1.4.1. Trong nước
Nước ta là một trong những nước xuất khẩu cà phê với sản lượng lớn trên thế giới. Bên cạnh đó cũng xuất hiện nhiều khu vực sản xuất “cà phê chồn” nổi tiếng. Nhưng khái niệm về cà phê lên men vẫn còn rất xa lạ. Đến thời điểm hiện nay, nổi bật
với hai bài nghiên cứu của Hoàng Thị Hồng Ánh – Thạc sĩ kỹ thuật với bài “Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi” [1] và bài nghiên cứu của Tạ Chí Đông Luân – Thạc sĩ khoa học, với bài “Nghiên cứu sự hình thành este thơm trong quá trình lên men hạt cà phê tươi bằng vi khuẩn lactic” [8]. Cả hai bài nghiên cứu đều tập trung vào vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men hạt cà phê nhân tươi, chỉ tiêu đánh giá dựa trên khả năng sinh acid lactic và chỉ số este thơm của vi khuẩn, nhằm công nghiệp hóa quá trình lên men, cải thiện hương vị của hạt cà phê tươi. Từ đó đem lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho loài cây công nghiệp chiến lược này ở nước ta.
1.4.2. Ngoài nước
Bắt đầu từ năm 2000, các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về cà phê lên men, trong đó nổi bật lên là những nghiên cứu về sự ảnh hưởng của hệ vi sinh vật tác động mạnh mẽ đến chất lượng của cà phê sau lên men. Theo Sylvie Avallone và cộng sự [20], 2 chủng vi khuẩn lactic và nấm men cho kết quả phát triển tốt nhất trong khi những giống vi sinh vật vẫn phát triển bình thường trong điều kiện môi trường có pectin của cà phê. Leuconostoc mesenteroides là loài vi khuẩn đã được phân lập trên cà phê tươi và cho kết quả rất khả quan về khả năng tạo hương cho cà phê lên men. Bên cạnh đó, Godwin A và cộng sự đã sử dụng 6 chủng nấm men bao gồm 3 chủng Pichia anomala (P.aS12, P.aS14, P.aS16), 3 chủng Pichia kluyveri (PS7Y1, PkS4Y3, PkS13Y4) cùng với 6 chủng LAB đã phân lập được từ cà phê tươi bao gồm
Leuconostoc/Weissella (BFE 6997, 6989), Lactobacillus spp. lên men đồng hình (BFE
6853, 6823), Lactobacillus spp. lên men dị hình (BFE 6812) và Enterococcus (BFE 6803) như là môi trường khởi động ban đầu cho quá trình lên men ướt cà phê tươi. Kết quả cho thấy sự phát triển của vi khuẩn lactic là mạnh mẽ nhất khi so sánh với nấm men và không có sự phát triển của nấm mốc. pH của môi trường đạt 4,2 sau 72h lên men.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
2.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2014 đến tháng 12/2014
Tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Công Nghệ Sinh Học Thực Vật Trường ĐH CNTP TPHCM, Trung Tâm Thí Nghiệm cơ sở 3
2.2. Vật liệu thí nghiệm 2.2.1. Đối tượng - Hạt cà phê tươi
- Chủng nấm men đã được phân lập trên hạt cà phê tươi.
2.2.2. Môi trường
- Môi trường nuôi cấy Hansen
- Môi trường thử sinh hóa
- Môi trường thực nghiệm
2.2.3. Hóa chất
Đường glucose Cồn 700, 900
Pepton NaOH
KH2PO4 HCl
MgSO4 Xanh methylen
Agar DAP
KCl
2.2.4. Thiết Bị
Nồi hấp Cân điện tử 4 số
Bếp điện Máy đo OD
Máy lắc ổn nhiệt Tủ ấm
Kính hiển vi điện tử Tủ lạnh
Máy đo pH Brix kế
2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu
HÌNH 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm
2.4.1. Lựa chọn chủng nấm men thích hợp cho quá trình lên men đạt chỉ số este cao.
Cơ sở: Tận dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn trong hạt cà phê tươi để làm nguồn
cơ chất cho nấm men phát triển.
Mục đích: chọn được chủng nấm men có khả năng lên men cà phê tốt nhất. Bố trí thí nghiệm : Tiến hành lên men với các 03 chủng đã được phân lập.
+ Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường)
+ Tỷ lệ khối lượng cà phê hạt tươi/khối lượng nước: 40:60 + Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men 4 ngày
Tiêu chí đánh giá: chỉ số este.
2.4.2. Khảo sát độ ẩm phù hợp cho quá trình lên men
Mục đích:Khảo sát độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của hệ vi sinh vật trong quá trình
lên men cà phê tươi.
