Đề tài Nafosted (cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học) là đề tài đầu tiên sử dụng thuốc lá làm cây mô hình nghiên cứu sự chuyển gen liên quan đến khả năng tích luỹ kim loại nặng, cụ thể là gen arsC liên quan đến việc hấp thu và tích lũy As. Đề tài đã thực hiện xong các nội dung: tách thành công gen arsC từ cây dương xỉ (Microsorum pteropus) có khả năng tích lũy As cao đang sinh trưởng ở vùng đất mỏ bị ô nhiễm và đã chuyển gen arsC vào cây thuốc lá K326.Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý hóa sinh và khả năng tích lũy asen (As) của các dòng thuốc lá chuyển gen arsC ở giai đoạn in vitro” nhằm đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng sinh lýhóa sinh của cây thuốc lá chuyển gen arsC nuôi cấy in vitro, phục vụ cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo trên con đường sử dụng thực vật chuyển gen xử lý đất ô nhiễm As.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH HỌC HÀ THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG, SINH LÝ – HĨA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN (As) CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI CẤY IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HÀ NỘI - 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH HỌC HÀ THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG, SINH LÝ – HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN (As) CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NI CẤY IN VITRO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chun ngành : Sinh học thực nghiệm Hướng dẫn khoa học : TS Lê Thị Bích Thủy TS Lê Thị Thủy HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Thị Bích Thủy – Phòng Di truyền tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cô giáoTS Lê Thị Thủy, Khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội hướng dẫn tận tình bảo, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Hồ Thị Hương tập thể cán phòng Di truyền tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ em nhiệt tình tạo điều kiện tốt trình em học tập Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Sinh lý học thực vật Ứng dụng, thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội dạy bảo giúp đỡ em thời gian học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đinh, người thân bạn bè động viên giúp đỡ em suốt q trình học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2017 Sinh viên Hà Thị Ngọc Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT As DNA KLN Asen Deoxyribonucleic acid Kim loại nặng PCR Phản ứng khuếch đại gen DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Môi trường bị ô nhiễm hoạt động khai khoáng tuyển quặng nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu Trong kim loại nặng KLN chất gây ô nhiễm hàng đầu chúng không dễ dàng bị vi sinh vật (VSV) phân giải Một số KLN nguyên tố vi lượng thiếu cho sinh trưởng phát triển sinh vật Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, As, Cd,… nhiên với nồng độ cao, lại chất độc thể sinh vật người Đặc biệt hàm lượng As đất nước ngầm mức đáng lo ngại nhiều