Đề tài: Các phương pháp phân tích trong hóa sinh

Hóa sinh thực phẩm là môn học quan trọng trong ngành thực phẩm, cung cấp cho chúng ta những kiến thức cần thiết về cấu tạo cũng như sự chuyển hóa của các chất có trong thực phẩm khi đi vào cơ thể.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HĨA SINH MỤC LỤC Contents NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC HÌNH DANH SÁCH CÁC BẢNG LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I: PROTEIN .8 Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng Phương pháp biuret 11 Phương pháp lowry 13 Phương pháp Dumas 14 Phương pháp nhuộm màu .14 PHẦN II PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE 16 Định lượng đường khử phương pháp Bertrand 16 Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng Rodzevich .20 Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân acid 22 Phương pháp định lượng saccarose 24 Định lượng fructose dung dịch có lẫn đường khử khác 26 Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân acid .27 Định lượng đường khử phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử DNS 29 Xác định đường khử phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với KALIFERRYCYANURE 31 PHẦN III: LIPID (CHẤT BÉO) 32 Định lượng lipid tổng mẫu rắn phương pháp Soxhlet .33 Định lượng lipid tổng mẫu lỏng phương pháp Adam RoseGottlieb 34 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Phương pháp Chloroform- Methanol 35 Phương pháp Babcook 35 Xác định hàm lượng chất béo phương pháp Lolch .36 PHẦN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN .37 Caroten: Xác định caroten phương pháp cột 38 Xác định vitamin A phương pháp so màu .39 Xác định vitamin C 40 Xác định vitamin B1 phương pháp so màu huỳnh quang 41 PHẦN V: KHOÁNG 43 Phương pháp định lượng Canxi (trong mẫu sữa) 44 Phương pháp phân tích mangan: 44 PHẦN VI: NƯỚC .45 Nhiệt độ .45 Độ pH 45 2.1 Bằng hộp giấy màu .45 2.2 Phương pháp điện - máy đo pH 45 Độ (Transparency), độ đục (Turbidity) 46 3.1 Đo độ đĩa Secchi 46 3.2 Đo độ đục phương pháp Nephelometric 47 Tổng chất rắn hòa tan (TDS) tổng chất rắn lơ lửng (TSS) .47 4.1 Tổng chất rắn hòa tan TDS (Total dissolved Solid) .47 4.2 Tổng chất rắn lơ lửng TSS (Total Suspended Solid) 48 Độ dẫn điện (EC) .49 Nồng độ muối 49 Oxy hòa tan (DO) .50 7.1 Phương pháp Winkler 50 7.2 Phương pháp điện cực Oxy hòa tan – máy đo Oxy 51 Độ cứng tổng hợp 53 Độ kiềm tổng cộng .55 9.1 9.1.1 Độ kiềm carbonate hay độ kiềm phenolphthalein 56 Độ kiềm tổng cộng 56 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm PHẦN VII: PHÂN TÍCH ENZYME 57 I Các phương pháp xác định hoạt độ số enzyme thông dụng: 58 Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương pháp wohlgemuth 58 Xác định hoạt độ lipase 60 Khảo sát hoạt độ invertase 61 Khảo sát động học xác định hoạt độ enyme urease 63 Xác định hoạt độ enzyme peroxidase 66 Phân tích enzyme nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala 68 II Ứng dụng enzyme phân tích hóa sinh .73 Xác định cacbohydrate 73 Xác định acid hữu 74 Xác định alcohol 76 Xác định thành phần khác 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1: phương trình phản ứng thuốc thử Biuret với NH 3………………………… 11 Hình 2: Phương trình đường chuẩn…………………………………………………………12 Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein phương pháp lowry…………………….13 Hình 4: Sơ đồ hấp thụ protein bước sóng 470nm………………………………… 16 Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet…………………………………………………………………33 Hình 6:.Chai badcook………………………………………………………………………….37 Hình 7: Hệ thống micromanometre………………………………………………………… 70 Hình 8: Đồ thị đường chuẩn…………………………………………………………………74 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1: Bảng thực nghiệm luxisun………………………………………………… 19 Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn mẫu…………………………………………30 Bảng 3: Một số Vitamin phương pháp phân tích……………………………… 43 Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với nồng độ độ pha loãng khác nhau……….60 Bảng 5:Chuẩn bị ống nghiệm………………………………………………………………… .62 Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu……………………………………………………………65 Bảng 7: Kết thí nghiệm…………………………………………………………………65 Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm…………………………………………………………………….66 Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì…………………………………………72 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm LỜI MỞ ĐẦU Thực phẩm hay nói đơn giản thức ăn, chủ yếu bao gồm chất như: carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), vitamin, khoáng chất, nước, mà người hay động vật ăn hay uống được, với mục đích thu nạp chất dinh dưỡng nhằm ni dưỡng thể hay sở thích Tuy nhiên, chất thực phẩm dễ bị chuyển hóa nhiều yếu tố khác trình chế biến bảo quản.Một yếu tố enzyme.Do phản ứng enzyme mà chất lượng nguyên liệu trình chế biến bảo quản tăng lên, giảm sút.Các biện pháp công nghệ sản xuất thực phẩm kìm hãm hoạt độ enzyme tạo điều kiện để chúng hoạt động cách tối đa Tất thuộc tính lý, hố, sinh thành phần thực phấm đo được, biểu diễn dạng thông số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc định lượng thành phần hóa học thực phấm ngày trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm nghiên cứu tạo sản phẩm mới.Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học kỹ thuật, phương pháp phân tích ngày phát triển hơn, đại có độ xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất lượng quản lý sản xuất Yêu cầu đặt phải xác định hàm lượng chất có thực phẩm, hoạt độ xúc tác enzyme sản xuất thực phẩm.Trên sở biết hàm lượng nguyên liệu hay chất có thực phẩm, người ta xác định giá trị dinh dưỡng sản phẩm thực phẩm.Việc xác định hoạt độ xúc tác enzyme thực phẩm nhằm biết biến đổi diễn chế biến, từ có cách thức sản xuất cho phù hợp Hóa sinh thực phẩm môn học quan trọng ngành thực phẩm, cung cấp cho kiến thức cần thiết cấu tạo chuyển hóa chất có thực phẩm vào thể Ngày nay, có nhiều phương pháp phân tích hóa sinh thực phẩm.Trong tiểu luận này, chúng em xin trình bày số phương pháp phân tích phổ biến hóa sinh thực phẩm Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phan Minh Anh Thư giúp chúng em hồn thiện báo cáo này.Vì kiến thức chun mơn chưa tốt nên q trình tìm hiểu khơng tránh khỏi thiếu sót, mong đóng góp ý kiến bạn Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm PHẦN I: PROTEIN Protein polymer amino acid Protein có nhiều chức quan trọng  Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme)  Cấu trúc vật lý: phơ mát, bánh mì, chất tạo bọt, tạo gel… Các phương pháp xác định hàm lượng protein Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng 1.1.Nguyên tắc: Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H 2SO4 đậm đặc, hợp chất hữu bị oxy hóa Carbon hydro tham gia tạo thành CO H2O Còn nitơ sau giải phóng dạng NH kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tan dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch dung dịch NaOH, đồng thời cất thu NH3 lượng dư H2SO4 0.1N Định lượng H2SO4 0.1N dư dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua ta tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu cần phân tích 1.2.Quy trình thực  Vơ hóa mẫu Q trình tiến hành hoàn toàn tủ Hotte.Mẫu cho vào bình Kjeldahl.Tùy loại ngun liệu nhiều hay chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g, mẫu lỏng lấy từ đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL) Thêm vào từ từ 10mL H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh q trình vơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm chất xúc tác Có thể dùng Se kim loại (0.05g) dùng 0.5g hỗn hợp CuSO4 :K2SO4 (1:3) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốc trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác acid perchloric HClO 4, giải phóng oxy cho phản ứng oxy hóa.Sau thêm chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, đun mạnh hỗn hợp hoàn toàn chuyển sang dung dịch Lưu ý: q trình vơ hóa thực đơn giản cách đun trực tiếp bình Kjendahl bếp điện trình đun lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng Hướng dẫn sử dụng vơ hóa