Tách Dòng, Thiết Kế Vector Và Chuyển Gen Liên Quan Đến Sự Tích Lũy Asen Vào Cây Thuốc Lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - ĐÀO THU TRANG TÁCH DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ Chuyên ngành sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Lê Thị Bích Thủy HÀ NỘI, 12/2015 Cơng trình hồn thành tại: - Phịng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Bích Thủy Viện CNSH, Viện HL KHCN VN Phản biện 1: PGS TS Lê Văn Sơn Viện CNSH, Viện HL KHCN VN Phản biện 2: TS Hồ Quỳnh Liên Viện Hóa sinh biển, Viện HL KHCN VN Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại: Nhà A11, tầng 2, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi 08 giờ30 ngày 22 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên - Thư viện Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Bích Thủy, trưởng phịng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình tạo điều kiện hóa chất trang thiết bị để tơi hồn thành q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn tập thể cán phòng Di truyền tế bào thực vật nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu khoa học hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy, cô giáo sở đào tạo Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam giảng dạy tạo điều kiện cho học tập Cuối xin gửi lời biết ơn tới gia đình bạn bè quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 12, năm 2015 Học viên Đào Thu Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan tình hình nhiễm KLN 1.1 Tình hình nhiễm KLN giới 1.2 Tình hình nhiễm kim loại nặng Việt Nam Tổng quan chung Asen 2.1 Asen độc tính asen 2.2 Sự phơi nhiễm Asen 2.3 Tác động nhiễm độc Asen đến sức khỏe người 2.4 Điều trị nhiễm độc Asen người .8 Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN 3.1 Phương pháp truyền thống 3.1.1 Phương pháp học 3.1.2 Phương pháp vật lý hoá học 3.2 Công nghệ xử lý KLN đất thực vật .10 3.3 Các nghiên cứu biện pháp xử lý KLN thực vật sử dụng công nghệ gen 13 3.3.1 Các nghiên cứu giới 13 3.3.2 Các nghiên cứu Việt Nam 15 Chuyển gen thực vật 18 4.1 Cơ sở khoa học chuyển gen thực vật 18 4.2 Giới thiệu chung vector sử dụng chuyển gen thực vật 19 4.2.1 Các hệ thống vector sử dụng chuyển gen thực vật 19 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.23 2.1 Nội dung nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu nghiên cứu 23 2.2.1 Nguyên vật liệu 23 2.2.2 Hóa chất thiết bị 23 2.2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2.2 Thiết bị 24 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Nuôi cấy lưu giữ chủng khuẩn 25 2.3.2 Phương pháp tách ARN 25 2.3.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 26 2.3.4 Phương pháp xử lý với enzym giới hạn 26 2.3.5 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli 27 2.3.6 Phương pháp tách chiết tinh DNA plasmid vi khuẩn E.coli .28 2.3.7 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens xung điện 29 2.3.8 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens (theo Topping, 1998 ) .29 2.3.9 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Tách dòng gen arsC từ RNA dương xỉ Pityrogramma calomelanos 32 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số 32 3.1.2 Phản ứng RT-PCR 32 3.1.3 Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT .33 3.1.4 Kiểm tra vector pBT-arsC 34 3.1.5 Xác định trình tự gen trình tự gen arsC .36 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC 38 3.2.1 Gắn gen arsC vào vector biểu pCambia 1301 38 3.2.2 Kết kiểm tra vector pCambia 1301-arsC 40 3.3 Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 42 3.4 Tạo thuốc chuyển gen mang gen arsC .43 3.5 Kiểm tra chuyển gen PCR 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens As Asen Amp Ampicillin