vùng khai thác khoáng sản giới Việt Nam Tùy thuộc vào đặc điểm tính chất loại đất mà lựa chọn phương pháp xử lý KLN phù hợp như: học, vật lý, hóa học, sinh học Trong xử lý đất chứa KLN biện pháp sinh học trở thành hướng đầy triển vọng giá thành thấp, vận hành đơn giản thân thiện với môi trường,… Việc phát số loại có khả hấp thụ, tích lũy chuyển hóa KLN đặc biệt As mở khả sử dụng thực vật để cải tạo ô nhiễm mơi trường Các nhà khoa học tìm 450 lồi thực vật có khả hấp thụ cao kim loại nặng cỏ mần trầu (Eleusine indica L), cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L) dương xỉ (Pteris vittata L), cải xanh (Brassica juncea), nghé nước (Polygonum hydropiper),… Trong dương xỉ ý khả chống chịu tích lũy đồng thời nhiều KLN khả hấp thu, tích lũy As cao Nhiều nhà khoa học chứng minh loài dương xỉ (Pteris vittata) lồi siêu tích lũy As Ở Việt Nam tìm lồi dương xỉ (Microsorum pteropus) có khả sinh trưởng tốt vùng đất mỏ bị ô nhiễm As Thái Nguyên Gen arcC tách từ loài so sánh với gen arsC tách từ loài dương xỉ (Arabidopsis) đột biến (đã chứng minh có khả tích lũy As) Đánh giá phân tử cho thấy sản phẩm gen có thành phần amino acid giống 100% Việc nghiên cứu phát triển số loài thực vật hấp thụ kim loại nặng phải đáp ứng yêu cầu giống dễ trồng, có khả vận chuyển KLN từ đất lên nhanh, chịu nồng độ ô nhiễm cao, phát triển nhanh Nhưng thực tế, tích lũy KLN thường phát triển chậm, loài phát triển nhanh lại mẫn cảm với hàm lượng KLN cao Một vấn đề khác dùng xuất xứ nơi khác với nơi cải tạo đất làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học địa phương Vì vậy, cách tốt tạo địa phương có khả cải tạo đất Đề tài Nafosted (cơ quan chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học) đề tài sử dụng thuốc làm mơ hình nghiên cứu chuyển gen liên quan đến khả tích luỹ kim loại nặng, cụ thể gen arsC liên quan đến việc hấp thu tích lũy As Đề tài thực xong nội dung: tách thành công gen arsC từ dương xỉ (Microsorum pteropus) có khả tích lũy As cao sinh trưởng vùng đất mỏ bị ô nhiễm chuyển gen arsC vào thuốc K326 Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số tiêu sinh trưởng, sinh lý - hóa sinh khả tích lũy asen (As) dòng thuốc chuyển gen arsC giai đoạn in vitro” nhằm đánh giá số tiêu sinh trưởng sinh lý-hóa sinh thuốc chuyển gen arsC nuôi cấy in vitro, phục vụ cho nội dung nghiên cứu đường sử dụng thực vật chuyển gen xử lý đất nhiễm As 1.2 - Mục đích nghiên cứu Tìm dòng thuốc chuyển gen có chứa gen arsC Đánh giá số tiêu sinh trưởng, sinh lý-hóa sinh dòng thuốc chuyển gen nuôi cấy in vitro 1.3 Nội dung nghiên cứu - Kiểm tra có mặt gen arsC thuốc chuyển gen Đánh giá số tiêu sinh trưởng thuốc chuyển gen mơi trường - ni cấy in vitro có bổ sung As Đánh giá số tiêu sinh lý-hóa sinh thuốc chuyển gen môi trường nuôi cấy in vitro có bổ sung As 1.4 Tổng quan tài liệu 1.4.1 Sơ lược nguyên tố asen ảnh hưởng asen tới sức khỏe người 1.4.1.1 Sơ lược nguyên tố asen Asen (còn gọi thạch tín, có ký hiệu hóa học As) nguyên tố hóa học có số nguyên tử 33 As lần Albertus Magnus (Đức) đề cập đến vào năm 1250 Khối lượng nguyên tử 74,92 As