BÁO CÁO ĐỀ TÀI LÊN MEN CÀ PHÊ

Quả cà phê tươi sau khi thu hoạch có vị ngọt dịu và màu đỏ ở phần vỏ ngoài, hoàn toàn không có hương thơm. Hương và màu sắc của hạt cà phê chúng ta cảm nhận được chỉ hình thành sau khi “ủ”. Ủ là quá trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. Trong đó, nấm men và vi khuẩn lactic là hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết định đến chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men. Cà phê được lên men bằng phương pháp sinh học có vị thơm đậm, sau khi uống vào có vị ngọt hậu, càng để lâu càng ngon. Cà phê được sản xuất bằng phương pháp lên men có hiệu suất trích ly lên đến 95%, các thành phần có trong hạt cà phê được hòa tan gần như hoàn toàn khi pha chế. Đồng thời cà phê lên men đem lại hiệu quả kinh tế cao. Vì mục đích đó, chúng tôi chọn đề tài “ lên men cà phê”

LÊN MEN CÀ PHÊ PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cà phê .4 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại cà phê 1.1.3 Cấu tạo, thành phần hóa học hạt cà phê nhân tươi 11 1.2 Tổng quan nấm men .14 1.2.1 Đặc điểm chung nấm men .14 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm men 18 1.2.3 Sự sinh sản nấm men .21 1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng nấm men .22 1.2.5 Sự trao đổi chất nấm men [15] 26 1.2.6 Phân loại nấm men 27 1.2.7 Vai trò nấm men đời sống.[23] 28 1.2.8 Ứng dụng nấm men 29 1.3 Quy trình cơng nghệ 33 1.3.1 Phương pháp chế biến khô 33 1.3.2 1.4 Phương pháp chế biến ướt 33 Tình hình nghiên cứu nước ngồi nước 33 1.4.1 Trong nước 33 1.4.2 Ngoài nước 33 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài .35 2.1.1 Thời gian 35 2.1.2 Địa điểm .35 2.2 Vật liệu thí nghiệm .35 2.2.1 Đối tượng .35 2.2.2 Môi trường 35 2.2.3 Hóa chất .35 2.2.4 Thiết Bị 35 ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 2.4 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 36 Phương pháp thiết kế thí nghiệm .36 2.4.1 Khảo sát tuyển chọn chủng nấm men phù hợp với trình lên men cà phê nhân tươi .36 2.5 2.6 Phương pháp phân tích 37 Sơ đồ quy trình thực nghiệm 37 HÌNH 2.2 Sơ đồ quy trình thực nghiệm .38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .38 CHƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Quả cà phê tươi sau thu hoạch có vị dịu màu đỏ phần vỏ ngồi, hồn tồn khơng có hương thơm Hương màu sắc hạt cà phê cảm nhận hình thành sau “ủ” Ủ q trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm: nấm men, nấm mốc vi khuẩn Trong đó, nấm men vi khuẩn lactic hai tác nhân vi sinh vật có vai trị quan trọng định đến tiêu chất lượng hương vị hạt cà phê sau lên men Cà phê lên men phương pháp sinh học có vị thơm đậm, sau uống vào có vị hậu, để lâu ngon Cà phê sản xuất phương pháp lên men có hiệu suất trích ly lên đến 95%, thành phần có hạt cà phê hịa tan gần hồn tồn pha chế Đồng thời cà phê lên men đem lại hiệu kinh tế cao Vì mục đích đó, chọn đề tài “ lên men cà phê” Nội dung nghiên cứu - Chọn dòng nấm men phù hợp cho trình lên men cà phê ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ - Xác định tỷ lệ nấm men bổ sung tối ưu cho trình lên men - Xác định độ ẩm tối ưu trình lên men Ý nghĩa thực tiễn đề tài Tạo dòng sản phẩm cà phê nhân tươi lên men Ứng dụng nấm men lên men cà phê tươi, tận dụng nguồn dinh dưỡng có vỏ nhằm chủ động nâng cao chất lượng hương cà phê CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cà phê 1.1.1 Nguồn gốc Khi nghiên cứu hệ thực vật hoang dại nhà khoa học khẳng định cà phê phát cách hàng nghìn năm, chúng thường mọc tán nhiều khu rừng thưa thuộc Châu Phi Tới năm 575 sau Cơng Ngun đưa trồng hóa, đến ngày có lồi cà phê thương mại di thực nhập nội tới nhiều nước giới Khoảng nửa sau kỷ XIX, người phương Tây đưa cà phê sang trồng Việt Nam Cây cà phê Việt Nam có nguồn gốc từ Indônexia Côngô sang.