mẫu Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm - Bật cơng tắc (1) gia nhiệt trước khoảng phút - Mang găng tay bảo hộ nhẹ nhàng lắp giữ (2) chứa bình vơ hóa mẫu (4) vào - Cho dung dịch mẫu chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vơ hóa mẫu - Đóng chặt hệ thống Gaskets - Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun Sau vơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên suốt.Cần làm nguội trước lắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit  Cất đạm Chuẩn bị máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến hình lên máy sẵn sàng làm việc Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2SO4, lắp vào máy Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sục hơi: 50%, thể tích NaOH 40%: – 10mL, thời gian cất: 15 – 30 phút) Tiến hành: Chuyển toàn dung dịch mẫu sau vơ hóa xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100, thêm nước vạch định mức Lưu ý acid H 2SO4 đậm đặc háo nước tỏa nhiệt mạnh tiếp xúc với nước nên làm bay phần.Vì vậy, cần làm nguội điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đổ erlen Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống, ý khơng lắp lệch, khí ngồi, mẫu Tiến hành cất đạm máy NH giải phóng hồn tồn khỏi bình Kjendahl  Định phân Lấy erlen khỏi máy sau tráng nước cất để lấy hết mẫu bám ống.Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình định phân NaOH 0.1N Xác định hệ số hiệu chỉnh K: Đối với chất dễ thay đổi thành phần dạng rắn, muốn pha dung dịch có nồng độ xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau hiệu chỉnh nồng độ dung dịch dựa vào phản ứng với dung dịch chuẩn thích hợp Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Thủ tục hiệu chỉnh sau: - Gọi K tỷ số nồng độ thực tế (Ct) nồng độ cần pha (Cp) NaOH - Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân V (mL) NaOH 0.1N pha sẵn.Thêm giọt thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy Ct K 1.3 Tính kết quả: Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có mẫu: N= Trong đó: N – hàm lượng Nitơ tính phần trăm khối lượng a – số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3 b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ m – khối lượng mẫu đem vơ hóa, g V – tổng thể tích định mức dung dịch vơ hóa (100mL) v – thể tích dung dịch vơ hóa dùng chưng cất (10 mL) 0.0014 – lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H2SO4 0.1N K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N % Protein = % Nitrogen × 6,25(Phần lớp Protein chứa 16% N => hệ số 6,25 (100/16=6,25)) Ưu điểm phương pháp • Ứng dụng cho tất loại thực phẩm • Đơn giản, chi phí thấp • Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thô (AOAC 945.01) Nhược điểm phương pháp Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm • Khơng phải tất N protein, ngồi xác định cả: Purine, Pyrimidine DNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có > 50% N phi protein, Melamine (6N/phân tử) • Chỉ xác định hàm lượng N tổng, khơng xác định xác hàm lượng N protein • Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu Phương pháp biuret 2.1 Nguyên tắc Biuret peptide phản ứng với Cu 2+ tạo thành phức hợp có màu tím hấp thụ ánh sáng bước sóng 540nm.(Biuret hợp chất ngưng tụ urea sau bị đốt nóng) Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein mẫu  Cách pha thuốc thử Biuret Thuốc thử biuret pha từ dung dịch thuốc thử dung dịch A, B C Các dung dịch chuẩn bị sau: - Dung dịch A: 05g CuSO 5H2O hòa tan 495 mL nước ( dung dịch CuSO4 5H2O 1%) - Dung dịch B: 10g NaKC 4H4O6.4 H2O hòa tan 490 mL nước ( dung dịch NaKC4H4O6.4 H2O 2%) - Dung dịch C: 20,5g Na 2CO3 4g NaOH hòa tan định mức thành lít dung dịch (dung dịch Na2CO3 2% NaOH 0,1N) Thuốc thử biuret = mL dung dịch A + mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Hình 1: phương trình phản ứng thuốc thử Biuret với NH Amino acid đơn dipeptide không phản ứng Vùng nồng độ tuyến tính 1-5 mg/ml Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin) 2.2 Quy trình thực  Dựng đường chuẩn Pha dung dịch protein chuẩn