Cách tiến hành:
- Thực hiện lên men cà phê trong các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên, với độ ẩm khác nhau: 50%, 60%, 70%, 80% (g/g)
- Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường)
- Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men 4 ngày
Tiêu chí đánh giá: Dựa vào chỉ số este.
xác định chủng nấm men phù hợp cho quá trình lên men Xác định tỉ lệ nấm men phù hợp cho quá trình lên men Xác định độ ẩm tối ưu cho quá trình lên men
2.4.3. Khảo sát tỷ lệ nấm men phù hợp cho quá trình lên men
Mục đích: Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm
lượng este cao.
Cách tiến hành:
+ Tiến hành bổ sung hỗn hợp nấm men / khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỉ lệ 2%, 4%, 6%, 8% khối lượng.
+ Tỷ lệ giống cấy 4% (107 tb/1 ml canh trường)
+ Nhiệt độ lên men 370, thời gian lên men 4 ngày
+ Chủng giống và khối lượng cà phê/khối lượng nước như đã khảo sát ở các thí nghiệm trên.
Tiêu chí đánh giá: Dựa vào chỉ số este.
2.5. Phương pháp phân tích
Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA để phân tích những kết quả đạt được.
2.6. Phương pháp xác định chỉ số este (TCVN 8452:2010)
Chỉ số este biểu diễn bằng lượng miligam KOH dùng để trung hòa lượng acid được giải phóng do thủy phân các este có trong 1 gam dịch môi trường. Trong dịch môi trường sau khi lên men kết hợp giữa vi khuẩn lactic và nấm men sẽ xuất hiện nhiều hợp chất, trong số đó đáng kể nhất là hợp chất ethyl lactate – CH3CH(OH)COOC2H5 - một hợp chất este thơm. Xác định được chỉ số este, chúng ta có thể phần nào đánh giá được khả năng làm tăng mùi vị của quá trình lên men này.
Tiến hành:
Để xác định chỉ số este, ta tiến hành nuôi cấy kết hợp với chủng nấm men
Saccharomyces sp.
Canh trường sau khi lên men 28h đem ly tâm 10000 vòng/5 phút thu lấy dịch lên men. Cân chính xác 10g dịch lên men. Chuẩn độ lượng acid có trong dịch lên men bằng KOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein đến khi xuất hiện màu hồng ổn định.Sau đó, lấy mẫu này xà phòng hóa với KOH 0,5N và chuẩn độ kiềm dư bằng dung dịch H2SO4 0,5N đến khi mất màu hồng.Đồng thời tiến hành làm một mẫu kiểm chứng song song không có dịch lên men.
Công thức tính chỉ số este: CSE = CSS – CSA
Với: CSA là chỉ số acid biểu diễn bằng lượng miligam KOH cần thiết dùng để trung hòa acid tự do trong 1 gam dịch môi trường được xác định bởi công thức:
CSA = 5,61 × (mg/g)
CSS là chỉ số xà phòng hóa có công thức là: CSSV= 28,05 × , (mg/g)
Trong đó:
5,61: lượng milogam KOH chứa trong 1ml KOH 0,1N 28,05: số miligam KOH chứa trong 1ml KOH 0,5N
a: thể tích ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ dịch môi trường
b: thể tích H2SO4 (ml) dùng chuẩn độ mẫu kiểm chứng c: thể tích H2SO4 (ml) dùng chuẩn độ lượng kiềm dư g: lượng dịch lên men dùng thí nghiệm (g)
2.7. Sơ đồ quy trình thực nghiệm
HÌNH 2.2. Sơ đồ quy trình thực nghiệm
Cà phê hạt Nghiền dập Chuẩn hóa Lên men Sấy khô Chà sát Sấy/phơi
Cà phê nhân lên men Nấm men tan
Môi trường
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát động thái sinh trưởng của chủng YH3, YT2, S.cerevisea.
- Khả năng sinh trưởng của 03 chủng nấm men YH3, YT2 (được phân lập từ café tươi) và chủng S.cerevisea được xác định bằng cách tiến hành nuôi cấy 03 chủng này trong các ống nghiệm trên môi trường Hansen ở nhiệt độ 300C trong các khoảng thời gian 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h.
- Sau các khoảng thời gian nuôi cấy tương ứng nêu trên , chúng tôi tiến hành đo độ đục (mật độ quang) của dịch canh trường (OD) của các mẫu thực nghiệm thu được ở bước sóng = 610nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1
Bảng 3.1: Động thái sinh trưởng của chủng YH3, YT2 và S.cerevisea.