( đồ) Cây cà phê trồng lần khu vực phía Bắc, chủ yếu cà phê chè Sau đó, cà phê trồng mở rộng vào tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh Sau thời gian, thực dân phương Tây thấy giống cà phê chè không mang lại hiệu kinh tế cao đưa giống cà phê vối từ Côngô vào trồng Tây Nguyên Sau thời gian cà phê phát triển mạnh mẽ, diện tích cà phê ngày tăng 1.1.1.1 Lồi Coffea arabica (cà phê chè) Có nguồn gốc từ Ethiopia hai vùng phụ cận cao nguyên Buma thuộc Sudan phía Bắc Kenya Các vùng có độ cao từ 1.200 – 2.000m nằm – 90 vĩ Bắc Theo Beuthaud Charieu 1985 cà phê chè từ Ethiopya đưa tới Yemen sang Java năm 1690, đến Amsterdam (Hà Lan) năm 1706, sang Colombia năm 1724 Từ Yemen sang Brazil (Nam Mỹ) năm 1715 từ Java sang PaPua New Ghine năm 1700 1.1.1.2 Loài Coffea canephora Pierre (cà phê vối) lồi Coffea liberica Bull (cà phê mít, dâu da) Có nguồn gốc từ số nước thuộc Tây Trung Phi Cà phê vối từ Tây Phi Madagasca đưa sang Nam Mỹ Amsterdam năm 1889 Sau từ Amsterdam đưa sang Java năm 1900 sau lại từ Java đưa trở Châu Phi năm 1912 ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ Do giá trị kinh tế cao, thức uống thơm ngon hợp vị nhiều dân tộc giới nên cà phê trồng 75 nước thuộc vùng nhiệt đới (HÌNH 1.1) HÌNH 1.1 Khu vực sản xuất cà phê giới (Nguồn: Chemistry of Coffee, 2010 Elsevier Ltd.,) Cây cà phê trồng khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Trung Nam Mỹ, Châu Phi Đông Nam Á, vùng khí hậu ẩm ướt ơn hịa độ cao từ 600 – 2500m (Schenker 2000) 1.1.1.3 Cây cà phê Việt Nam Hiện cà phê trồng đem lại kim ngạch xuất lớn thứ hai sau lúa Cây cà phê sau du nhập phát triển bền vững Việt Nam đến 157 năm (từ 1857) Năm 1870 tu viện Kẻ Sở (Kim Bảng, Hà Nam) bắt đầu trồng thử Năm 1888 sau 30 năm nhập nội trồng thử cà phê trồng quy mô sản xuất nhiều người Pháp lập đồn điền như: Borel Leconte Chi Nê tỉnh Hịa Bình, Condoux – Gombert tỉnh Nghệ An, Michel Philip tỉnh Quảng Trị, Rossi – Delfante tỉnh Dak lak Những năm sau cà phê trồng Trung du Bắc Bộ như: Cổ Nghĩa, Đồng Lăng, Cốc Thôn tỉnh Hà Nam Ba Vì, Phú Mãn, Hịa Mục tỉnh Hà Tây, Phú Hộ tỉnh Phú Thọ Đến năm 1920 – 1925 sau phát vùng đất Bazan Tây Nguyên, người Pháp bắt đầu trồng cà phê vùng đất Sau nhiều năm cà phê phát triển nhanh hầu hết vùng trước trồng mở rộng nhiều tỉnh khác với quy mô ngày tăng 1.1.2 Phân loại cà phê Việc phân loại cà phê đến theo cách phân loại Linne (1937) Theo Linne cà phê thuộc: ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ Giới ( regum): Plantae Angiospermae Eudicots Asterids Bộ ( ordo) : Gentianales Họ ( Familia) : Rubiaceae Chi ( genus) : Coffea Năm 1947 theo Giáo sư Auguste Chevarier tự nhiên có tới 70 lồi phụ Coffea, có lồi có giá trị kinh tế ơng chia thành nhóm: Nhóm Eucoffea K.Schum, Argocoffea Piere, Mascarocoffea Paracoffea Miq Ba nhóm đầu có nguồn gốc Châu Phi.Nhóm Paracoffea có hai lồi mọc hoang Việt Nam Coffea dongnaiensis P.ex.Pit Coffea cochinchinensis P.ex.Pit Nhóm xác định có nguồn gốc nước Đông Dương Ấn Độ Đặc biệt quan tâm đến nhóm Eucoffea K.Schum, chúng có tầm quan trọng kinh tế trồng trọt Nhóm Eucoffea K.Schum chia làm nhóm phụ dựa số tiêu cao to (Nanocoffea), dày (Pachycoffea), màu sắc (Erythrocoffea), phân bố theo điều kiện địa lý (Mozambicoffea) (BẢNG 1.1) Gần nghiên cứu Clake (2003)[8], theo nghiên cứu cho thấy đến thời điểm phát 80 loài cà phê toàn giới Tuy nhiên, có Coffea arabica (Arabica), Coffea canephora (Robusta), Coffea liberica có giá trị kinh tế quan trọng (Schenker, 2000)[18] Arabica chiếm khoảng 64% Robusta chiếm khoảng 35% sản phẩm cà phê giới, giống cịn lại có giá trị kinh tế khơng nhiều Coffea liberica Coffea excelsa chiếm 1% (Rubayiza & Meurens 2005) BẢNG 1 Các nhóm phụ lồi chi Coffea Nhóm phụ –Erythrocoffea – Pachycoffea ThS.TRẦN QUỐC HUY Cơ loài C.arabica Linne (1) C.canephora Piere ex Froehner (2) C.congnsis Frochner C.liberica Bull ex Hiern C.derrei de Wild var.Excelsa Chev C.klainii Piere Trang LÊN MEN CÀ PHÊ C.abeokutae Cramer C oymensis Chev C.humils Chev C.brevipes Hiem C.togoensis C.stenophyla G.Dun C.carrisoi Chev C.mayombensis C.chumania C.eugenodes C.kivuensis C.munfindiensis C.zanguebariae C.racemosa Lour C.liguisdes Moore C.salvatrix Swyn & Phil – Nanocoffea – Melanocoffea – Mozabicoffea Như vậy, giống cà phê trồng có giá trị kinh tế lớn thuộc hai nhóm phụ (1) (2) Số nhiễm sắc thể chi Coffea n = 11, đặc trưng cho tất chi khác thuộc họ Rubiaceae Hầu hết loài thuộc chi Coffea loài nhị bội (2n = 22) hồn tồn khơng có khả tự thụ phấn (Berthaud, 1980) [7] Riêng có lồi cà phê chè (Coffea arabica) lồi tứ bội (2n = 44) (Lashermes et, al., 1999, 2000)[16] có khả tự hợp tự thụ phấn (Charrier Berthaud, 1985)[9] Các nghiên cứu Dennarly (1975), Chevarlier (1978), Lorearn (1982) cho thấy tất lồi nhị bội chi Coffea có cấu trúc nhiễm sắc thể giống xuất phát từ nguồn gen chung Nhưng q trình tiến hóa theo hướng khác địa