từ huyết bò ứng với nồng độ khác 2, 4, 6, 10 (mg protein/ mL).Lấy mL dung dịch protein chuẩn mL thuốc thử biuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp lắc 15 phút nhiệt độ phòng Hỗn hợp sau đem đo độ hấp thu bước sóng 540 nm Vẽ đường chuẩn: trục hoành nồng độ protein, trục tung độ hấp thu Hình 2: Phương trình đường chuẩn  Xác định độ hấp thu mẫu thực phẩm - Trích ly protein (nếu mẫu mẫu rắn) Sau đó, ta tiến hành pha lỗng mẫu cho nồng độ protein mẫu nằm khoảng – 10 mg/mL - Lấy mL dịch trích ml thuốc thử biuret cho vào ống nghiệm lắc đảo 15 phút nhiệt độ phòng Sau đó, hỗn hợp đem xác định độ hấp thu bước sóng 540 nm 10 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm • Cân 10 g đậu nành xay thành bột khuấy vào 150 ml, cho vào bình định mức 250ml, định mức tới vạch nước cất Lọc thu dịch lọc • Khảo sát động học Chuẩn bị dãy ống nghiệm, dãy ống.Ở dãy cho dung dịch vào theo bảng sau: Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu Ống nghiệm Ure1/3 (ml) M 4 Nước (ml) cất urease 5 5 5 Dd (ml) • Đặt dãy thứ vào bể ổn nhiệt 40oC, dãy thứ vào tủ ấm 30oC xác 20 phút • Sau kết thúc thời gian thủy phân thêm vào ống nghiệm 5ml formol trung tính, lắc 2phút • Chuyển ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với nước cất Thêm vài giọtphenolphthalein 1%, định phân với NaOH 0,05N.Lặp lại thí nghiệm lần 4.3 Tính kết quả: Ở dãy ống nghiệm, tính tốn kết ghi vào bảng sau: Bảng 7: Kết thí nghiệm Ống nghiệm NaOH dùng chuẩn độ (ml) 64 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Y= số mol ure bị phân hủy (mol) [S] =số mol ure ban đầu • Trên hệ trục tọa độ vẽ đường cong biểu diễn lượng chất bị thủy phân theo nồng độ chất ban đầu nhiệt độ ( Y1 Y2 theo [S]) • Vẽ đường thẳng biểu diễn biến thiên 1/v theo 1/[S] nhiệt độ thủy phân Trong đó: v= d(S)/dt = Y/20 (v vận tốc phản ứng thủy phân) Trong đó: Vmax: vận tốc thủy phân cực đại [S]: nồng độ chất Km: số Michaelis-Menten Các đường thẳng cắt trục hoành trục tung giá trị nghịch đảo của Km Vmax.Hãy tính trị số chế độ nhiệt Xác định hoạt độ: Thực ống nghiệm sau: Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm Ống nghiệm Ure 2% (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml) Dd urease đun cách thủy (ml) 5 5 0 Mang tất ống nghiệm đặt 40oC.Sau 20 phút cho vào ống ml formol trung tính, lắc phút.Đổ ống erlen 100ml Định phân NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm thị.Lặp lại thí nghiệm lần Tính kết quả: hoạt độ urease biểu diễn số mol ure bị thủy phân lượng enzyme urease có 65 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm 1g bột đậu nành thời gian phút 40oC Trong đó: V1, V4: số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch ống nghiệm a: Thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: Tổng tích enzyme có từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu cân k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N Xác định hoạt độ enzyme peroxidase Enzyme Peroxidaza phổ biến thực vật đóng vai trị quan trọng q trình oxy hóa.Peroxidaza làm hoạt hóa peroxide đặc biệt H 2O2 Peroxidaza xúc tác phản ứng oxy hóa nhiều polyphenol amin thơm tạo thành phẩm vật khác 5.1 Nguyên tắc Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme peroxidaza phổ biến phương pháp dựa oxy hóa pirogalol thành purpurogalin có H 2O2.Phản ứng xảy theo sơ đồ sau: Purpurogalin tạo thành dạng kết tủa màu nâu không tan nước, dễ tan eter H2SO4 đậm đặc.Tùy thuộc vào chất chọn dùng pH tối thích enzyme peroxidaza có thay đổi chút Đa số trường hợp thí nghiệm tiến hành mơi trường kiềm yếu trung tính nhiệt độ thường 20 0C.Độ nhạy với nhiệt enzyme peroxidaza cao, bị vơ hoạt sau sơi.