BAP 6-benzenladenine Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase Kb Kilo base LB Môi trường theo Luria Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris bazơ – Axit acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TBKB Tế bào khả biến T-DNA Transferred-DNA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u UV Ultraviolet (light) Vir Virulence region = vùng gây độc DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh Asen Hình 1.2: Mơ hình xâm nhiễm A tumefaciens vào tế bào thực vật 19 Hình 3.1 RNA tổng số tách từ dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase .32 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 33 Hình 3.3 Kết tách chiết plasmid pBT- arsC 34 Hình 3.4 Kết PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu 35 Hình 3.5 Kết cắt pBT-arsC BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản phẩm cắt pBT-ArsC BamHI 35 Hình 3.6 Kết cắt pBT-arsC NcoI Eco72I 36 Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ dương xỉ Pityrogramma calomelanos với trình tự cơng bố ngân hàng gen NCBI (X80057.1) 37 Hình 3.8 Độ tương đồng axit amin so sánh trình tự 38 Hình 3.9 Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC .38 Hình 3.10 Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 pBT-arsC 39 Hình 3.11 Sản phẩm tinh pCambia1301 gen arsC sau cắt enzyme NcoI Eco72I 40 Hình 3.12: Kết tách chiết plasmid pCambia1301–arsC 41 Hình 3.13: Kết PCR kiểm tra có mặt gen arsC .41 Hình 3.14 Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC enzyme NcoI Eco72I 42 Hình 3.15 Kết phản ứng Colony- PCR 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 biến nạp pCambia1301- arsC 43 Hình 3.16 Hình ảnh chọn lọc mảnh tái sinh đa chồi sau chuyển gen 45 Hình 3.17 Hình ảnh chồi thuốc môi trường đa chồi bổ sung hygromycin 10mg/l cefotaxime 500mg/l 45 Hình 3.18 Khả rễ chồi môi trường RM hygromycin 10mg/l sau tuần nuôi cấy .46 Hình 3.19 Cây thuốc hoàn chỉnh trồng bầu đất: trấu: cát 47 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm PCR dòng thuốc chuyển gen 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục thiết bị 24 Bảng 2.2 Phản ứng tổng hợp cDNA 26 Bảng 2.3 Phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn 27 Bảng 2.4 Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector 27 Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh mẫu qua giai đoạn 44 MỞ ĐẦU Tình hình nhiễm mơi trường nói chung nhiễm kim loại nặng nói riêng trở thành vấn đề cấp bách xã hội đại Công nghiệp ngày phát triển dẫn tới chất thải độc hại không xử lý hay xử lý khơng đạt u cầu giải phóng vào môi trường nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng nhiễm kim loại nặng nghiêm trọng Kim loại nặng (KLN) có Hg, Cd, Pb, As, Sb, Cr, Cu, Zn, Mn, v.v thường không tham gia tham gia vào q trình sinh hố thể sinh vật thường tích luỹ thể chúng Vì vậy, KLN thường nguyên tố độc hại với sinh vật Ở Mỹ, có 43.000 vùng cơng nghiệp trọng điểm tình trạng nhiễm, 40% nhiễm KLN như: Chì (Pb), Cadmium (Cd), Crơm (Cr), Asen (As) Theo số liệu tổ chức y tế giới ô nhiễm Asen nguồn nước, nồng độ Asen khu vực nam Iowa tây Missouri Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ Asen >0,050mg/l Bệnh nhiễm độc Asen mãn tính sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm Asen (Arsenicosis) xảy nhiều nước giới mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt Gần tình trạng nhiễm độc Asen báo động, không quốc gia giới Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc…mà Việt Nam gia tăng ngày nhiều Điển khu vực Quỳnh Lôi, Hai Bà Trưng (Hà Nội) có nhiều gia đình phải chịu hậu di chứng nặng nề nhiễm độc Asen, nhiều trường hợp tử vong Với tình trạng khoan giếng bừa bãi nay, đa số nguồn nước sau khoan lên sử dụng trực tiếp