kim gây ngộ độc có nhiều dạng thù hình: màu vàng (phân tử phi kim) vài dạng màu đen xám (á kim) Ba dạng có tính kim loại As với cấu trúc tinh thể khác tìm thấy tự nhiên (khống vật asen sensu stricto asenolamprit parasenolamprit), nói chung hay tồn dạng hợp chất asenua asenat As hợp chất sử dụng thuốc trừ dịch hại, thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu loạt hợp kim Tính chất hóa học As giống với nguyên tố đứng phốtpho Sự tương tự lớn đến mức As thay phần cho phốtpho phản ứng hóa sinh học gây ngộ độc Tuy nhiên, liều thấp mức gây ngộ độc hợp chất As hòa tan lại đóng vai trò chất kích thích số loại thuốc chữa bệnh cho người vào kỷ 18 Hình 1.1.Mẫu As ống nghiệm Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Asen As biết đến sử dụng Ba Tư từ thời cổ đại Do triệu chứng ngộ độc As không rõ ràng nên thường sử dụng làm chất giết người phát thử nghiệm Marsh, thử nghiệm nhạy để phát tồn Trong thời kì đồ đồng, As sử dụng hợp kim, làm cho đồng trở nên cứng Albertus Magnus (1193-1280) coi người cô lập As nguyên tố vào năm 1250 Năm 1649, Johann Schoder công bố cách điều chế As Các dạng As vô hợp chất vào chuỗi thức ăn, trao đổi tích cực thành dạng độc thơng qua q trình metyl hóa [4] As ngun tố đặc biệt cần thiết hàm lượng thấp chất độc cực mạnh hàm lượng đủ lớn Hàm lượng As đất, nước, …cao trình tự nhiên hoạt động người đặc biệt trình khai thác khống sản As có nhiều mỏ khống suphit, phát tán vào khơng khí hay 10 Dòng K326-WT 18,25 a ±1,97 8,50 a ±1,05 - - K2 18,01 a ±1,82 14,08 b ±2,43 9,02 a ±0,2 9,10 a ±1,21 K9 17,73 a ±1,06 14,44b ±2,04 9,78 a ±1,93 9,53 a ±1,65 K18 17,94 a ±1,41 14,53 b ±2,6 9,98 a ±2,95 9,32a±1,01 (-) Không đánh giá Số liệu thống kê bảng 3.5 cho thấy, mơi trường khơng có asen, khơng có sai khác hàm lượng diệp lục tổng số dòng thuốc thí nghiệm Kết cho thấy gen arsC chuyển không ảnh hưởng đến hàm lượng diệp lục điều kiện khơng có As Hình 3.6.Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng diệp lục tổng số (mg/g) dòng thuốc Quan sát biểu đồ hình 3.6 cho thấy: Khi nồng độ As tăng lên hàm lượng diệp lục giảm xuống Với dòng K326-WT, nồng độ As tăng từ ppm đến 200 ppm, hàm lượng diệp lục giảm mạnh từ 18,25 mg/g đến 8,5mg/g (giảm 63,4%) Hàm lượng diệp lục tổng số dòng thuốc chuyển gen nồng độ 200 ppm dao động khoảng từ 14,08mg/g đến 14,53mg/g (giảm từ 19-33% so với nồng độ0 ppm) Ở nồng độ 600 ppm, hàm lượng diệp lục dòng thuốc chuyển gen dao động khoảng 9,1 mg/g đến 9,53 mg/g (giảm 49% - 54,75% so với nồng độ ppm) Điều cho thấy nồng độ As cao làm giảm hàm lượng diệp lục tổng số dòng thuốc chuyển gen As ngăn cản tình trao đổi chất thể , làm ngăn cản trình hình thành diệp lục Khi so sánh hàm lượng diệp lục tổng số dòng thuốc nồng độ cho thấy: Ở nồng độ 200 ppm, hàm lượng diệp lục tổng số dòng K326-WT 8,5mg/g, hàm lượng diệp lục tống số dòng thuốc chuyển gen dao động khoảng 14,08 mg/g đến 14,53 mg/g (cao 1,66 đến 1,71 lần so với dòng K326-WT) Điều cho thấy gen arsC có ảnh hưởng tích cực tổng hợp 32 diệp lục thuốc chuyển gen mơi trường có As so với dòng đối chứng không chuyển gen, làm giảm