Độ nhạy dư H 2O2 lớn, tiến hành xác định hoạt độ enzyme thể tích lớn, pha thật lỗng Lượng purpurogalin tạo thành xác định hai cách: - Kết tủa purpurogalin sau lọc rửa sạch, hòa tan H 2SO4 80% đem chuẩn KMnO4 0.1N - Kết tủa purpurogalin rửa sạch, hòa tan trực tiếp eter đem xác định phương pháp so màu, đối chiếu với purpurogalin tinh khiết tan eter 66 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Chú ý: Khi xác định hoạt độ enzyme Peroxidaza phương pháp dùng piroganol làm chất cần ý piroganol H 2O2 dùng thí nghiệm có ảnh hưởng lớn đến hoạt độ nó, lượng dùng thí nghiệm khơng q giới hạn xác định Ngoài phải tuân theo cách nghiêm ngặt trật tự quy định trộn lẫn thuốc thử dịch chiết enzyme vào dung dịch H2O2 chưa thêm pirogalol Hóa chất Dung dịch H2O2 1%, dung dịch pirogalol 1% pha trước dùng H 2SO4 đậm đặc ( d = 1.84 ); H2SO4 80%, KMnO4 0.1 N, Eter etylic, Purpurogalin tinh khiết, dung dịch đệm phosphate pH = ữ 5.2 Phng phỏp thc hin ã Chun bị dịch chiết peroxidaza: Cần lấy vào cối sứ -3 gram nguyên liệu (lá, rễ, hạt,).Nghiền thật cấn thận với 20ml dung dịch đệm phosphate pH = ÷ 9, có thêm giọt toluene chloroform bột thủy tinh cát (khơng có Fe) Chuyển tồn hỗn hợp vào bình định mức 100ml dung dịch đệm sau thêm dung dịch đệm vạch Lọc nước thu dùng để xác định hoạt động enzyme peroxidaza Cho vào bình tam giác 250ml dung dịch pirogalol 1% pha cho thêm 1ml H 2O2 1% giữ nhiệt độ (20 -250C) hỗn hợp cho vào máy điều nhiệt hay nồi cách thủy 250C để yên khoảng thời gian định ( 15 phút – 20 ) tùy thuộc vào hoạt lực enzyme • Song song với thí nghiệm kiểm chứng: Lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml dung dịch enzyme peroxidaza đun sôi 10 phút với ống sinh hàn thu hồi.Làm nguội cho thêm 10ml pirogalol 1%, 1ml H 2O2 1% mẫu thí nghiệm Trong thời gian phản ứng purpurogalin tạo thành dạng kết tủa màu nâu.Thêm vào hỗn hợp phản ứng – 2ml H2SO4 đậm đặc.Lọc kết tủa purpurogalin mẫu thí nghiệm kiểm chứng qua phễu thủy tinh xốp (G - ).Rửa kết tủa nước cất nước rửa khơng cịn khử KMnO4 Sau hịa tan kết tủa trực tiếp phễu lọc H2SO4 80% (10 -20ml ) rửa phễu lọc nước cất ( lượng rửa gấp – 20 lần lượng acid đem dùng) Nếu pha lỗng khơng đủ nước, định phân khó, trái lại pha lỗng q mức làm kết tủa purpurogalin trở lại 67 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Đun nóng dung dịch thu tới 50 -60 0C chuẩn dung dịch KMnO 4, màu dung dịch chuyển từ màu nâu sang màu thẫm xanh nhạt cuối sang màu hồng dư giọt KMnO4 5.3 Tính kết Hoạt độ peroxidaza biểu thị số ml KMnO 0.1N ứng với gram vật phẩm ngiên cứu khô sau 15 phút tác dụng.Hoạt độ peroxidaza tính theo cơng thức: HdPer = Trong đó: a,b – số ml KMnO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm kiểm chứng m – trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứng 40 ml dịch chiết enzyme đem phân tích Phân tích enzyme nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala Để đánh giá chất lượng men bánh mì ngồi xác định hoạt lực enzyme chung cần thiết, không, thường sản xuất đánh giá số tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng men bánh mì định lượng cho sản xuất như: hoạt lực enzyme zimaza, maltaza, đo độ nở bột theo thời gian, nhiệt dộ với lượng men nhau, xác định độ tạo váng, 6.1 Xác định hoạt lực enzyme zimaza hay maltala a Nguyên tắc Hoạt lực enzyme zimaza hay maltala biểu thị thời gian cần thiết để tách ea 10 ml khí CO sử dụng 20 ml dung dịch đường saccarroza, glucoza hay maltoza với lượng men ép cố định thể tốc độ lên men đường glucoza, maltoza hay saccarroza.Thông thường hoạt lực nằm khoảng 30 – 40 phút men tốt, hoạt lực maltaza không 80 -90 phút men tốt b Cách xác định Dùng hệ thống micromanometre Elesco.Cân lượng men ép khoảng 0.5g hay men khơ hoạt hóa khoảng 0.2 – 0.3 cho vào cốc nhỏ hệ thống Đổ vào cốc 10 ml nước cất 350C khuấy thật cẩn thận thật dung dịch huyền phù nấm men, 68 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm cho thêm vào cốc 10 ml Dung dịch đường glucoza, saccarroza hay maltoza 10% đậy nắp kín vào chuyển van ba ngã từ vị trí A sang vị trí để cân áp suất bên với khí quyển, sau van chuyển vào vị trí B đặt cốc điều nhiệt 350C Đánh dấu thời gian từ lúc khuấy huyền phù nấm men với dung dịch đường cho vào quan sát tăng dần dung dịch NaCl ống đo áp kế xác định thời gian chất lỏng nâng lên 10 ml Thời gian đơn vị đo tốc độ lên men đường hoạt lực enzyme nấm men.Các chủng nấm men khác sử dụng sản xuất thường hoạt lực zimaza