol/L) (µmol/L) phép (µmol/L) QC 0,251 11,1 0,263 0,210 – 0,315 QC 0,981 4,18 1,06 0,847 – 1,27 QC 1,87 4,96 2,05 1,64 – 2,46 Kết phân tích cho thấy nồng độ chì trung bình đo sát với giá trị trung bình đưa mẫu QC (Bảng 6), giá trị đo nằm khoảng giới han cho phép (Hình 1) Độ chụm kết đo đạt tiêu chuẩn giới hạn chấp nhận theo AOAC Bảng Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn Thông số Nồng độ Pb thêm chuẩn (µmol/L) Nồng độ Pb trung bình đo mẫu thêm chuẩn (n = 10) (µmol/L) CV (%) Độ thu hồi trung bình (%) Tiêu chuẩn AOAC (%) Mức 0,600 0,561 Mức 2,00 1,95 1,42 0,74 93,6 97,4 80 – 110 Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn đo hai mức nồng độ nằm khoảng cho phép theo tiêu chuẩn AOAC 194 Định lượng chì máu khuyến cáo xét nghiệm sàng lọc chẩn đoán, theo dõi điều trị ngộ độc chì Hai phương pháp định lượng chì máu hay sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS) đo điện (ASV), GFAAS phương pháp hay sử dụng Hiện Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi trung ương có máy định lượng chì máu Leadcare II với nguyên lý kỹ thuật ASV Tuy nhiên dải đo máy từ 0.159 - 3,14 mol/L (3,3 - 65 g/dL)(7) máy sử dụng với mục đích sàng lọc nên cần thiết phải có phương pháp định lượng xác nồng độ chì máu bệnh nhân có nồng độ chì máu cao Chính phương pháp định lượng chì máu quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện xây dựng Kết thẩm định cho thấy độ chụm phương pháp đạt tiêu chuẩn AOAC 2011(4) Khi so sánh với nghiên cứu định lượng chì máu GFAAS, độ chụm nghiên cứu tương tự(1,7,9) Đặc biệt độ lặp lại độ tái lặp phương pháp chúng tơi cho thấy tốt nghiên cứu mức nồng độ chì thấp (0,223 mol/L) Độ chụm phương pháp tốt hẳn công bố nhà sản xuất với phương pháp ASV máy Leadcare II(7) Do vật liệu tham chiếu, nghiên cứu độ xác phương pháp đánh giá thơng qua độ thu hồi Độ thu hồi cho thấy phương pháp có độ xác cao Ở mức nồng độ thấp, trung gian cao đường chuẩn, độ thu hồi nằm giới hạn cho phép Kết tương đồng với kết đánh giá độ thu hồi phương pháp định lượng chì máu huyết số nghiên cứu công bố(1,3) Giới hạn định lượng phương pháp 0,072 µmol/L Khoảng tuyến tính đường chuẩn phương pháp từ 0,1 đến µmol/L Khoảng tuyến tính rộng khoảng tuyến tính máy Leadcare II Hơn nữa, việc đo Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 lường chì phương pháp GFAAS cho phép pha lỗng mẫu nồng độ vượt giới hạn khoảng tuyến tính, khoảng báo cáo kết rộng, thích hợp cho việc theo dõi kết điều trị ngộ độc chì Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy phương pháp định lượng chì máu quang phổ hấp thụ nguyên tử xây dựng phòng xét nghiệm xác tin cậy, sử dụng chẩn đoán theo dõi ngộ độc chì TÀI LIỆU THAM KHẢO Andrada D, Pinto FG, Magalhaes CG et al (2006) Direct determination of lead in human urine and serum samples by electrothermal atomic absorption spectrometry and permanent modifiers J Braz Chem Soc, 17(2): 328-332 Barbosa F (2005) A critical review of biomarkers used for monitoring human exposure to lead: advantages, limitations and future needs Environmental Health Perspectives, 113: 16691674 Croteau GA, Beaudet NJ, Bao ND (2015) Childhood lead exposure from battery recycling in Vietnam BioMed Res Int, 193715 doi: 10.1155/2015/193715 Guidelines for Collaborative Study Procedures to Validate Characteristics of a Method of Analysis (2012) Official Methods of Analysis, Appendix D AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD Havens D, Pham MH, Karr CJ, Daniell WE (2018) Blood Lead Levels and Risk Factors for Lead Exposure in a Pediatric 10 11 12 13 Population in Ho Chi Minh City, Vietnam Int J Environ Res Public Health, 15(1): 93 Landrigan P, Fuller R, Acosta NJ, Adeyi O, Arnold R, Basu N, Baldé A, Bertollini R, Bose-O’Reilly S, Boufford J, et al (2017) The lancet commission on pollution and health Lancet, 391(10119):462-512 Magellan Diagnostics, Inc (2016) Lead Care II Package Insert Magellan Diagnostics, Inc North Billerica, MA, USA:.[(accessed on March 2018)] Available online:http://www.leadcare2.com/getmedia/21d1301e-efee480f-9586-128f1dbc568f/80-0-052-Package-Insert,-LeadCare-IITest-Kit-v109-Rev02.pdf.aspx Parson PJ (2001) C40-A: Analytical procedures for the determination of lead in blood and urine; approved guideline Wayne, PA, National Committee for Clinical Laboratory Standards Parson PJ, Slavin W (1993) A rapid Zeeman graphite furnace atomic absorption spectrometric method for the determination of lead in blood Spectrochim Acta, 48B: 925-39 Viện KN VSANTPQG (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật Westgard JO (2009) Basic method validation, 3rd edition Westgard QC, Inc World Health Organization (2011) Brief guide to analytical methods for measuring lead in blood IOMC World Health Organization International Programme on Chemical Safety The Public Health Impact of Chemical: Knowns and Unknowns [(accessed on March 2018)], http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/206553/1/WHO_FWC _PHE_EPE_16.01_eng.pdf Ngày nhận báo: 17/12/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 09/02/2018 Ngày đăng: 10/05/2018 195 ... phải có phương pháp định lượng xác nồng độ chì máu bệnh nhân có nồng độ chì máu cao Chính phương pháp định lượng chì máu quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện xây dựng Kết thẩm định cho... chuẩn AOAC 194 Định lượng chì máu khuyến cáo xét nghiệm sàng lọc chẩn đốn, theo dõi điều trị ngộ độc chì Hai phương pháp định lượng chì máu hay sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện... phương pháp định lượng chì quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện: Một lượng nhỏ mẫu hóa nguyên tử hóa nhiệt độ cao ống graphit Các nguyên tử chì tự sinh ống graphit hấp thụ tia sáng đơn