lý, môi trường sống, v.v nên dần có biệt hóa để hình thành lồi khác, chúng thể khả thích nghi lồi, C.canephora C.liberica thích hợp vùng thấp, nóng ẩm có lượng mưa nhiều Loài C.arabica vùng nguyên sản sống tán rừng, quanh năm có ẩm độ khơng khí cao độ cao từ 1.200 – 1.800m Tuy có biệt hóa chúng có khả lai tạo khác loài, tự nhiên khả tạp giao chúng xảy phân bố địa lý thời gian hoa khác Đặc điểm số loài giống cà phê: 1.1.2.1 ThS.TRẦN QUỐC HUY Loài cà phê chè (Coffea arabica) Trang LÊN MEN CÀ PHÊ Giống Typica (Coffea arabica L.var Typica): Có nhiều Brazil số nước Châu Mỹ La Tinh Typica tìm thấy sớm, giống có phẩm chất thơm ngon bậc giống cà phê chè thương mại Tán hình chóp nón, dạng trung bình Lá non có màu tím tối màu đồng nhạt Phiến thon nhỏ, đuôi dài nhọn hình mũi mác, mép gợn sóng Cành (cành ngang, cành quả) yếu, bng rủ tạo với thân góc 80 Trên cành có nhiều cành thứ cấp nhỏ yếu (cành tăm hay cành nhớt) Lóng đốt cành ngang dài, số hoa, đốt biến động khoảng – 10 Quả hạt to, dạng dài, chín có màu đỏ Typica thích hợp với vùng khí hậu ơn hịa, mát, cường độ ánh sáng yếu, mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (Hemileia vestatrix B&Br), bệnh đốm mắt cua (Cercospora Coffeicola), nấm hồng (Corticicum salmonicolor), suất thấp nên bị thay giống khác Giống Bourbon (Coffea arabica L.var Bourbon): Do giống Typica biến dị, điều kiện tự nhiên Việt Nam, tán hình trụ khơng khít tán, dạng trung bình Lá non xanh nhạt, phiến dạng bầu, ngắn, mép gợn sóng Cành khỏe, hợp với thân góc nhỏ 800, có khả phân cành thứ cấp nhiều (7 cấp) Lóng đốt trung bình, số hoa, đốt cao giống Typica biến động từ 10 – 20, hạt có kích thướt nhỏ hơn, dạng hình cầu, chín màu đỏ Bourbon giống có chất lượng thơm ngon, thích hợp với khí hậu ơn hòa, cường độ ánh sáng vừa, mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, sâu bọ dễ xâm nhập Giống Catura (Coffea arabica L.var Catura): Là dạng biến dị giống Bourbon chọn lọc Brazil Cây thấp khỏe, tán hẹp nên thích hợp mật độ trồng dày từ 5.000 – 10.000 cây/ha Lóng đốt thân, cành ngắn, khả phân cành thứ cấp nhiều Số hoa, đốt nhiều từ 20 – 30 quả/đốt Quả hạt có kích thướt nhỏ dạng bầu gần giống dạng hạt cà phê vối (C.canephora) Catura có hai dạng: Một dạng màu đỏ chín gọi Catura rojo dạng vàng chín gọi Catura amarello Catura có tiềm cho suất cần thâm canh cao, dạng vàng cho suất cao Chất lượng nước uống khá, gần Bourbon, có khả chịu hạn, thích hợp với cường độ chiếu sáng mạnh vùng có độ cao thấp, giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, bệnh khô cành khô (Colletotricum coffeanum Noak) hay gọi bệnh CBD (Coffee Berry Disease) Giống Catura amarello trung tâm nghiên cứu Phù Quỳ - Nghệ An chọn lọc gọi giống PQII Giống Catuai (Coffea arabica L.var Catuai): Là sản phẩm lai tạo giống Catura với giống Mundo novo (Mundo novo lai tạo tự nhiên Bourbon giống Sumatra, trồng Việt Nam từ năm 1971) Đặc điểm hình thái tương tự Catura amarello Cây thấp, tán hẹp thích hợp mật độ trồng dày Lá non màu xanh nhạt, phiến bầu, mép gợn sóng nhiều Lóng đốt ngắn, số hoa đốt tương đương giống Catura, khả phân cành nhiều Catuai có khả chịu hạn tốt Catura, thích ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ hợp với điều kiện khí hậu vùng có độ cao thấp, cường độ chiếu sáng mạnh, giống có tiềm cho suất cao cần chế độ thâm canh cao Catuai mẫn cảm trung bình với bệnh gỉ sắt bệnh khơ cành khô năm gần nước Châu Mỹ La Tinh trồng giống Catura Catuai diện tích lớn Giống Catimor (Coffea arabica L.var Catimor): Giống Catimor giống lai tạo Hibrido de Timor (cây khác loài) với giống Catura, Trung tâm nghiên cứu bệnh gỉ sắt Oeiras – Bồ Đào Nha Viện nghiên cứu cà phê Colombia Tại Việt Nam, Viện nghiên cứu cà phê Eakmat nhập hệ F4, F5 chọn lọc hệ F6 Catimor có dạng thấp, phát triển tự nhiên cao từ – 3m (thâm canh tốt cao 3m) Tán hẹp, đường kính tán từ 1,2 – 1,5m thích hợp mật độ trồng dày 5.000 – 10.000 cây/ha Hầu hết đặc điểm hình thái gần giống Catura rojo Điểm khác biệt rõ non có màu đồng nhạt Phiến dày màu xanh đậm, mép gợn sóng nhiều Cành khỏe vươn thẳng hợp với thân góc nhỏ 80 0, lóng đốt ngắn từ – 4cm, phân cành thứ cấp nhiều, thuộc loại trung bình, chín màu đỏ Trọng lượng 100 hạt từ 12 – 16g, tỷ lệ tươi/nhân biến động từ – 7,5 tùy vào điều kiện trồng Catimor có tiềm cho suất cao, địi hỏi thâm canh cao, có khả chịu lạnh, kháng