thay đổi khoảng 40 – 60 phút, hoạt lực maltaza từ 70 – 80 đến 160 phút Hình 7: Hệ thống micromanometre: Cốc nhỏ Nút kín Ống đo áp suất Ống dẫn Van ba ngã 69 Chú ý: Sau phân tích xong đổ dung dịch cách vặn van vị trí mở lắp đổ dung dịch từ cốc ra, rửa cốc sạch, lau khô Trước tiến hành xác định cần chuẩn bị: - Rót dung dịch NaCl bão hòa với dung dịch methylen xanh vào lắp ống đo áp kế dung dịch rót từ đáy ống đo đánh dấu mức mức - Vị trí xoay van phải đánh dấu vaselin ống đo khác độ với độ xác ml = 20 mm Ghi chú: Có thể xác định nhanh phương pháp tạo váng Đây phương pháp hay dùng để đánh giá nhanh sơ chất lượng men ép hay men khô men bánh mì Thường lấy 5g men ép hay – 2g men khô, cho vào cốc nhỏ thêm 50 ml nước thường (hoặc cho thêm 2.5 – 5g đường).Hòa men vào cốc quan sát bề mặt men lên sau phút.Nếu để lâu phút mà men chưa tạo váng men chưa tốt.Từ đánh giá phương pháp lực nở để xác định lượng men cho vào bột thích hợp 6.2 Xác định lực nở nấm men bánh mì a Ngun tắc • Dùng hộp nhơm hay tơn có kích thước xác định thơng thường có cấu tạo: • Mặt khn: 14.3 9.2 cm hay 150 x 100 mm • Mặt : 12.6 8.5 cm hay 140 x 90 mm • Chiều cao: 8.5 cm hay 84 mm • Dùng gỗ đặt ngang qua bột đặt lên thành hộp, đặt cao 1.5 cm Để tính thời gian bột nở đến gỗ đặt ngang bề mặt bột b Cách xác định Lấy 280g bột mì chất lượng tốt cho vào tủ ổn nhiệt nhiệt độ 30 C.Cùng thời gian cân gram men ép (cân xác đến 0.01g) cho vào tủ ăn nhiệt độ 350C với 160 ml nước muối 2.5%.Lấy 10 – 20 ml dung dịch nước muối cho vào chén có men.Lắc khơng vón cục, đem đổ vào bình nhào bột phịng hóa nghiệm, nhào với tốc độ 135 vòng/phút Dung dịch muối lại đổ vào thùng, rắc bột khơ lên nhào lại vịng phút Nếu phịng hóa nghiệm khơng có máy nhào nhào tay, phải nhào kỹ theo chế độ quy định Bột nhào xong nặn thành hình bành mì dài va để vào khn sắt Dùng gỗ để ngang qua bột, đặt cao 1.5 cm cho vào tủ ấm 35 0C.Tính thời gian cho bột vào khn đến thấy bột nở đến ngang gỗ khn Đó thời gian nở bột, hay qua đánh giá chất lượng men tốt hay men xấu Đối với men khơ: lấy 2.5 gram men hịa với 30 ml nước thường đưa vào tủ ổn nhiệt để 300C 30 phút Sau trộn với 15 gram bột lại cho vào tủ ổn nhiệt để nhiệt độ trên.Đồng thời cho vào tủ ấm 350C, 265 gram bột (đã lấy 15 gram trên) Sau cho men vào với 130 ml dung dịch muối 2.5% cho vào tủ ấm 30 – 350C.Nhào bột phút để xác định thời gian nở giống men ép Quan sát bột nở đến bề mặt gỗ, đánh giá thời gian thời gian hay lực nở men Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì Loại men Thời gian nở hay lực nở (phút) Men tốt 65 – 80 Men tốt 80 – 90 Men yếu >100 Men yếu >120 Ngồi người ta cịn đánh giá thời gian (độ bền vững) men.Trạng thái bị chảy xệ, xẫm màu hay hình dạng bề ngồi để đánh giá chất lượng men xác 6.3 Xác định hoạt độ enzyme β – glucosidasa Nguyên tắc phương pháp enzyme xúc tác phản ứng thời gian xác định, sau dừng phản ứng lượng chất hay lượng sản phẩm sinh để xác định hoạt độ chế phẩm enzyme Một đơn vị hoạt độ β – glucosidasa (UI) định nghĩa lượng enzyme có chế phẩm dùng để xúc tác thủy phân chất giải phóng micromole sản phẩm thời gian phút pH = 4.8 nhiệt độ 50 0C Ở chất p – NPG (para – nitrophenylglucoza), sản phẩm tạo p – NP (para – nitrophenol) a Nguyên tắc Sản phẩm phản ứng thủy phân chất p – NPG enzyme β – glucosidaza sau Lượng p – NP mẫu phản ứng suy từ đường chuẩn.Đường chuẩn thiết lập cách xây dựng mối quan hệ nồng độ biết mẫu có nồng độ p – NP khác với độ hấp thu bước song 405 nm (OD 405) Từ dễ dàng suy lượng chất tính theo micromole p – NP giải phóng tác dụng enzyme β – glucosidaza b Phương pháp tiến hành • Chuẩn bị ống nghiệm chứa ml dung dịch chất p – NPG (được pha dung dịch đêm acetat pH = 4.8) đun nóng bể ổn nhiệt ( t = 50 0C) với thời gian phút • Hút 0.2 ml dung dịch enzyme cần xác định hoạt độ ( pha lỗng tới nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm • Lắc đều, giữ chơ phản ứng diễn 15 phút nhiệt độ 50 0C • Dùng ml Na2CO3 1M lạnh để dừng phản ứng tạo mơi trường kiềm • Mẫu kiểm chứng thực tương tự bao gồm: 0.2 ml dịch enzyme bị vô hoạt ml Na 2CO3 1M bổ sung thêm vào hỗn hợp ml chất giữ 15 phút • Hàm lượng p – NP giải phóng đo máy so màu quang phổ bước sóng 405 nm so với mẫu kiểm chứng c Công thức tính đơn vị hoạt độ β – glucosidaza HDE = Trong đó: HDE: hoạt độ enzyme β – glucosidaza (UI/ml) a: nồng độ p – NP giải phóng (tra theo đồ thị đường chuẩn) 0.2: thể tích dịch enzyme tham gia vào phản ứng (ml) 15: thời gian tiến hành phản ứng N: hệ số pha lỗng enzyme Hình 9: Đồ thị đường chuẩn II.