Đánh giá mồi và đoạn dò trong chẩn đoán vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (SARS-CoV-2)

Nhằm tăng khả năng sàng lọc dịch bệnh COVID-19 tại Việt Nam, chúng tôi phân tích các mồi và đoạn dò trên các vùng gen E của vi rút corona được sản xuất trong nước (in-house) và đang lưu hành trên thị trường bằng kỹ thuật rRT-PCR trên 04 mẫu RNA tách chiết từ chủng vi rút bất hoạt đã biết trước nồng độ.

JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020 ĐÁNH GIÁ MỒI VÀ ĐOẠN DỊ TRONG CHẨN ĐỐN VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƯỜNG HƠ HẤP CẤP (SARS-COV-2) Hồng Quốc Cường1, Nguyễn Đức Hải1, Hồng Thùy Linh1 TĨM TẮT Nhằm tăng khả sàng lọc dịch bệnh COVID-19 Việt Nam, phân tích mồi đoạn dị vùng gen E vi rút corona sản xuất nước (in-house) lưu hành thị trường kỹ thuật rRT-PCR 04 mẫu RNA tách chiết từ chủng vi rút bất hoạt biết trước nồng độ Qua phân tích cho thấy việc phối hợp mồi, đoạn dị in-house hỗn hợp introvigen có kết phát tương đồng mồi đoạn dò sử dụng thị trường Việc lựa chọn xét nghiệm tối ưu điều cần thiết tình trạng khan hóa chất sinh phẩm để chẩn đốn SARS-CoV-2 tình hình dịch bệnh cịn diễn biến phức tạp, đặc biệt nước phát triển Kết nghiên cứu tiền đề nhằm nâng cao lực xét nghiệm sàng lọc với số lượng lớn trường hợp nghi ngờ trở vùng dịch Từ khóa: SARS-CoV-2, COVID-19, đánh giá, mồi, đoạn dò SUMMARY: ASSESSMENT OF PRIMER AND PROBES FOR SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (SARS-COV-2) DIAGNOSIS In order to increase the efficiency of SARS-CoV-2 infected screening in Vietnam, we analyzed the primers and probes for E gene which in-house and comercially manufactured by rRT-PCR on 04 extracted RNA from inactivated virus The analysis showed that the combination of primers and probes of Phu Sa in the Introvigen mixture resulted in a low RNA copy/reaction concentration The selection of an optimal test kit is essential in the context of lacking reagent chemicals for the diagnosis of SARS-CoV-2 and the epidemic situation is still complicated, especially in developing countries The results of this study are prerequisites for improving screening capacity with a large number of suspected cases returning from the epidemic area Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, evaluation, primer, probe I ĐẶT VẤN ĐỀ Tính đến ngày 26/04/2020, có 1.804.796 trường hợp nhiễm vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (SARS-CoV-2) 193.710 trường hợp tử vong [1] Cho đến nay, việc chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2 xét nghiệm qRT-PCR tiêu chuẩn vàng [2-5]; nhiên, hiệu suất phụ thuộc vào mồi, đoạn dò hỗn hợp master mix [6] Do đó, việc lựa chọn xét nghiệm tối ưu điều cần thiết tình trạng khan hóa chất sinh phẩm để chẩn đốn nhiễm SARS-CoV-2 [1, 2, 7, 8] Nhằm ứng phó với tình hình dịch bệnh cịn diễn biến phức tạp đặc biệt nước phát triển, phân tích mồi đoạn dị sử dụng phổ biến vùng gen E vi rút corona kỹ thuật rRT-PCR nhằm tăng khả sàng lọc dịch bệnh viêm đường hô hấp cấp chủng vi rút corona 2019 (COVID-19) Việt Nam II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mồi đoạn dò IDT (Integrated DNA Technologies) mồi, đoạn dò sản xuất nước (in-house) pha trộn hỗn hợp Invitrogen Platinum Hot Start PCR Master Mix 2.2 Địa điểm thời gian thực nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành phòng xét nghiệm vi rút hô hấp Viện Pasteur TP.HCM, từ tháng 03/2020 đến tháng 04/2020 2.3 Cỡ mẫu Trong nghiên cứu này, chúng tơi đánh giá mồi đoạn dị mẫu RNA tách chiết từ chủng vi rút bất Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh Tác giả Hồng Quốc Cường, Email: cuonghqpasteur@gmail.com Ngày nhận bài: 02/04/2020 SỐ (56) - Tháng 05-06/2020 Website: yhoccongdong.vn Ngày phản biện: 08/04/2020 Ngày duyệt đăng: 15/04/2020 EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC hoạt mẫu biết trước nồng độ, nồng độ lặp lại lần ngày khác 2.4 Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, đánh giá mồi, đoạn dò IDT in-house mẫu biết trước nồng độ theo phương pháp nghiên cứu công bố trước [9] 2.4.