mà không qua xử lý triệt để, thường sử dụng biện pháp thô sơ như: lắng, lọc để lấy nước trong…Các biện pháp loại bỏ kim loại nặng cịn lẫn nước, lại thiếu kiểm sốt hướng dẫn quan chức nên chất lượng nước làm ảnh hưởng đến sức khỏe người dân điều khó tránh khỏi Ở Hà Nội 40% giếng khoan có hàm lượng As lớn mức an tồn nhiều lần As hay cịn gọi thạch tím chất độc Các hợp chất As vô xếp vào nhóm A chất gây ung thư người gây ung thư da, phổi, thận gan, phá hủy hệ thần kinh Ngồi ra, As cịn gây bệnh tim mạch, tiểu đường thiếu Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp Topping (1998) có cải tiến với lần bố trí thí nghiệm Kết theo dõi q trình tái sinh dịng thuốc qua lần thí nghiệm giai đoạn chọn lọc khác thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh mẫu qua giai đoạn Đối tượng nghiên cứu Mảnh biến nạp Agrobacterum C58 mang pCambia1301arsC Lần chuyển gen TB ĐC (+) TB ĐC (-) TB Chọn lọc mảnh Chọn lọc cụm chồi 55/60 85/105 (91,67%) (80,95%) 53/58 79/95 (91,38%) (83,16%) 61/65 82/97 (93,85%) (84,54%) Chọn lọc rễ (lần 1) Chọn lọc rễ (lần 2) Chọn lọc rễ (lần 3) 48/85 (56,47%) 32/79 (40,51%) 49/82 (59,76%) 30/48 (62,50%) 21/32 (65,62%) 31/49 (63,27%) 22/30 (73,33%) 15/21 (71,43%) 25/31 (80,65%) 63,80% 75,14% - - - - - - - - 92,3% 82,88% 52,25% 20/20 (100%) 12/12 (100%) 15/15 (100%) 100% 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0% 32/35 (91,43%) 29/29 (100%) 31/31 (100%) 97,14% 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 100% - - - - - - - - - - - - - - - ĐC (+): Mẫu không chuyển gen môi trường không bổ sung kháng sinh ĐC (-) : Mẫu không chuyển gen mơi trường có bổ sung kháng sinh Cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC chuyển đồng thời với gen kháng hygromycin có khả tạo sản phẩm ức chế tác động hygromycin bổ sung mơi trường chọn lọc Do mơi trường GM hygromycin mg/l 10 mg/l, mảnh lá, cụm chồi, không mang cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC đồng thời khơng mang gen kháng hygromycin tái sinh phát triển Hygromycin gây ức chế trình sinh tổng hợp protein đường sinh tổng hợp khác liên quan, có hoạt động 44 lục lạp Mảnh lá, cụm chồi, bị khả hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động lục lạp bị rối loạn dẫn đến vàng chết dần Giai đoạn chọn lọc mảnh tái sinh đa chồi sau chuyển gen Theo kết tỉ lệ tái sinh mẫu (Bảng 3.1), mảnh thuốc sau chuyển gen tái sinh đa chồi môi trường chọn lọc hygromycin 5mg/l cao (92,3%/) so với đối chứng môi trường không bổ sung kháng sinh (100%) Trong mảnh đối chứng khơng chuyển gen khơng sống sót môi trường chọn lọc, vàng chết dần A B C Hình 3.16 Hình ảnh chọn lọc mảnh tái sinh đa chồi sau chuyển gen (A): Mảnh đối chứng mơi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (B): Mảnh đối chứng môi trường không bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (C): Mảnh mang cấu trúc gen chuyển arsC mơi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l kháng sinh cefotaxime 500mg/l Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen Những cụm chồi từ mảnh tái sinh đa chồi tốt chuyển sang môi trường chọn lọc GM hygromycin 10mg/l để tăng áp lực chọn lọc, sàng lọc cụm chồi có gen kháng hygromycin chuyển vào khơng hoạt động phiên mã, dịch mã (Hình 3.17) Hình 3.17 Hình ảnh chồi thuốc mơi trường đa chồi bổ sung hygromycin 10mg/l cefotaxime 500mg/l 45 Trong môi trường tái sinh đa chồi tăng nồng độ kháng sinh hygromycin lên 10mg/l, chồi thuốc khơng có gen chuyển vào vàng dần, không phát triển chết Các chồi mang gen chuyển thành công phát triển xanh tốt Giai đoạn chọn lọc tái sinh hoàn chỉnh Dịng mang cấu trúc chuyển gen hồn chỉnh phải có khả rễ mơi trường chọn lọc để tạo thành hoàn chỉnh chồi khơng chuyển gen khơng có khả rễ Những chồi phát triển tốt chuyển