cao với bệnh gỉ sắt Giống khuyến cáo để thay số giống cà phê chè khác Trên giống cà phê chè (Coffea arabica L.) trồng phổ biến có khối lượng xuất lớn thị trường cà phê quốc tế Ngồi cịn có số giống khác giống Mundonovo, Moka có nhiều hạn chế nên khuyến cáo rộng rãi 1.1.2.2 Loài cà phê vối (Coffea canephora Pierre): Cà phê vối trồng phổ biến nhiều nước, chiếm 30% tổng diện tích cà phê Các nước trồng nhiều cà phê vối Cameroon, Ấn Độ, Indonesia, Brazil, Việt Nam Tại Việt Nam trồng nhiều tỉnh phía Nam, tập trung chủ yếu tỉnh Tây Nguyên Đồng Nai Giống Robusta (C.canephoravar Robusta):Chiều cao tự nhiên cao từ – 12m không cắt tỉa Cây to khỏe, tán rộng, đượng kính tán từ – 2,5m, khơng thích hợp mật độ trồng dày Lá non màu xanh nhạt Phiến to bầu hình mũi mác, đuôi nhọn, chiều rộng từ 10 – 15cm, dài từ 20 – 30cm, mép gợn sóng cà phê chè Cành to khỏe, vươn dài hợp với thân góc lớn 80 0, khả sinh cành thứ cấp nhiều so với cà phê chè, lóng đốt dài, có dạng hình cầu hình trứng, cuống ngắn dai cà phê chè nên bị rụng chín, chín có màu đỏ Trọng lượng hạt trung bình từ 13 – 16g (ở ẩm độ hạt 12%) Trọng lượng tươi/nhân biế động từ – 6kg Năng suất thấp khả chống chịu sâu bệnh ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ tốt cà phê chè, nhiên chịu hạn Vì trồng Tây Nguyên phải tưới nước đủ ẩm sinh trưởng tốt 1.1.2.3 Loài cà phê mít, dâu da (Coffea liberia Bull): Trong lồi có hai dạng hình giống cà phê mít (C.liberia var dewevrei) thường gọi C.liberia var Excelsa có nguồn gốc xứ Ubagui – Chari thuộc Trung Phi nên gọi cà phê Chari Một dạng hình khác C.liberia var liberica Cả hai dạng có giá trị thương phẩm thấp nên khơng có mặt thị trường cà phê quốc tế 1.1.2.4 Những giá trị mà cà phê mang lại  Giá trị kinh tế: Cây cà phê có giá trị kinh tế nhiều mặt, sản phẩm hạt, gỗ đem lại nguồn lợi đáng kể cho người sản xuất Ngoài trồng cà phê cịn có ý nghĩa cải tạo hệ sinh thái thu hút nhiều lao động nông nghiệp, tạo sở cho ngành công nghiệp phát triển  Giá trị dinh dưỡng: Trong hạt cà phê phân tích có đầy đủ hợp chất như: protein, lipid, đường, tinh bột, cellulose, đặc biệt có cafein  Giá trị xuất khẩu: Các liệu cho thấy tình hình xuất cà phê giới bắt đầu với 10000 năm vào năm 1700 Yemen, tiếp đến Indonesia Caribbean Năm 2008, lượng lớn cà phê khoảng 8.000.000 xuất (Brazil 35%, Việt Nam 15%, Colombia 10%, Indonesia 5%, lại Ethiopia, Mexico, Ấn Độ; Arabica chiếm 60%) ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ HÌNH Sản lượng xuất cà phê giới từ nhiều nguồn khác (Nguồn: Chemistry of Coffee, 2010 Elsevier Ltd.,)  Giá trị cơng nghiệp giá trị khác Ngồi việc sử dụng làm thức uống hàng ngày cơng nghiệp thực phẩm cà phê chế biến thành rượu, bánh kẹo làm nước giải khát có hương vị cà phê Trong công nghiệp dược phẩm cafein sử dụng làm thuốc điều trị bệnh 1.1.3 Cấu tạo, thành phần hóa học hạt cà phê nhân tươi 1.1.3.1 Cấu tạo hạt cà phê nhân tươi HÌNH 1.3 Cấu tạo hạt cà phê nhân tươi (Nguồn: Cytology, biochemistry and molecular changes during coffee fruit development, 2006) ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 10 LÊN MEN CÀ PHÊ với hai nghiên cứu Hoàng Thị Hồng Ánh – Thạc sĩ kỹ thuật với “Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi” [1] nghiên cứu Tạ Chí Đơng Ln – Thạc sĩ khoa học, với “Nghiên cứu hình thành este thơm trình lên men hạt cà phê tươi vi khuẩn lactic” [8] Cả hai nghiên cứu tập trung vào vai trò vi khuẩn lactic trình lên men hạt cà phê nhân tươi, tiêu đánh giá dựa khả sinh acid lactic số este thơm vi khuẩn, nhằm cơng nghiệp hóa q trình lên men, cải thiện hương vị hạt cà phê tươi Từ đem lại hiệu kinh tế đáng kể cho loài công nghiệp chiến lược nước ta 1.4.2 Ngoài nước Bắt đầu từ năm 2000, nhà khoa học giới nghiên cứu cà phê lên men, bật lên nghiên cứu ảnh hưởng hệ vi sinh vật tác động mạnh mẽ đến chất lượng cà phê sau lên men Theo Sylvie Avallone cộng [20], chủng vi khuẩn lactic nấm men cho kết phát triển tốt giống vi sinh vật phát triển bình thường điều kiện mơi trường có pectin cà phê Leuconostoc mesenteroides lồi vi khuẩn phân lập cà phê tươi cho kết khả quan khả tạo hương cho cà phê lên men Bên cạnh đó, Godwin A cộng sử dụng chủng nấm men bao gồm chủng Pichia anomala (P.aS12, P.aS14, P.aS16), chủng Pichia kluyveri (PS7Y1, PkS4Y3, PkS13Y4) với chủng LAB phân lập từ cà phê tươi bao gồm Leuconostoc/Weissella (BFE 6997, 