ảnh hưởng As đến hình thành diệp lục 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng diệp lục a diệp lục b (mg/g) dòng thuốc Trong cây, diệp lục a phân tử hấp thu trực tiếp ánh sáng chuyển hóa quang thành hóa Diệp lục b sắc tố phụ quang hợp, có vai trò hấp phụ ánh sáng từ sắc tố khác chuyển cho diệp lục a Tương tự hàm lượng diệp lục, hàm lượng diệp lục a b chịu ảnh hưởng nồng độ As môi trường nuôi cấy Kết nghiên cứu thể bảng 3.6 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ As lên hàm lượng diệp lục a b (mg/g) dòng thuốc Nồng độ Dòng K326WT K2 K9 K18 ppm 200 ppm Dla Dlb Dla Dlb 12,34a ±1,4 12,27 a ±2,34 12,34 a ±1,47 12,27 a ±1,66 5,91 a ±1,35 5,74 a ±1,6 5,39 a ±1,24 5,68 a ±1,16 6,65 a ±0,98 10,68 b ±1,99 10,32 b ±1,95 10,11 b ±1,58 1,84 a ±0,65 3,40 b ±1,9 4,12 b ±1,68 4,42 b ±2,66 400 ppm 600 ppm Dla Dlb Dla Dlb - - - - 6,24 a ±1,16 6,90 a ±1,84 6,14a ±1,43 2,78a ±0,27 2,88a ±0,79 3,84a ±2,77 3,93 a ±0,84 4,15 a ±0,78 4,02 a ±0,93 0,69 a ±0,34 0,53 a ±0,44 0,75 a ±0,33 (-) Không đánh giá Số liệu thống kê bảng 3.6 cho thấy, mơi trường khơng có asen, khơng có sai khác hàm lượng diệp lục a bà b dòng thuốc thí nghiệm Điều cho thấy gen arsC chuyển không gây ảnh hưởng đến hàm lượng diệp lục a b Khi nồng độ As môi trường tăng lên, hàm lượng diệp lục a b giảm xuống: Khi nồng độ As môi trường tăng từ 0ppm đến 200ppm dòng K236-WT, hàm lượng diệp lục a giảm từ 13,34 mg/g xuống 6,65 mg/g (giảm 50,2%), hàm lượng diệp lục b giảm từ 5,91 mg/g xuống 1,84 mg/g (giảm 68,9%) Điều chứng tỏ As ức chế tổng hợp diệp lục a b, làm giảm hàm lượng chúng Khi so sánh dòng thuốc nồng độ As cho thấy hàm lượng diệp lục a b dòng thuốc chuyển gen cao dòng K326-WT: nồng độ As 200ppm, hàm lượng diệp lục a dòng thuốc K326-WT 6,65 mg/g , dòng thuốc chuyển gen dao động khoảng 10,11 mg/g đến 10,68 mg/g, hàm lượng diêp lục b dòng K326 –WT 1,84 mg/g, dòng thuốc chuyển gen dao động khoảng 3,04 mg/g đến 4,42 mg/g Điều chứng tỏ gen arsC có ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng diệp lục a b dòng thuốc chuyển gen so với dòng đối chứng, làm giảm ảnh hưởng As lên sinh trưởng 34 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng đường khử (mg/g) dòng thuốc Đường khử loại đường mà cơng thức phân tử có chứa nhóm -CHO (aldehyde) –CO (xeton) glucose fructose Ở thực vật đường tập trung nhiều thành tế bào, mơ nâng đỡ, mơ dự trữ Chúng có vai trò quan trọng thể sống như: cung cấp lượng, tham gia vào cấu trúc tế bào, điều chỉnh áp suất thẩm thấu dịch bào Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng đường thuốc chuyển gen thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng đường khử (mg/g) dòng thuốc Nồng độ ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm K326-WT 7,77a ±0,99 7,62a ±1,3 - - K2 7,62a ±2,23 7,46a ±1,15 7,27a ±1,23 7,39a ±1,5 K9 7,64a ±1,36 7,60a ±1,52 7,62a ±1,25 7,42a ±0,98 K18 7,58a ±1,5 7,46a ±1,58 7,35a ±1,35 7,17a ±1,3 Dòng (-) Khơng đánh giá Số liệu thống kê bảng 3.7 cho thấy, mơi trường khơng có asen, khơng có sai khác hàm lượng đường khử dòng thuốc thí nghiệm Điều chứng tỏ điều kiện mơi trường khơng có As, gen arsC khơng ảnh hưởng đến trình tổng hợp đường khử thuốc chuyển gen Hình 3.7.Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng đường khử (mg/g) dòng thuốc Số liệu thống kê bảng 3.7 rằng: hàm lượng đường khử tất cơng thức thí nghiệm dao động từ 7,17 mg/g đến 7,77mg/g Quan sát biểu đồ hình 3.7, nồng độ As tăng lên hàm lượng đường khử giảm Nhưng sai 35 khác cơng thức thí nghiệm khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, nồng độ As không ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử dòng thuốc Trong nuôi cấy in vitro, phần đường khử tổng hợp từ trình quang hợp cây, phần chúng lấy từ môi trường nuôi cấy nhờ hoạt động rễ Do hàm lượng đường khử tương đối ổn định, không bị ảnh hưởng nhiều biến động hàm lượng diệp lục hay cường độ quang hợp Như vậy, phạm vi nghiên cứu, nồng độ As không ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử dòng thuốc nghiên cứu 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng vitamin C (%) dòng thuốc Vitamin C hay gọi axit ascorbic (được tìm thấy nhiều trái chất dinh dưỡng cần thiết cho thể sinh vật) Vitamin C tham gia vào nhiều trình quan trọng thực vật như: q trình hydroxyl hóa hydroxylase, vận chuyển hydro q trình oxi hóa khử, làm tăng tính đề kháng thể điều kiện khơng thuận lợi mơi trường ngồi Ngồi vitamin C tham gia nhiều q trình tổng hợp chuyển hóa chất khác Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng diệp lục thuốc chuyển gen thể bảng 3.8 hình 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ As đến hàm lượng vitamin C (%) dòng thuốc Nồng độ ppm 200 ppm 400 ppm 600 pm K326-WT 0,38a±0,02 0,18a±0,02 0 K2 0,36a±0,05 0,29b±0,03 0,18a±0,03 0,11a±0,02 K9 0,37a±0,02 0,28b±0,02 0,20b±0,02 0,15b±0,02 K18 0,36a±0,02 0,28b±0,02 0,15c±0,02 0,11a±0,02 Dòng (-) Khơng đánh giá 36 Số liệu thống kê bảng 3.5 cho thấy, mơi trường khơng có asen, khơng có sai khác hàm lượng vitamin C dòng thuốc thí nghiệm Điều cho thấy, mơi trường khơng có As, gen arsC khơng gây ảnh hưởng đến tổng hợp vitamin C thuốc chuyển gen Hình 3.8.Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ As lên hàm lượng vitamin C (%) dòng thuốc Quan sát biểu đồ hình 3.8, nồng độ As tăng hàm lượng vitamin C giảm giảm mạnh dòng đối chứng K326-WT Khi tăng nồn độ As từ ppm lên 200 ppm, hàm lượng vitamin C giảm từ 0,38 % xuống 0,18% (giảm 2,1 lần) Khi tăng nồng độ As từ 200 ppm lên 600 ppm, hàm lượng vitamin C dòng K9 giảm từ 0,28% xuống 0,15%, dòng K18 giảm từ 0,27% xuống 0,11% Điều cho thấy As làm giảm khả tổng hợp vitamin C thuốc lá, từ làm giảm sức đề kháng dẫn đến giảm khả sinh trưởng ảnh hưởng đến sức sống Khi so sánh hàm lượng so sánh hàm lượng vitamin C nồng độ As ta nhận thấy: Ở nồng độ 200 ppm, hàm lượng vitamin C dòng K326-WT 0,18%, hàm lượng vitamin C dòng chuyển gen dao động khoảng 0,27%- 0,28% (cao dòng đối chứng 1,5-1,6 lần) Hàm lượng vitamin C tất dòng thuốc chuyển gen cao dòng đối chứng Điều cho thấy, gen arsC có tác dụngchuyển hóa asenat giải độc cho cây, hay giúp chống chịu As nên dù môi trường As cao, trình tổng hợp vitamin khơng bị ảnh hưởng q lớn