sang môi trường chọn lọc rễ (RM + hygromycin 10mg/l) Đối với thuốc lá, chồi rễ mơi trường MS tỉ lệ rễ nhiều so với mơi trường RM có bổ sung IBA 0,1 mg/l Tỉ lệ rễ chồi qua lần chọn lọc môi trường RM hygromycin 10mg/l cao (tỉ lệ chọn lọc lần trung bình qua đợt thí nghiệm 75,14%) A B C Hình 3.18 Khả rễ chồi môi trường RM hygromycin 10mg/l sau tuần nuôi cấy, (A):Cây thuốc chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh mơi trường rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l (B): Rễ thuốc chuyển gen tái sinh hồn chỉnh mơi trường rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l, (C): Cây đối chứng chuyển gen cấy mơi trường rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l Như kết luận hoàn thành việc chuyển gen chọn lọc in vitro sau chuyển gen Qua giai đoạn chọn lọc từ 183 mảnh lơ thí nghiệm thu 28 dòng chuyển gen phát triển tốt, xanh đậm, chồi mập, rễ dài Những dòng môi trường tự nhiên 46 Giai đoạn vào giá thể đất: trấu : cát Chọn dòng sinh trưởng phát triển tốt in vitro sau tháng nuôi cấy rửa rễ đưa trồng nhà lưới giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ 1:1:1) Để thích nghi dần với môi trường đất tránh nước đột ngột dẫn đến chết, sau vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ phần túi cho lại vào phịng ni điều khiển nhiệt độ 25-28o C, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để phát triển ổn định Sau ngày đưa nhà lưới để thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên Trong tổng số 28 dịng có 20 dịng thuốc phát triển tốt Với đặc điểm hệ rễ phụ thuốc phát triển mạnh, phát triển đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống dòng vào giá thể cao (>71%), chứng tỏ thích nghi với điều kiện ngoại cảnh tốt (Hình 3.19) Hình 3.19 Cây thuốc hồn chỉnh trồng bầu đất: trấu: cát Như vậy, việc chuyển gen arsC vào thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh thành hồn chỉnh mơi trường chọn lọc trồng vào bầu đất đạt kết bước đầu Các dòng thuốc chuyển gen sẵn sàng cho việc đánh giá 3.5 Kiểm tra chuyển gen PCR Các dòng thuốc chuyển gen quan tâm tiến hành kiểm tra có mặt gen chuyển phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC-NcoI/F arsC-Eco72I/R Nếu kết nhận gen đặc hiệu với kích thước tính tốn ban đầu kết luận có mang gen chuyển Sản phẩm điện di DNA tổng số thuốc chuyển gen cho băng rõ nét, đủ điều kiện cho phản ứng PCR Kết nhân gen arsC thể hình 3.20 47 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm PCR dòng thuốc chuyển gen, – 24: Sản phẩm PCR dòng thuốc chuyển gen 1-20, M: Marker Fermentas 1kb Kết cho thấy số 20 dòng thuốc chuyển gen arsC sau tháng trồng tự nhiên kiểm tra phản ứng PCR thu 15 dòng có kết dương tính với vạch băng kích thước khoảng gần 500bp phù hợp với kích thước lý thuyết gen arsC Bước đầu chứng tỏ gen arsC chuyển thành cơng vào 15 dịng thuốc 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã tách nhân dịng thành cơng gen arsC từ dương xỉ Pytirogramma calomelanos - Thiết kế vector chuyển gen pCambia 1301-arsC mang gen gen arsC - Đã tạo 20 dòng thuốc chuyển gen mang gen arsC sống sót mơi trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime Hygromycin - Nhận 15 dương tính tổng số 20 thuốc nhận sau chuyển gen kiểm tra có mặt gen arsC PCR Kiến nghị - Cần đánh giá thuốc chuyển gen số phương pháp khác để khẳng định chắn có mặt gen arsC chuyển gen (lai Southern Blot, khả tích lũy As…) - Cần đánh giá tính ổn định di truyền hệ sau dòng thuốc mang gen arsC thu - Dựa kết nghiên cứu đề tài điều kiện vùng ô nhiễm cụ thể tiếp tục tạo trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải tạo mơi trường 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Abernathy C O.;Calderon R L and Chappell W.R (1997) "Arsenic Exposure and Health