6989), Lactobacillus spp lên men đồng hình (BFE 6853, 6823), Lactobacillus spp lên men dị hình (BFE 6812) Enterococcus (BFE 6803) mơi trường khởi động ban đầu cho q trình lên men ướt cà phê tươi Kết cho thấy phát triển vi khuẩn lactic mạnh mẽ so sánh với nấm men khơng có phát triển nấm mốc pH môi trường đạt 4,2 sau 72h lên men CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 2.1.1 Thời gian Đề tài thực từ tháng 10/2014 đến tháng 12/2014 2.1.2 Địa điểm ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 31 LÊN MEN CÀ PHÊ Tại phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật Trường ĐH CNTP TPHCM, Trung Tâm Thí Nghiệm sở 2.2 Vật liệu thí nghiệm 2.2.1 Đối tượng - Hạt cà phê tươi - Chủng nấm men phân lập hạt cà phê tươi 2.2.2 Môi trường - Môi trường nuôi cấy Hansen - Mơi trường thử sinh hóa - Mơi trường thực nghiệm 2.2.3 Hóa chất Đường glucose Pepton KH2PO4 MgSO4 Agar KCl 2.2.4 Thiết Bị Cồn 700, 900 NaOH HCl Xanh methylen DAP Nồi hấp Cân điện tử số Bếp điện Máy đo OD Máy lắc ổn nhiệt Tủ ấm Kính hiển vi điện tử Tủ lạnh Máy đo pH Brix kế 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu Tuyển chọn nấm men ThS.TRẦN QUỐC HUY Quá trìnhTrang khảo 32 sát LÊN MEN CÀ PHÊ Xác định tỉ lệ nấm men phù hợp cho trình lên men xác định chủng nấm men phù hợp cho trình lên men Xác định độ ẩm tối ưu cho q trình lên HÌNH 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.4 men Phương pháp thiết kế thí nghiệm 2.4.1 Lựa chọn chủng nấm men thích hợp cho trình lên men đạt số este cao Cơ sở: Tận dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn hạt cà phê tươi để làm nguồn chất cho nấm men phát triển Mục đích: chọn chủng nấm men có khả lên men cà phê tốt Bố trí thí nghiệm : Tiến hành lên men với 03 chủng phân lập + Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường) + Tỷ lệ khối lượng cà phê hạt tươi/khối lượng nước: 40:60 + Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men ngày Tiêu chí đánh giá: số este 2.4.2 Khảo sát độ ẩm phù hợp cho trình lên men Mục đích:Khảo sát độ ẩm tối ưu cho phát triển hệ vi sinh vật trình lên men cà phê tươi Cách tiến hành: - Thực lên men cà phê điều kiện tối ưu khảo sát trên, với độ ẩm khác nhau: 50%, 60%, 70%, 80% (g/g) Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường) Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men ngày Tiêu chí đánh giá: Dựa vào số este ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 33 LÊN MEN CÀ PHÊ 2.4.3 Khảo sát tỷ lệ nấm men phù hợp cho q trình lên men Mục đích: Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao Cách tiến hành: + Tiến hành bổ sung hỗn hợp nấm men / khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với tỉ lệ 2%, 4%, 6%, 8% khối lượng + Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường) + Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men ngày + Chủng giống khối lượng cà phê/khối lượng nước khảo sát thí nghiệm Tiêu chí đánh giá: Dựa vào số este 2.5 Phương pháp phân tích Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA để phân tích kết đạt 2.6 Phương pháp xác định số este (TCVN 8452:2010) Chỉ số este biểu diễn lượng miligam KOH dùng để trung hịa lượng acid giải phóng thủy phân este có gam dịch môi trường Trong dịch môi trường sau lên men kết hợp vi khuẩn lactic nấm men xuất nhiều hợp chất, số đáng kể hợp chất ethyl lactate – CH3CH(OH)COOC2H5 - hợp chất este thơm Xác định số este, phần đánh giá khả làm tăng mùi vị trình lên men Tiến hành: Để xác định số este, ta tiến hành nuôi cấy kết hợp với chủng nấm men Saccharomyces sp Canh trường sau lên men 28h đem ly tâm 10000 vòng/5 phút thu lấy dịch lên men Cân xác 10g dịch lên men Chuẩn độ lượng acid có dịch lên men KOH 0,1N với thị phenolphtalein đến xuất màu hồng ổn định.Sau đó, lấy mẫu xà phịng hóa với KOH 0,5N chuẩn độ kiềm dư dung dịch H2SO4 0,5N đến màu hồng.