Thời gian 12h 24h 36h 48h 60h 72h
YH3 0,478 0,903 1,019 1,022 1,020 1,018
YT2 0,515 1,124 1,352 1,367 1,365 1,358
Hình 3.1: Động thái sinh trưởng và phát triển của 03 chủng nấm men YH3, YT2 và
S.cerevisiae phụ thuộc vào thời gian (h).
- Kết quả cho thấy: thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo sinh khối của 03 chủng nấm men:
+ Trong khoảng thời gian từ 12h – 36h, mật độ tế bào của 3 chủng này tăng lên một cách rõ rệt, vì đây là giai đoạn mà các chủng nấm men tăng sinh khối. Do đó giá trị OD610nm đo được tăng lên một cách rõ rệt, để nhanh chóng đạt được pha logarid cực đại ở 36h.
+ Trong khoảng thời gian từ 36h – 48h, giá trị sinh khối đo được của 03 chủng nấm men YH3, YT2 và S.cerevisiae tuy tăng nhưng không đáng kể. Điều này cho thấy 03 chủng nấm men bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển cân bằng.
+Trong khoảng thời gian từ 60h – 72h, giá trị sinh khối đo được của 03 chủng nấm men bắt đầu giảm so với thời điểm 36h và 48h. Điều này chứng tỏ các chủng nấm men đang dần chuyển sang giai đoạn “suy vong” do các yếu tố môi trường như: các chất dinh dưỡng trong môi trường đã dần cạn kiệt, pH môi trường giảm do hình thành các acid, …
- Như đã biết: giá trị OD đo được tại bước sóng 610nm khi xác định sinh khối của các chủng nấm men bao gồm tổng số tế bào có trong canh trường (cả tế bào sống và tế bào chết). Tuy nhiên, giá trị sinh học của vi sinh vật chỉ được thể hiện qua số tế bào sống. Vì vậy việc xác định lượng tế bào sống trong tổng số tế bào là rất quan trọng, nhằm đánh giá khả năng lên men thực của 03 chủng nấm men YH3, YT2 và S.cerevisiae khi sử dụng sinh khối có giá trị OD cực đại tại thời điểm 36h (OD610nm ở 36h của hai chủng lần lượt là 1,019; 1,352; 1,278).
Quá trình xác định số lượng tế bào sống được thực hiện theo phương pháp xác định số lượng tế bào sống trong 1 ml canh trường.
Kết quả như bảng 3.2 sau:
Bảng 3.2: Số lượng tế bào sống trong 1 ml canh trường (CFU/ml) tương ứng
với độ pha loãng thập phân.
Chủng nấm men YH3 YT2 S.cerevisiae
Độ pha loãng (fi) 10-4 10-5 10-5 10-6 10-5 10-6
Số lượng khuẩn lạc trên đĩa 95; 69 29; 47 92; 78 26; 53 56; 44 29; 19 Số vi khuẩn/1 ml canh trường
(CFU/ml) 0,11x107 1,132x107 0,614 x 107
Vậy sau 36h nuôi cấy trên môi trường Hansen, sinh khối vi sinh vật đạt giá trị cực đại và tại thời điểm đó, 03 chủng nấm men YH3, YT2 và S.cerevisiae có số lượng tế bào sống lần lượt là 0,11x107; 1,132x107; 0,614x107.
Do đó nhóm chọn canh trường nấm men nuôi cấy trên môi trường Hansen sau 36h để bổ sung vào khối lên men cà phê hạt tươi và nghiên cứu khả năng tạo este.
3.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men cà phê
3.2.1. Lựa chọn chủng nấm men bổ sung vào quá trình lên men cà phê hạt tươi.
- Tiến hành lên men cà phê với 3 chủng nấm men đã xác định tốc độ sinh trưởng ở trên.
- Trong đó:
+ Mẫu A1, A2, A3 là mẫu thực nghiệm bổ sung 4% lần lượt các chủng nấm men sau: YH3, YT2, S.cerevisiae
+ Mẫu A4 là mẫu đối chứng
- Khối lượng cà phê/khối lượng nước: 40:60 - Lượng cà phê tươi đem lên men là 100g - Mẫu lên men được ủ ở 370, trong 4 ngày.
- Kiểm tra chỉ số este sau khi kết thúc quá trình lên men.