Ở nồng độ As 400 ppm, hàm lượng vitamin C dòng K9 cao đạt 0,2%, dòng K18 đạt 0,15% Điều chứng tỏ dòng K9 có hàm lượng vitamin C cao dòng chuyển gen Ở nồng độ As 600 ppm, hàm lượng vitamin C dòng K9 đạt 0,15%, dòng K18 thấp đạt 0,11% 3.3.5 Ảnh hưởng nồng độ As đến hoạt tính enzyme catalase (U/ml) dòng thuốc Catalase enzyme thuộc nhóm oxydoreductaza, tồn bên tất tế bào sống, đặc biệt quan có hoạt động trao đổi chất mạnh Nó enzym chống oxy hóa, xúc tác cho phân hủy H 2O2 thành H2O Phản ứng phân giải H2O2 catalase diễn sau: 37 Catalase 2H2O2 2H2O2 + O2 Đây loại enzyme quan trọng việc bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại q trình oxy hóa Một phân tử catalase chuyển đổi hàng triệu phân tử H 2O2 giây Do đó, hoạt tính enzyme catalase tiêu quan trọng việc đánh giá khả chống chịu stress từ môi trường, cụ thể ô nhiễm As.Ảnh hưởng nồng độ As đến hoạt tính enzyme catalase thể bảng 3.9 Bảng 3.91.Ảnh hưởng nồng độ As đến hoạt tính enzyme catalase (U/ml) dòng thuốc Nồng độ ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm K326-WT 0,04a ±0,004 0,04a ±0,02 - - K2 0,04a ±0,003 0,07b ±0,003 0,08a ±0,01 0,10a ±0,02 K9 0,04a ±0,006 0,07b ±0,008 0,10b ±0,009 0,13b ±0,009 K18 0,04a ±0,006 0,06b ±0,004 0,08a ±0,008 0,09a ±0,009 Dòng (-) Không đánh giá Số liệu thống kê bảng 3.6 cho thấy, mơi trường khơng có asen, khơng có sai khác hoạt tính enzyme catalase dòng thuốc thí nghiệm Điều chứng tỏ điều kiện mơi trường khơng có As, gen arsC chuyển vào thuốc không gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme catalase Khi bổ sung As vào mơi trường ni cấy, hoạt tính enzyme catalase dòng thuốc chuyển gen cao so với dòng K326-WT đối chứng: Ở nồng độ 200 ppm, hoạt tính enzyme catalase dòng đối chứng 0,04 U/ml, dòng chuyển gen, hoạt tính dao động khoảng 0,06 U/ml đến 0,07 U/ml Đến nồng độ 400 ppm, 600 ppm đối chứng chết, hoạt tính enzyme catalase dòng chuyển gen tăng lên Điều chứng tỏ gen arsC có ảnh hưởng tích cực đến hoạt tính enzyme catalase chuyển gen so với đối chứng điều kiện môi 38 trường bị nhiễm độc As, làm khả chống chịu chuyển gen cao đối chứng Ảnh hưởng hàm lượng As đến hoạt tính enzyme catalase thể biểu đồ hình 3.9 Hình 3.9.Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ asen lên hoạt tính enzyme catalase (U/ml) thuốc chuyển gen Quan sát biểu đồ hình 3.9 so sánh hoạt tính enzyme catalase thuốc chuyển gen nồng độ cho thấy: Khi nồng độ As tăng lên hoạt tính enzyme catalase tăng lên Khi tăng nồng độ As từ ppm lên 400 ppm, hoạt tính enzyme catalase dòng K2 tăng từ 0,038 U/ml lên 0,077 U/ml, dòng K9 tăng từ 0.035 U/ml đến 0,126 U/ml Như nồng độ As mơi trường tăng lên hoạt tính enzyme catalase tăng lên Khi nồng độ As tăng lên làm stress, cảm ứng tổng hợp enzyme catalase, làm hoạt tính enzyme catalase tăng lên giúp giải độc chống chịu với môi trường Như vậy, phạm vi nghiên cứu, gen arsC chuyển vào thuốc làm giảm ảnh hưởng As đến tổng hợp enzyme catalase làm tăng khả giải độc Gen arsC có vai trò chuyển hóa asenat (gây độc cho cây) thành dạng asenit (không độc) giúp không bị ngộ độc, làm giảm ảnh hưởng As đến