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm thẩm định: Vi rút SARS-COV-2 nuôi cấy phịng xét nghiệm an tồn sinh học cấp Viện Pasteur TP.HCM Sau đó, dịch ni cấy bất hoạt nhiệt độ 65◦C vòng trước tiến hành chiết xuất RNA vi-rút với minikit RNA vi rút QIAamp (Qiagen) theo hướng dẫn nhà sản xuất [2, 5, 6] Hỗn pha Invitrogen Platinum Hot Start PCR Master Mix với trình tự Mồi IDT công ty phù sa tổng hợp theo trình tự Tổ chức Y tế Thế giới cơng bố [2] Bảng Thành phần thể tích cho phản ứng rRT-PCR STT Thành phần Thể tích (ul)/ phản ứng Số lượng phản ứng (N) Nước tinh 3.6 3.6xN MgSO4 (50mM) 0.4 0.4xN 2X RXN mix 12.5 12.5xN Mồi xuôi (F1) 1.0 1.0xN Mồi ngược (R2) 1.0 1.0xN Probe (P1) 0.5 0.5xN Enzyme Mix 1.0 1.0xN Tổng số 20 20xN Thực chu trình nhiệt phản ứng theo hướng dẫn Tổ chức Y tế Thế giới bao gồm 04 bước sau: RT, hoạt hóa enzympolymerase, khuếch đại, ổn định Bảng Bảng Các bước thực phản ứng rRT-PCR Bước Số chu kỳ Thời gian RT 55oC 10 phút Hoạt hóa enzympolymerase 94oC 03 phút Khuếch đại 45 Ổn định Cách đọc kết quả: Kết xét nghiệm thực hệ thống Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR hiệu chuẩn định kỳ Viện Pasteur TP.HCM Mẫu dương định nghĩa dương tính tín hiệu huỳnh quang thu nhận trước chu kỳ thứ 40 phản ứng, tín hiệu phải rõ ràng 94oC 15 giây 58oC 30 giây (thu nhận tín hiệu huỳnh quang) 40oC 30 giây 2.4.2 Xử lý phân tích số liệu: Dữ liệu nhập vào phần mềm Epidata dùng phần mềm Stata 13.0 để xử lý phân tích Tần số (tỷ lệ) sử dụng biến số định tính, trung bình±độ lệch chuẩn (trung vị- tứ phân vị), độ lệch chuẩn tương đối cho biến số định lượng, sử dụng mơ hình quy tuyến tính để ước tính số R2 SỐ (56) - Tháng 05-06/2020 Website: yhoccongdong.vn 2020 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2.4 Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thông qua Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Viện Pasteur TP.HCM số 433/XN-PAS ngày 11 tháng 03 năm 2020 III KẾT QUẢ 3.1 Kết đánh mồi, đoạn dò hỗn hợp master mix Introvigen Kết phân tích cho thấy, hỗn hợp mồi, đoạn dò IDT hỗn hợp master mix Introvigen phát ngưỡng 29 copy/phản ứng với tỷ lệ 9/9 (100%) lần lặp lại Trong đó, mồi đoạn dị in-house với hỗn hợp introvigen ngưỡng phát RNA/phản ứng có kết tương tự Với nồng độ pha loãng 10-9 ½, nồng độ pha loãng thấp nhất, từ chủng SARS-CoV-2, hỗn hợp Introvigen + mồi + đoạn dò in-house IDT, hỗn hợp ghi nhận tín hiệu với tỷ lệ 5/9 lần lặp lại Bảng Kết so sánh mồi, đoạn dò IDT in-house hỗn hợp master mix Introvigen Nồng độ pha lỗng từ chủng 1:108 1:108 ½ 1:109 1:109 ½ Số copy RNA/ phản ứng IDT(ngưỡng chu kỳ) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 36.85 37.91 35.33 34.34 35,31 36.51 36.45 37.94 34.34 35.43 35,87 36.62 35.57 34.82 34.21 36.24 34.62 34.60 37.23 36.12 35.57 35.59 36.01 38.4 37.29 37.46 35.29 35.16 37.71 36.32 38.29 36.64 38.27 39.29 38.86 37.44 36.84 37.74 37.18 36.86 39,85 38.30 37.32 38.42 37.43 37.70 38,42 39.07 38.91 36.20 38.21 38.94 38,67 38.65 38.85 38.55 39.84 38.13 39,90 39.30 38.76 38,25 - 38.18 - 38.62 - - - - - - - - - 28.40 28.38 26.72 20.81 30.56 29.39 187 73 29 15 Chứng âm Chứng dương Qua phân tích cho thấy, primer-probe in-house IDT hỗn hợp introvigen có ngưỡng phát 15 10 SỐ (56) - Tháng 05-06/2020 Website: yhoccongdong.vn In-house(ngưỡng chu kỳ) - RNA/phản ứng, với R2 0.95 0.99, độ lệch chuẩn tương đối