Kết quả:
Kết quả phân tích chỉ số este của 04 mẫu cà phê sau lên men được thể hiện trong bảng sau
Bảng 3.3: Kết quả phân tích chỉ số este của 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men có bổ
sung hỗn hợp 03 chủng nấm men Mẫu Chỉ số este (mg/g) A1 (YH3) 41,1 A2 (YT2) 43,7 A3 (S.cerevisiae) 42,9 A4 (Đối chứng) 38,5
Kết quả cho thấy:
+ 03 mẫu thực nghiệm có bổ sung nấm men lượng este tạo thành cao hơn mẫu không bổ sung nấm men (mẫu đối chứng). Qua đó ta thấy được vai trò của nấm men trong quá trình lên men cà phê.
+ Trong 03 mẫu thực nghiệm: mẫu A2 cho lượng este cao nhất (43,7 mg/g), mẫu A1 cho lượng este thấp nhất (41,1 mg/g).
- Chọn chủng YT2 để tiếp tục các khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm.
- Để xác định độ ẩm phù hợp cho quá trình lên men khối cà phê hạt tươi, nhằm thu được khối hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao.
- Tiến hành bổ sung hỗn hợp khối lượng cà phê tươi/khối lượng nước theo các tỷ lệ là 50:50; 40:60; 30:70; 20:80.
- Tỷ lệ giống cấy vào là 4% (v/w)
- Lượng cà phê tươi được sử sụng để lên men ở mỗi mẫu là 100g. - Trong đó:
+ M1, M2, M3, M4: là 04 mẫu thực nghiệm có bổ sung nước theo tỉ lệ khối cà phê hạt tươi/khối lượng nước bổ sung là 50:50; 40:60; 30:70; 20:80, và được ủ ở 370 trong 4 ngày.
+MĐc: mẫu đối chứng không bổ sung nước trong quá trình lên men, ủ ở 370 trong 4 ngày.
- Kiểm tra chỉ số este sau khi kết thúc quá trình lên men.
Kết quả
- Kết quả phân tích chỉ số este của 04 mẫu thực nghiệm M1, M2, M3, M4 và mẫu đối chứng MĐc như sau:
Bảng 3.4: Kết quả phân tích chỉ số este của 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men với
khối lượng cà phê/khối lượng nước thay đổi Mẫu Chỉ số este (mg/g) M1 (50:50) 39,2 M2 (40:60) 41,5 M3 (30:70) 44,7 M4 (20:80) 43,2 MĐc 32,1 Phân tích kết quả:
Kết quả cho thấy chỉ số este sinh ra ở các mẫu cà phê hạt tươi sau lên men hoàn toàn khác tùy thuộc vào lượng nước bổ sung vào. Trong đó , mẫu M3 cho kết quả este cao nhất (44,7 mg/g), thấp nhất là mẫu đối chứng không bổ sung nước MĐc .
3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men bổ sung vào quá trình lên men cà phê hạt tươi.
- Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp nhằm thu được kết quả tốt nhất chất lượng cà phê sau lên men.
- Tiến hành lên men cà phê hạt tươi với tỷ lệ nấm men YT2 (mật độ tế bào = 1,132 TB/ml canh trường) bổ sung lần lượt là 2%, 4%, 6%, 8%.
- Khối lượng cà phê/khối lượng nước: 30:70 - Lượng cà phê sử dụng để lên men là 100g - Tiến hành ủ ở 370, trong 4 ngày.
- Kiểm tra chỉ số este sau lên men.
Kết quả kiểm tra chỉ số este của mẫu cà phê lên men được thể hiện như sau:
Bảng 3.5: Kết quả phân tích chỉ số este của 04 mẫu cà phê hạt tươi lên men với tỷ lệ
giống thay đổi
Mẫu Chỉ số este (mg/g) B1 (2%) 42,8 B2 (4%) 43,1 B3 (6%) 44,9 B4 (8%) 44,2
Kết quả cho thấy:
+ Từ mẫu B1, B2, B3 lượng este tạo ra tăng dần tỷ lệ thuận với lượng giống bổ sung vào 2%, 4%, 6%.
+ Mẫu B3 (bổ sung 6% giống) cho lượng este cao nhất 44,9 mg/g.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Từ những kết quả thực nghiệm trong thời gian làm đồ án, chúng em có một số kết luận như sau:
1. Lựa chọn được chủng YT2 có khả năng lên men khối cà phê hạt tươi đạt chỉ số este cao nhất (43,7 mg/g)
2. Tỷ lệ khối lượng cà phê/khối lượng nước để quá trình lên men xảy ra tốt, cà phê sau lên men đạt chỉ số este cao nhất (44,7 mg/g) là 30:70.
3. Xác định được tỷ lệ giống cấy thích hợp để đạt chỉ số este cao nhất (44,9 mg/g)