Effects." Chapman and Hall, London, England Aposhian H V (2001) "DMPS increases the urinary excretion of arsenic in humans." Arsenic Exposure and Health Effects Proceedings of the 2000 Conference Elsevier, Amsterdam Aposhian H.V et al (2001) "Methyllarsonous acid (MMA), the most toxic and neglected biotransformant of inorganic arsenic Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference Barcelos J ; Poschenrieder C (2003) "Phytoremediation: principles and perspectives." Contributions to Science: 333 – 344 Bencko V (1997) "Health aspects of burning coal with a high arsenic content: the central Slovakia experience." Arsenic Exposure and Health Effects Borum D.R ; Abernathy C.O (1994) "Human oral exposure to inorganic arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects Science and Technology Letters, Northwood, England Thị Kim Anh (2011) "Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen đất vùng khai thác khoáng sản, Luận án Tiến sĩ Môi trường đất nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội." Burns R G; Rogers S.; McGhee I (1996) "In Contaminants and the Soil Environment in the Australia Pacific Region." Kluwer Academic Publishers: 361-410 Cebrian M.E ; Aposhian H.V (2001) "Assesment of arsenic body burden The role of the DMPS challenge test." Arsenic Exposure and Health Effects Proceedings of the 2000 Conference Elsevier, Amsterdam 10 Chappell W.R.;Abernathy C.O and Calderon R.L (1999) "Arsenic Exposure and Health Effects." Elsevier, Amsterdam 11 Chilton M.D (1993) "Agrobacterium gene transfer." Progress on a poor man's vector 90: 3119-3210 12 Choprapawon C ; Ajjimangkul S (1999) "Major interventions on chronic arsenic poisoning in Ronpibool District, Thailand- review and long-term follow-up " Arsenic Exposure and Health Effects 13 Choprapawon C ; Rodcline A (1997) "Chronic arsenic poisoning in Ronpibool Nakhon Sri Thammarat, the southern province of Thailand." Arsenic Exposure and Health Effectts 14 Chowdhurry T.R (1997) " Arsenic in groundwater in six districts of West Bengal." Arsenic Exposure and Health Effects 50 15 Chowdhurry T.R et al (1999) "Groundwater arsenic contamination and the suffering of people in Bangladesh." Arsenic Exposure and Health Effects 16 Curie C.; Alonso J.M.; Le Jean M.; Rcker J.R.; Briat J.F (2000) "Involvement of Nramp1 from Arabidopsis thaliana in ion transport." Biochem J 347: 749-755 17 Đặng Đình Kim (2010) "Báo cáo tổng kết kết khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng vùng khai thác khống sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ Khoa học Công nghệ." 18 Đặng Đình Kim (2012) "Nghiên cứu sử dụng thực vật để xử lý số kim loại nặng đất vùng khai thác mỏ." Chuyên đề bảo vệ mơi trường khai thác khống sản 19 De la Fuente J.M.;Ramirez-Rodriguez V.;Carbera-Ponce J.L (1997) " Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthesis." (Science 276): 1566-1568 20 Dhankher O.P.; Li Y.; Rosen B.P.; Shi J.; Salt D.; Senecoff J.F.; Sashti N.A.; Meagher R.B (2002) "Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression." Nature Biotechnology(20): 1140-1145 21 Diệp Thị Mỹ Hạnh (2007) "Thực vật có khả hấp thu Pb đất để giải nhiễm." Tạp chí phát triển khoa học công nghệ (1) 23 Đồng Thị Minh Hậu ; Hoàng Thị Thanh Thủy ; Đào Phú Quốc (2008) "Nghiên cứu lựa chọn số thực vật có khả hấp thu kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lị gốm." Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ(4) 24 Ellis D.R.; Gumaelius L.; Indriolo E.; Pickering I.J.; Bank J.A.; Salt D.E (2006) "A novel arenas reductase from the Arsenic hyperaccummulating fern Pteris vittata." Plant Physol (141): 1544-1554 25 Folks D J (2001) "Impacts of historic arsenical pesticide use on residential soils in Denver, Colorado." Arsenic Exposure and Health Effects Proceedings of the 2000 Conference 26.Guha Mazumder D N et al (2001) "Treatment of chronic arsenic toxicity." Arsenic Exposure and Health Effects Proceedings of the 2000 Conference Elsevier, Amsterdam 27 Guo H R and Greene H L (1994) " Arsenic in drinking water and cancers: a brief descriptive review of Taiwan Studies." Arsenic Exposure and Health Effects.Science and Technology Letters Northwood, England 28 Hanif M (2004) "Chracterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens " University of Helsinki 51 29 Hasegawa I.; Terada E.; Sunairi M.; wakita H.; Shinmachi F.; Noguchi A.; Nakajima M.; Yazaki J (1997) "Genetic improvement of heavy metal tolerance in plants by transfer of the yeast metallothionein gene (CUP1)." Plant Soil 277-281 Hirschi K.D.;Zhent R.; Cunningham K.W (1996) "CAX1, an HI/Ca2+ antiporter from Arabidopsis." 8782-8786 30 Hoàng Thị Thanh Thủy ; Từ Thị Cẩm Loan ; Nguyễn Như Hà Vy (2007) "Nghiên cứu địa hóa mơi trường số kim loại nặng trầm tích sơng rạch Tp Hồ Chí Minh." Tạp chí phát triển khoa học công nghệ(1) 31 Jerald L Schnoor (2002) "Phytoremediation Of Soil And Groundwater." Center for Global and Regional Environmental Research and Dept of Civil and Environmental Engineering 32 Kilburn K H (1997) "Neurobehavioral impairment from long-term residential arsenic exposures." Arsenic Exposure and Health Effects 33 Lâm Minh Triết ; Lê Huy Bá (2006) "Sinh thái môi trường học bản." Nxb Đại học Quốc gia TPHCM 576 34 Lê Thanh Hòa (2003) "Sinh học phân tử virus Gumboro, nghiên cứu ứng dụng Việt Nam." Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 35 Lê Thị Thu Hiền (2003) "Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumfaciences mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng." Luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 36 Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nơng Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn (2003) "Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam." Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 37 Liao X (2004) "Root distributions and elemental accumulations of Chinese brake (Pteris vittata L.) from As-contaminated soils." Plant and Soil 109–116 38 Ma J Q ; Komar M ; Zhang T.W ; Cai Y ; Kenelley E.D (2001) "A fern that hyperaccumulaters Arsenic." Nature: 509 39 Michielse B C ; Hooykaas P J J (2008) "Agrobacterium – mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori." 40 Murcott S (2001) "A comprehensive review of low-cost, well-water treatmen technologies for arsenic removal " Proceedings of the 2000 Conference 41 Nguyễn Đình Tuấn (2005) "Chất lượng nước kênh rạch Tp Hồ Chí Minh Hiện trạng thách thức." Báo cáo hội thảo “Phát triển bền vững thành phố xanh lưu vực sông”: - 42 Nguyễn Đức Thành (2003) "Chuyển gen thực vật." Nxb Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội 52 43 Nguyễn Khắc Hải (2006) "Ảnh hưởng ô nhiễm asen nguồn nước sinh hoạt đến sức khỏe người." Thông tin KHCN 44 Nguyễn Tiến Cư ; Trần Văn Tựa ; Đặng Đình Kim ; Đỗ Tuấn Anh ; Lê Thu Thủy (2007) "Nghiên cứu khả xử lý chì (Pb) đất nhiễm cỏ Vetiver zizannioides." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 308312 45 Phạm Văn Khang; Nguyễn Ngọc Minh; Nguyễn Xuân Huân (2004) "Một số nghiên cứu kim loại nặng giới." Tạp chí khoa học đất(20): 157- 161 46 Pilon-Smits E (2005) "Phytoremediation." Annu Rev Plant Biol 56: 15-39 47 Prasad M.N.V.; Freitas H.O (2003) "Metal hyper accumulation in plant – Biodiversity prospecting for phytoremendiation technology." J of Biotech(3): 285-321 48 Raskin I.; Smith R.D.; Salt D.E (1997) "Phytoremediation of metals: Using plants to remove pollutants from the environment." Curr Opin Biotechnol(2): 221-226 49 Sabarrinath S.; Shan W.; Lena Q M.; Bala R (2009) "Expression of a Pteris vittata glutaredoxin PvGRX5 in transgenic Arabidopsis thaliana increases plant arsenic tolerance and decreases arsenic accumulation in the leaves." Plant, Cell and Environment(32): 851–858 50 Sancha A.M (1999) "Full-scale application of coagulation processes for arsenic removal in Chile: a successful case study." Arsenic Exposure and Health Effects 51 Sasieni P ; Evans S ; Cuzick J (1994) "Long term follow-up of patients treated with medicinal arsenic." Arsenic Exposure and Health Effects Science and Technology Letters, Northwood, England 52 Saxena PK (1999) "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329 53 Saxena PK et al (1999) "Phytoremediation of heavy metal contaminated and polluted soils." MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin: 305-329 54 Schat H et al (1999) "Metal specific patterns of tolenrance, uptake, and transport of heavy metals in hyperaccumulating and non-hyperaccumulating metallophytes." Phytoremediation of contaminated soils and waters: 171-188 55 Styblo M and Lin S (2001) "Toxic consequences of the metabolism of arsenic Arsenic Exposure and Health Effects." Proceedings of the 2000 Conference 56 Sun G.F (1999) "The present situation of chronic arsenism and research in China." Arsenic Exposure and Health Effects 53 57 Sun H H.; Sun A.C.; Hyeon Y; Kyung-Suk C (2011) "Screening of Cucumis sativus as a new arsenic-accumulating plant and its arsenic accumulation in hydroponic culture." Environ Geochem Health: 143–149 58 Thomas D J et al (2001) "Dore-response relations for the excretion of methylated arsenicals in urine by individuals chronically exposed to inorganic arsenic." Proceedings of the 2000 Conference 59 Timothy Oppelt E (2000) " Introduction to Phytoremediation." National Risk Management Research Laboratory, Office of Research and Development, U.S Environmental Protection Agency 60 Trần Văn Tựa ; Nguyễn Đức Thọ ; Đỗ Tuấn Anh ; Nguyễn Trung Kiên ; Đặng Đình Kim (2007) "Sử dụng sậy cỏ vetiver xử lý nước thải chứa Cr Ni theo phương pháp vùng rễ." Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường.: 29 61 Van de Zaal B.J.; Neuteboom L.W.; Pinas J.E.; Chardonnens S.; Schat H.; Verkleij J.A.; Hooykaas.C (1999) "Over expression of a novel Arabidopsis gene related to putative zinc transporter genes from animal can lead to enhanced zinc resistance and accumulation." Plant Physiol: 1047-1055 62 Vũ Quyết Thắng (1998) "Hàm lượng kim loại nặng đất rau muống Thanh Trì." Tạp chí hoạt động khoa học: 31-32 63 Willard Chappell (1999) "Arsenic Exposure and Health Effects V." Gulf Professional Publishing 64 Yadav R.; Arora P.; Kumar S (2010) "Perspectives for genetic engineering of poplars for enhanced phytoremediation abilities." Ecotoxicology(19): 1574–1588 65 Yoshihiro Narusaka ; Mari Narusaka ; Satoshi Yamasaki ; Masaki Iwabuchi (2012) "Transgenic Plants - Advances and Limitations." Agricultural and Biological Sciences(9) 66 Zhu Y.;Pilon-Smits E.A.H.; Jouanin L.; and Terry N (1999) "Over expression of glutathione synthetase in Brassica juncea enhances Cadmium tolerance and accumulation." Plat Physiol 119: 73-79 54 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ vector tách dòng pBT Phụ lục 2: Cấu trúc vector pCambia 1301 Phụ lục 3: Danh mục hóa chất nồng độ sử dụng tách chiết ADN plasmid Nồng độ Hóa chất Tris-HCl EDTA 25 mM 10 mM Glucose NaOH 50 mM 0,2 N SDS 1% Potassium acetat 3M Acetic acid 11,5% Ethanol Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 70 % Phụ lục 4: Thành phần chu trình phản ứng PCR Thành phần H2 O Dream Taq Buffer Thể tích phản ứng Chu kì nhiệt 10.5 Nhiệt độ Thời gian 