Đồng thời tiến hành làm mẫu kiểm chứng song song khơng có dịch lên men Cơng thức tính số este: CSE = CSS – CSA Với: CSA số acid biểu diễn lượng miligam KOH cần thiết dùng để trung hòa acid tự gam dịch môi trường xác định công thức: ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 34 LÊN MEN CÀ PHÊ CSA = 5,61 × (mg/g) CSS số xà phịng hóa có cơng thức là: CSSV= 28,05 × , (mg/g) Trong đó: 5,61: lượng milogam KOH chứa 1ml KOH 0,1N 28,05: số miligam KOH chứa 1ml KOH 0,5N a: thể tích ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ dịch môi trường b: thể tích H2SO4 (ml) dùng chuẩn độ mẫu kiểm chứng c: thể tích H2SO4 (ml) dùng chuẩn độ lượng kiềm dư g: lượng dịch lên men dùng thí nghiệm (g) 2.7 Sơ đồ quy trình thực nghiệm Cà phê hạt Nghiền dập Chuẩn hóa Nấm men tan Vỏ trấu Mơi trường Lên men Sấy khô Chà sát Sấy/phơi Cà phê nhân lên men HÌNH 2.2 Sơ đồ quy trình thực nghiệm ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 35 LÊN MEN CÀ PHÊ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát động thái sinh trưởng chủng YH3, YT2, S.cerevisea - Khả sinh trưởng 03 chủng nấm men YH3, YT2 (được phân lập từ café tươi) chủng S.cerevisea xác định cách tiến hành nuôi cấy 03 chủng ống nghiệm môi trường Hansen nhiệt độ 300C khoảng thời gian 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h - Sau khoảng thời gian nuôi cấy tương ứng nêu , tiến hành đo độ đục (mật độ quang) dịch canh trường (OD) mẫu thực nghiệm thu bước sóng = 610nm Kết thể bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1: Động thái sinh trưởng chủng YH3, YT2 S.cerevisea Thời gian YH3 YT2 S.cerevisea ThS.TRẦN QUỐC HUY 12h 0,478 0,515 0,512 24h 0,903 1,124 1,117 36h 1,019 1,352 1,278 Trang 36 48h 1,022 1,367 1,285 60h 1,020 1,365 1,283 72h 1,018 1,358 1,279 LÊN MEN CÀ PHÊ Hình 3.1: Động thái sinh trưởng phát triển 03 chủng nấm men YH3, YT2 S.cerevisiae phụ thuộc vào thời gian (h) - Kết cho thấy: thời gian ni cấy có ảnh hưởng lớn đến trình tạo sinh khối 03 chủng nấm men: + Trong khoảng thời gian từ 12h – 36h, mật độ tế bào chủng tăng lên cách rõ rệt, giai đoạn mà chủng nấm men tăng sinh khối Do giá trị OD610nm đo tăng lên cách rõ rệt, để nhanh chóng đạt pha logarid cực đại 36h + Trong khoảng thời gian từ 36h – 48h, giá trị sinh khối đo 03 chủng nấm men YH3, YT2 S.cerevisiae tăng không đáng kể Điều cho thấy 03 chủng nấm men bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển cân +Trong khoảng thời gian từ 60h – 72h, giá trị sinh khối đo 03 chủng nấm men bắt đầu giảm so với thời điểm 36h 48h Điều chứng tỏ chủng nấm men dần chuyển sang giai đoạn “suy vong” yếu tố môi trường như: chất dinh dưỡng môi trường dần cạn kiệt, pH môi trường giảm hình thành acid, … - Như biết: giá trị OD đo bước sóng 610nm xác định sinh khối chủng nấm men bao gồm tổng số tế bào có canh trường (cả tế bào sống tế bào chết) Tuy nhiên, giá trị sinh học vi sinh vật thể qua số tế bào sống Vì việc xác định lượng tế bào sống tổng số tế bào quan trọng, nhằm đánh giá khả lên men thực 03 chủng nấm men YH3, YT2 S.cerevisiae sử dụng sinh khối có giá trị OD cực đại thời điểm 36h (OD 610nm 36h hai chủng 1,019; 1,352; 1,278) Quá trình xác định số lượng tế bào sống thực theo phương pháp xác định số lượng tế bào sống ml canh trường Kết bảng 3.2 sau: Bảng 3.2: Số lượng tế bào sống ml canh trường (CFU/ml) tương ứng với độ pha loãng thập phân Chủng nấm men YH3 -4 Độ pha loãng (fi) 10 10-5 Số lượng khuẩn lạc đĩa 95; 69 29; 47 Số vi khuẩn/1 ml canh trường (CFU/ml) 0,11x107 YT2 10 10-6 92; 78 26; 53 -5 1,132x107 S.cerevisiae 10 10-6 56; 44 29; 19 -5 0,614 x 107 Vậy sau 36h nuôi cấy môi trường Hansen, sinh khối vi sinh vật đạt giá trị cực đại thời điểm đó, 03 chủng nấm men YH3, YT2 S.cerevisiae có số lượng tế bào sống 0,11x107; 1,132x107; 0,614x107 ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 37 LÊN MEN CÀ PHÊ Do nhóm chọn canh trường nấm men nuôi cấy môi trường Hansen sau 36h để bổ sung vào khối lên men cà phê hạt tươi nghiên cứu khả tạo este 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men cà phê 3.2.1 Lựa chọn chủng nấm men bổ sung vào trình lên men cà phê hạt tươi - Tiến hành lên men cà phê với chủng nấm men xác định tốc độ sinh trưởng - Trong đó: + Mẫu A1, A2, A3 mẫu thực nghiệm bổ sung 4% chủng nấm men sau: YH3, YT2, S.cerevisiae + Mẫu A4 mẫu đối chứng - Khối lượng cà phê/khối lượng nước: 40:60 - Lượng cà phê tươi đem lên men 100g - Mẫu lên men ủ 370, ngày - Kiểm tra số este sau kết thúc trình lên men Kết quả: Kết phân tích số este 04 mẫu cà phê sau lên men thể bảng sau Bảng 3.3: Kết phân tích số este 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men có bổ sung hỗn hợp 03 chủng nấm men Mẫu Chỉ số este (mg/g) 41,1 43,7 42,9 38,5 A1 (YH3) A2 (YT2) A3 (S.cerevisiae) A4 (Đối chứng) Kết cho thấy: + 03 mẫu thực nghiệm có bổ sung nấm men lượng este tạo thành cao mẫu không