Ứng dụng enzyme phân tích hóa sinh 1.Xác định cacbohydrate Trong thực phẩm, cacbohydrate chiếm khối lượng lớn đóng vai trị quan trọng dinh dưỡng.Các loại đường đối tượng phân tích thường xuyên  Glucose: xác định phương pháp enzym hexokinase Phản ứng q trình xảy sau:  Fructose : enzym hexokinase tác động lên fructose Ta xác định fructose sau xác định glucose D-fructose + ATP ADP + fructose-6-phosphate fructose-6-phosphate glucose phosphate isomerase glucose-6-phosphate  Galactose : xác định theo phản ứng sau D-galactonic acid + NADH + H +galactose dehydrogenase D-galactose + NAD+  Mannose : xác định mannose tự theo phương trình phản ứng sau hexokinase D-mannose + ATP ADP + mannose-6-phosphate mannose-6-phosphate phosphomannose isomerase fructose-6-phosphate  Saccharose: thường khơng có tế bào động vật Saccharose + H2O P–fructosidase D-glucose + D-fructose  Maltose : xác định maltose theo phương trình phản ứng sau -glucosidase Maltose + H2O 2-D-glucose  Lactose: thường có sữa -galactosidase Lactose + H2O D-galactose + D-glucose  Rafinose : rafinose có củ cải đường -galactosidase Rafinose + H2O D-galactose + saccharose  Tinh bột : tinh bột có nhiều thực vật có số loài vi sinh vật Xác định tinh bột theo phương trình phản ứng sau amyloglucosidase Tinh bột + (n-1)H2O n D-glucose Xác định acid hữu Acid hữu muối chúng có nhiều ngun liệu sản phẩm thực phẩm.Chúng đóng vai trị quan trọng sinh lý người, động vật, thực vật vi sinh vật Chúng tạo trình lên men  Acetic acid : Thuộc nhóm acid bay hơi, người ta sử dụng enzym để xác định acetic acid Acetate có nhiều vang Phản ứng sau xem phản ứng thị Acetate + ATP + CoA acetyl-CoA-synthetase Acetyl-CoA + AMP + Pyrophosphate Acetyl-CoA + oxaloacetate + H2O L-malate + NAD +L-malate dehydrogenase citrate synthetase citrate + CoA oxaloacetate + NADH + H+  Ascorbic acid: giống vitamin, ascorbic acid đóng vai trò sinh học lớn sinh lý người động vật Chúng sử dụng chất phụ gia thực phẩm Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid L-ascorbic acid (XH2) + MTT PMS dehydro ascorbic acid (X) + formazan + H+ PMS: 5-methylphenazinium sulfate MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Ascorbate oxy hóa tiếp: L-ascorbic acid ascorbate oxidase dehydro ascorbic acid + H2O Người ta thường xác định ascorbic acid nước quả, rau, quả, sữa, sản phẩm thịt dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử) dithiothreitol (chất oxy hóa) L-ascorbic acid +  Aspartic acid : có nhiều nước táo xác định theo phản ứng sau L-aspartate + -oxoglutarate GOT Oxaloacetate + NADH + H oxaloacetate + L-glutamate +LMDH L-malate + NAD+  Citric acid : đóng vai trò trao đổi chất sinh vật Chúng có nhiều trái cây, sữa xác định theo phươngtrình sau Citrate citrate (pro-35) lyase oxaloacetate + acetate  Formic acid : sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn nấm sợi Acid xem chất bảo quản thực phẩm phải tuân thủ nghiêm ngặt an toàn vệ sinh thực phẩm acid formic xác định theo phương trình sau Formate + NAD+ + H2O formate dehydrogenase hydrogencarbonate +NADH + H+  Gluconic acid: sử dụng enzym gluconate kinase để xác định D-gluconate + ATP gluconate kinase D-gluconate-6-phosphate + NADP D-gluconate-6-phosphate + ADP +6.PGDH D-ribulose-5-phosphate + NADPH + H + CO2 + (6.PGDH : 6-phosphogluconic acid dehydrogenase)  Glutamic acid : enzym sử dụng glutamate dehydrogenase L-glutamate + NAD+ + H2O glutamate dehydrogenase -oxoglutarate + NADH + NH4+  3-hydroxybutyric acid: Trong trứng có nhiều 3-hydroxybutyric acid Enzym sử dụng 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (3-HBDH) D-3-hydroxybutyrate + NAD +3-HBDH acetoacetate + NADH + H+  Isocitric acid: sử dụng enzym isocitrate dehydrogenase D-isocitrate + NADP+ isocitrate dehydrogenase -oxoglutarate + NADH + CO2 + H+  Lactic acid: lactic acid tạo nhiều trình lên men L-lactate + NAD+L-lactate dehydrogenase pyruvate + NADH + H+ D- lactate + NAD+L-lactate dehydrogenase pyruvate + NADH + H+  Malic acid: có nhiều nho, rau, khác Sử dụng enzym malate dehydrogenase NAD+ L-malate + NAD+malate dehydrogenase oxaloacetate + NADH + H+ L-aspartate + -oxoglutarate GOT Oxaloacetate + L-glutamate  Oxalic acid: oxalid acid đóng vai trị quan trọng hấp thụ calcium thể người oxalate dehydrogenase Oxalate formate + CO2  Pyruvic acid: acid chu trình chuyển hóa thể Enzym sử dụng L-lactate dehydrogenase Pyruvate + NADH + H+L-lactate dehydrogenase L-lactate + NAD+  Succinic acid : acid quan trọng chu trình tricarboxylic acid succinyl-CoA-synthetase Succinate + ITP + CoA IDP + Succinyl-CoA + P pyruvate kinase IDP + PEP ITP + pyruvate Xác định alcohol  Ethanol: ethanol sản phẩm lên men đường nấm men Ngồi phương pháp bình thường, người ta cịn dùng enzym để xác định ethanol Ethanol + NAD+ alcohol dehydrogenase (ADH) acetaldehyde + NADH + H+  Glycerol: glycerol phổ biến nhiều thiên nhiên có nhiều trình lên men Glycerol + ATP ADP + PEP glycerol kinase pyruvate kinase glycerol-3-phosphate + ADP ATP + pyruvate  Alcohol đường : - Người ta xác định sorbitol enzym sorbitol dehydrogenase D-sorbitol + NAD +sorbitol dehydrogenase D-fructose + NADH + H+ - Tương tự, người ta xác định xylitol enzym sorbitol dehydrogenase Xylitol + NAD +sorbitol dehydrogenase xylulose + NADH + H+ Xác định thành phần khác  Cholesterol: cholesterol steroid có ý nghĩa lớn sinh lý người động vật Các phản ứng xác định cholesterol sau Cholesterol + O2cholesterol oxidase cholestenone + H2O2 H2O2 + methanol catalase formaldehyde + 2H2O Formaldehyde + NH4+ + acetylacetone lutidine + 3H2O  Triglyceride: xác định triglyceride esterase lipase Triglyceride + 3H2O esterase lipase glycerol + acid béo  Acetaldehyde: chất tạo mùi cho bia, yaourt loại nước giải khát Acetaldehyde + NAD+ + H2O acetaldehyde dehydrogenase acetic acid + NADH + H+  Amoniac : người ta sử dụng enzym glutamate dehydrogenase -oxoglutarate + NADH + H+ + NH4+glutamate dehydrogenase L-glutamate + NAD+ + H2O  Nitrate: enzym sử dụng để xác định nitrate nitrate reductate Nitrate + NADPH + H+nitrate reductate nitrite + NADP+ + H2O  Sulfite: enzym ứng dụng để xác định sulfite sulfite oxidase SO32- + O2 + H2O sulfite oxidase SO42- + H2O2 H2O2 + NADH + H+NADH-peroxidase 2H2O + NAD+  Creatine Creatinine: hai chất có Creatinine + H2O Creatine + ATP creatine kinase creatininase creatine creatine phosphate + ADP  Lecithin : (phosphotidylcholine) phospholipide quan trọng Lecithin + H2O phospholipase C 1,2-diglyceride + phosphorylcholine alkaline phosphatase Phosphorylcholine + H2O Choline + ATP choline kinase choline + Pi phosphorylcholine + ADP  Urea: người ta sử dụng urease để xác định urea Urea + H2O urease 2NH3 + CO2 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thí nghiệm phân tích thực phẩm_ Lê Hồng Du [2] Phân tích hóa học thực phẩm_ Hà Dun Tư [3] Hóa sinh (Phần III)_ TS Bùi Xn Đơng [4] Phương pháp phân tích thành phần hóa lý thực phẩm_TS Phạm Tại Huân [5] Thực hành hóa sinh thực phẩm_ TS Trịnh Khánh Sơn [6] Food Analysis _S.Suzanne Nielsen [7] Food Biochemistry and food processing ... kính lọc màu đen Bảng 3: Một số Vitamin phương pháp phân tích 40 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm 41 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm PHẦN V: KHỐNG Chất khống... Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm PHẦN VII: PHÂN TÍCH ENZYME 57 I Các phương pháp xác định hoạt độ số enzyme thông dụng: 58 Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương. . .Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm Phương pháp Chloroform- Methanol 35 Phương pháp Babcook 35 Xác định hàm lượng chất béo phương pháp Lolch