94 oC phút o dNTP 94 C 50 giây Reverse Primer 55 oC 50 giây Forward Primer 72oC phút 30giây 0.5 72 oC 10 phút Taq Sample Tổng thể tích 20 35 chu kì Phụ lục 5: Quy trình điện di DNA gel agarose Các đoạn DNA có khối lượng điện tích khác tách di chuyển từ cực âm sang cực dương điện trường có điện cường độ thích hợp Chuẩn bị gel agarose: cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch TBE 1X, lắc đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn lược, để gel đông cứng, rút lược đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE ngập gel từ - mm Tra mẫu chạy điện di: mẫu DNA trộn với đệm tra mẫu, mix tra vào giếng, chạy điện di với thang DNA chuẩn để xác định trọng lượng phân tử DNA Nhuộm gel: gel lấy khỏi khuôn, ngâm 15 - 20 phút dung dịch Ethidium Bromide, rửa lại nước quan sát ánh sáng tử ngoại 254 nm máy soi DNA, ảnh chụp máy soi gel Phụ lục 6: Quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc cải tiến (Toopping, 1998) Chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm bảo quản glycerol -80oC nuôi cấy mơi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối 28oC ngày Cây in vitro phát triển 3-4 thật, chọn bánh tẻ để tiến hành biến nạp Các mảnh cắt với kích thước khoảng cm2 mơi trường ½ MS lỏng đặt lên mơi trường cảm ứng GM (MS + 1mg/l BAP) Một ngày trước biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập ni lỏng 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16 giờ) Sau ni phục hồi thêm 50 ml LB không bổ sung kháng sinh chọn lọc Biến nạp: - Khuẩn sau nuôi đem đo OD600= 0,6-1 sử dụng để biến nạp - Đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyển phù vi khuẩn - Các mảnh sau ngày nuôi cấy cảm ứng môi trường GM chuyển sang bình tam giác có chứa dung dịch ½ MS lỏng dịch huyền phù vi khuẩn Sau 30 phút chuyển mảnh lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khơ cấy lên mơi trường GM khơng có kháng sinh, đồng nuôi cấy ngày Sau ngày, cấy chuyển mảnh sang môi trường chọn lọc chồi GM có bổ sung Cefotaxime 500mg/l Hygromycin 5mg/l Sau 2-3 tuần, mảnh bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo tiếp tục chuyển sang mơi trường chọn lọc chồi GM có bổ sung Cefotaxime 500mg/l + Hygromycin 5mg/l Sau tuần, mảnh tạo chồi chuyển sang mơi trường chọn lọc chồi GM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin Sau tạo đa chồi, chồi phát triển tốt chuyển sang mơi trường tạo rễ RM có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin 10 Cây rễ nhiều, cao 5-7 cm đua bầu chứa giá thể đất : trấu : cát (1:1:1) 11 Sau tuần, phát triển ổn định, tiến hành kiểm tra sau chuyển gen Phụ lục 7: Thành phần môi trường nuôi chọn lọc thuốc chuyển gen Tên môi trường MS Tái sinh chồi (GM) Ra rễ (RM) Chọn lọc chồi chuyển gen (GM Hygromycin 5) Chọn lọc chồi chuyển gen (GM Hygromycin 10) Chọn lọc hồn chỉnh (RM) Thành phần mơi trường Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 MS + 0.1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + mg/l Hygromycin, pH = 5,8 MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin, pH = 5,8 MS + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin, pH = 5,8 ... thực vật phương pháp xử lý truyền thống Do vậy, thực đề tài ? ?Tách dòng, thiết kế vector chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào thuốc lá? ?? Đây hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn lớn... dòng pBT-arsC cho nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC 3.2.1 Gắn gen arsC vào vector biểu pCambia 1301 Vector biểu pCambia 1301 có... Pytirogramma calomelanos) - Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC - Chuyển gen arsC vào thuốc tái sinh chuyển gen - Chứng minh có mặt gen chuyển nạp chuyển gen PCR 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1