bổ sung nấm men (mẫu đối chứng) Qua ta thấy vai trị nấm men q trình lên men cà phê + Trong 03 mẫu thực nghiệm: mẫu A2 cho lượng este cao (43,7 mg/g), mẫu A1 cho lượng este thấp (41,1 mg/g) - Chọn chủng YT2 để tiếp tục khảo sát 3.2.2 Ảnh hưởng độ ẩm - Để xác định độ ẩm phù hợp cho trình lên men khối cà phê hạt tươi, nhằm thu khối hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 38 LÊN MEN CÀ PHÊ - Tiến hành bổ sung hỗn hợp khối lượng cà phê tươi/khối lượng nước theo tỷ lệ 50:50; 40:60; 30:70; 20:80 - Tỷ lệ giống cấy vào 4% (v/w) - Lượng cà phê tươi sử sụng để lên men mẫu 100g - Trong đó: + M1, M2, M3, M4: 04 mẫu thực nghiệm có bổ sung nước theo tỉ lệ khối cà phê hạt tươi/khối lượng nước bổ sung 50:50; 40:60; 30:70; 20:80, ủ 370 ngày +MĐc: mẫu đối chứng không bổ sung nước trình lên men, ủ 370 ngày - Kiểm tra số este sau kết thúc trình lên men Kết - Kết phân tích số este 04 mẫu thực nghiệm M1, M2, M3, M4 mẫu đối chứng MĐc sau: Bảng 3.4: Kết phân tích số este 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men với khối lượng cà phê/khối lượng nước thay đổi Mẫu M1 (50:50) M2 (40:60) M3 (30:70) M4 (20:80) MĐc Chỉ số este (mg/g) 39,2 41,5 44,7 43,2 32,1 Phân tích kết quả: Kết cho thấy số este sinh mẫu cà phê hạt tươi sau lên men hoàn toàn khác tùy thuộc vào lượng nước bổ sung vào Trong , mẫu M3 cho kết este cao (44,7 mg/g), thấp mẫu đối chứng không bổ sung nước MĐc 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men bổ sung vào trình lên men cà phê hạt tươi - Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp nhằm thu kết tốt chất lượng cà phê sau lên men - Tiến hành lên men cà phê hạt tươi với tỷ lệ nấm men YT2 (mật độ tế bào = 1,132 TB/ml canh trường) bổ sung 2%, 4%, 6%, 8% - Khối lượng cà phê/khối lượng nước: 30:70 - Lượng cà phê sử dụng để lên men 100g - Tiến hành ủ 370, ngày - Kiểm tra số este sau lên men Kết quả: ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 39 LÊN MEN CÀ PHÊ Kết kiểm tra số este mẫu cà phê lên men thể sau: Bảng 3.5: Kết phân tích số este 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men với tỷ lệ giống thay đổi Mẫu Chỉ số este (mg/g) B1 (2%) B2 (4%) B3 (6%) B4 (8%) 42,8 43,1 44,9 44,2 Kết cho thấy: + Từ mẫu B1, B2, B3 lượng este tạo tăng dần tỷ lệ thuận với lượng giống bổ sung vào 2%, 4%, 6% + Mẫu B3 (bổ sung 6% giống) cho lượng este cao 44,9 mg/g CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ kết thực nghiệm thời gian làm đồ án, chúng em có số kết luận sau: Lựa chọn chủng YT2 có khả lên men khối cà phê hạt tươi đạt số este cao (43,7 mg/g) Tỷ lệ khối lượng cà phê/khối lượng nước để trình lên men xảy tốt, cà phê sau lên men đạt số este cao (44,7 mg/g) 30:70 Xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp để đạt số este cao (44,9 mg/g) 6% giống Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác nhiệt độ lên men, thời gian lên men để hồn thiện q trình lên men cà phê hạt tươi ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 40 LÊN MEN CÀ PHÊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Hoàng Thị Hồng Ánh, Luận Văn Nghiên cứu vai trị vi khuẩn lactic qúa trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi, 2010 Chuyên Ngành Công Nghệ Thực Phẩm Và Đồ Uống, Trường Đại Học Đà Nẵng ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 41 LÊN MEN CÀ PHÊ [2] Lê Đình Lương Nấm men – đối tượng cổ điển đại công nghệ sinh học Tạp chí hoạt động khoa học, 12- 1990 [3] Lương Đức Phẩm Nấm men công nghiệp NXB KHKT, Hà Nội [4] Nguyễn Đình Quyến Sinh lý, sinh hóa vi sinh vật NXBKH- KT, Hà Nội, 2009 [5] Nguyễn Đức Lượng Công nghệ vi sinh tập 1, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, 2000 [6] Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men đièu kiện sản xuất sinh khối Tạp chí sinh học 1,3 1986 [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Giáo trình vi sinh vật học NXB Giáo dục, 2007 [8] Tạ Chí Đơng Ln, Luận Văn Nghiên cứu sư hình thành este thơm trình lên men hạt cà phê tươi vi khuẩn lactic, 2011 Chuyên Ngành Hóa Hữu Cơ Trường Đại Học Đà Nẵng Tài liệu Tiếng Anh [9] Carol AR, Leon 2010 Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota: what are the possibilities? A review Archives of Microbiology 193(3), 157 – 168 [10] Charrier A, Berthaud J (1985) Botanical classification of coffee In : Clifford MN and Willson KC (Eds) Coffee: Botany, biochemstry and production of beans and beverage, pp 13 – 47 Croom Helm, London [11] Clarke, R J Coffee: green coffee/roast and ground In: Encyclopedia of Food Science and Nutrition, 2nd edition, Caballero, B., Trugo, L C., Finglas, P., eds Oxford: Academic Press; 2003, Vol [12] Clifford MN (1985a) Chemical and physical aspects of green coffee and coffee products In: Clifford MN and Willson KC (Eds) Coffee: Botany, biochemstry and production of beans and beverage, pp 305 – 375 Croom Helm, London [13] Erin, Connor Cox, Ingledew Elleviation of the effects of nitrogen limitiation in high gravity worts through increased inoculation, 1999 [14] E Caplice, G F Fitzgerald, Int J Food Microbiol., 1999, 50, 131 – 149 [15] Hutkins RW (2006) Microbiology and Technology of Fermented Foods Blackwell Publishing, lowa, USA, p.24 ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 42 LÊN MEN CÀ PHÊ [16] Krishnakumar V, Gordon IR (2001) Probiotics: Challenges And Opportunities Dairy ind Int 66: 36 – 40 [17] Prescott S.C; Dunn C.G Industrial microbiology 3rd.ed Mc Graw – hill book Company new york: 189 – 192, 1979 [18] Schenker, S R (2000) Investigations on the Hot Air Roasting of Coffee Beans Swiss Federal Institute of Technology [19] Shah NP (2007) Functional Culture And Health Benefits Int dairy j 17: 1262 – 1277 [20] Sylvie Avallone, Bernard Guyot, Jean – Marc Brillouet, Eugenia Olguin, Joseph – Pierre Guirand Microbiological ang Biochemical Study of Coffee Fermentation 2001 Current Microbiology, Vol 42, Issue 4, pp 252 – 256 [21] Villee C A., Vincent G , Pethier Biolgical principles and processes [22] Philadelphia- London- Toronto, 1971 Zaithin M, Day P Biotechnology in plant science relevance to agricultural in the eighties Newyork London Academic press:392, 1986 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp nhuộm Gram Bước 1: Chuẩn bị vết bơi: Dùng que cấy vơ trùng lấy vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24 giờ) hòa vào giọt nước cất phiến kính, làm khơ khơng khí Bước 2: Cố định tiêu bản: Hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn – lần ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 43 LÊN MEN CÀ PHÊ Bước 3: Nhỏ dung dịch tím gentian lên tiêu – phút Bước 4: Rửa nước nhanh, vẩy khô nước Bước 5: Nhỏ dung dịch lugol để phút (tiêu có màu nâu đen) Bước 6: Rửa nước nhanh, vẩy khô nước Bước 7: Nhỏ cồn aceton từ đầu phiến kính, nghiêng phiến kính cho cồn chảy qua vết vi sinh vật Bước 8: Rửa nước nhanh Bước 9: Nhỏ dung dịch fucshin loãng để phút Bước 10: Rửa nước Bước 11: Thấm khô, hơ khơ, xem kính Cần ý: Bước tẩy màu cồn aceton quan trọng Nếu tẩy khơng kỹ dễ nhầm lẫn, tẩy lâu vi khuẩn Gram dương màu tím nhuộm màu đỏ fuchsin bắt màu đỏ Ghi nhận tượng nhuộm màu vi khuẩn quan sát vật kính dầu 100x Ghi nhận hình thái Phụ lục Phương pháp đo độ đục Ở phương pháp mật độ vi sinh vật xác định cách gián tiếp thông qua độ đục (ở bước sóng 610nm) Nguyên tắc dựa cản ánh sáng phần tử không tan lơ lửng pha lỏng hình thành hệ huyền phù có độ đục diện chúng làm phân tán chùm ánh sáng tới Độ đục huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào.Trong giới hạn định độ đục mật độ tế bào xác lập quan hệ tuyến tính chúng, thơng qua máy so màu bước sóng 550 – 610nm Phụ lục Phụ lục Môi trường nuôi cấy nấm men ( mơi trường Hansen) STT Tên hóa chất Hàm lượng (g/l) Glucoza 20g/l ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 44 LÊN MEN CÀ PHÊ Pepton 10g/l KH2 PO4 3g/l MgSO4.7H2O 2,5g/l Agar - agar 20g/l Nước cất 1(l) Thanh trùng 1210C thời gian 20 phút Đây môi trường giữ giống nhân giống nấm men ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 45 ... cho q trình lên men cà phê ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang LÊN MEN CÀ PHÊ - Xác định tỷ lệ nấm men bổ sung tối ưu cho trình lên men - Xác định độ ẩm tối ưu trình lên men Ý nghĩa thực tiễn đề tài Tạo dòng... giống nấm men bổ sung vào trình lên men cà phê hạt tươi - Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp nhằm thu kết tốt chất lượng cà phê sau lên men - Tiến hành lên men cà phê hạt tươi với tỷ lệ nấm men YT2... cho trình lên men khối cà phê hạt tươi, nhằm thu khối hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao ThS.TRẦN QUỐC HUY Trang 38 LÊN MEN CÀ PHÊ - Tiến hành bổ sung hỗn hợp khối lượng cà phê tươi/khối