trình trao đổi chất chuyển hóa lượng cây, giúp chống chịu tốt điều kiện nồng độ As cao Do tiêu sinh trưởng, sinh lý sinh hóa chuyển gen tốt đối chứng 3.3.6 Hàm lượng As tích lũy (mg/kg) dòng thuốc chuyển gen Các hợp chất asenat (As(V)) hấp thu vào tế bào thực vật thông qua kênh vận chuyển phosphatetranspoters aquaglyceroporins Sau vận chuyển vào tế bào, As(V) khử thành As(III) enzyme arsenate reductase gen arsC quy định As(III) sau tạo phức với glutathione (GSH) phytochelatins (PCs) As(III) phức hợp As(III) vận chuyển qua màng 39 khơng bào tích lũy khơng bào [15] Hàm lượng As tiêu quan trọng để đánh giá hoạt động gen arsC dòng thuốc chuyển gen Kết nghiên cứu thể bảng 3.10 biểu đồ hình 3.10 Bảng 3.10 Hàm lượng As (mg/kg) tích lũy dòng thuốc Nồng độ ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm K326-WT - 2,28a ±1,11 - - K2 - 7,41b ±1,41 16,50b ±1,91 48,04b±2,22 K9 - 7,14b ±1,66 18,42b ±1,68 85,86c ±6,1 K18 - 6,80b ±1,09 16,99b ±1,93 51,59b±6,5 Dòng (-) Khơng đánh giá Kết bảng 3.10 cho thấy, nồng độ 200 ppm, hàm lượng As tích lũy dòng K326-WT 2,28 mg/kg, hàm lượng As tích lũy dòng thuốc chuyển gen dao động khoảng 6.8 mg/kg đến 7,41 mg/kg (cao gấp 2,99 – 3,25 lần) Điều chứng tỏ khả tích lũy As dòng chuyển gen cao dòng đối chứng Hình 3.10 Biểu đồ thể hàm lượng As tích lũy (mg/kg) dòng thuốc (-) Khơng đánh giá Quan sát biểu đồ hình 3.10 cho thấy, nồng độ As mơi trường tăng lên hàm lượng As tích lũy tăng lên Khi bổ sung As với nồng độ 200 ppm hàm lượng As tích lũy dòng chuyển gen dao động khoảng 6,799 mg/kg – 7,407 mg/kg Khi tăng nồng độ As lên 600 ppm hàm lượng As tích lũy dao động khoảng 48,04 mg/kg – 85,86 mg/kg Ở nồng độ As 600 ppm, hàm lượng As tích lũy dòng K1 48,04 mg/kg, dòng K9 85,86 mg/kg, dòng K18 51,588 mg/kg Sự sai khác dòng K9 dòng lại có ý nghĩa thống kê Điều chứng tỏ dòng K9 có khả tích lũy As tốt dòng chuyển gen nghiên cứu 40 Gen arsC có vai trò chuyển hóa As từ dạng độc (ngồi mơi trường) thành dạng không độc (tạo thành phức chất tế bào), có khả tích lũy As với hàm lượng cao tế bào mà sống sót 41 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Kết đánh giá khả sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen ni cấy điều kiện nhiễm As cho thấy dòng thuốc chuyển gen sinh trưởng tốt dòng đối chứng chống chịu mơi trường có nồng độ As 600 ppm Từ kết đánh giá số tiêu sinh lý hóa sinh hàm lượng diệp lục, hoạt tính enzyme catalaza, hàm lượng đường khử cho thấy gen arsC chuyển vào thuốc làm tăng khả chống chịu môi trường bị ô nhiễm As Từ kết đánh giá khả tích lũy As dòng thuốc chuyển gen cho thấy dòng chuyển gen có hàm lượng As tích lũy cao dòng đối chứng, dòng K9 có hàm lượng As tích lũy cao dòng chuyển gen Qua so sánh dòng chuyển gen tiêu sinh lý, hóa sinh, nhận thấy dòng K9 có khả sinh trưởng, phát triển chống chịu tốt dòng chuyển gen đánh giá 4.2 Kiến nghị Tiếp tục theo dõi sinh trưởng phát triển dòng thuốc chuyển gen chuyển sang giai đoạn nhà lưới nhằm đánh giá khẳng định khả hoạt động gen arsC chuyển gen 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng việt Bùi Thị Kim Anh (2011) Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lí nhiễm Asen đất vùng khai thác khoáng sản Luận án tiến sĩ môi trường đất nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Đỗ Văn Ái, Mai Trọng Nhuận, Nguyễn Khắc Vinh (2005) Một số đặc điểm phân bố asen tự nhiên vấn đề ô nhiễm arsen môi trường nước ta Báo cáo cục địa chất khoáng sản Việt Nam Diệp Thị Mỹ Hạnh, E Garnier Zarli (2007) Lantana Canmara L, thực vật có khả hấp thu Pb đất để giải ô nhiễm Tạp chí phát triển khoa học công nghệ: 10-11 Hồ Hoàng Hải (2011) Asen Trang tin điện tử Liên Hiệp hội Khoa học kỹ thuật Việt Nam VUSTA http://www.vusta.vn/vi/news/Thong-tin-Su-kien-Thanhtuu-KH-CN/Asen-40430.html Lâm Minh Triết, Lê Huy Bá (2006) Sinh thái môi trường học Nxb Đại học Quốc gia TPHCM Lương Thị Thúy Vân, Lương Văn Hinh, Trần Văn Tựa 2009 Nghiên cứu sinh trưởng khả tích lũy Asen có Vetiver (Vetiveria zizanioides L.) trồng đất nhiễm khai thác khống sản Tạp trí khoa học công nghệ T4/2009 Trần Thị Thanh Hương, Lê Quốc Tuấn (2010) Cơ chế gây độc arsen khả giải độc arsen vi sinh vật, Hội thảo Môi trường Phát triển bền vững, Vườn Quốc gia Côn Đảo Trần Văn Tựa, Nguyễn Đức Thọ, Đỗ Tuấn Anh, Nguyễn Trung Kiên Đặng Đình Kim (2007) Sử dụng sậy cỏ Vetiver xử lý nước thải chứa Cr Ni theo phương pháp vùng rễ Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu ứng dụng Kỷ niệm năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội: 29 - 32 Vũ Quyết Thắng (1998) Hàm lượng kim loại nặng đất rau muống Thanh Trì Tạp chí hoạt động khoa học: 31-32 43 Tài liệu Tiếng Anh 10 Burns R G., Rogers S., McGhee I (1996) In Contaminants and the Soil Environment in the Australia Pacific Region– Kluwer Academic Publishers, London: 361-410 11 Chopra V.L., Anwan N (1990) Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd UK 12 Curie C., Alonso JM, Le Jean M., Rcker J.R., Briat J.F (2000) Involvement of Nramp1 from Arabidopsis thaliana in ion transport Biochem J 347: 749-755 13 De la Fuente JM, Ramirez-Rodriguez V, Carbera-Ponce JL, Herrera L (1997) Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthesis Science 276: 1566-1568 14 Dhankher OP, Li Y, Rosen BP, Shi J, Salt D, Senecoff JF, Sashti NA, Meagher RB (2002) Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression Nature Biotechnology 20: 1140-1145 15 Fusco N, Michelletto L, Corso GD, Borgato L, Furini A (2005) Identification of Cadmium-regulated genes by cDNA-AFLP in the heavy metal accumulator Brassica juncea L J Exper Botany 56(421): 3017-3027 16 Guangyong Ji, Simon Silver (1992) Reduction of arsenate to arsenite by the ArsC protein of the arsenic resistance operon of Staphylococcus aureus plasmid pI258 Proc Natl Acad Sci USA Vol 89, pp: 9474-9478 17 Saghai M.A., Biyashev R.M., Yang G.P., Zhang Q., Allard R.W (1984), “Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 91pp: 5466-5470 18 Shu,W.S., Xia, H.P., Zhang, Z.Q., Lan, C.Y and Wong, M H (2002) “Use of vetiver and three other grasses for regevetation of Pb/Zn mine tailings: field experiment”, international Journal of Phytoremediation: Vol 4, No 1, pp: 47-57 44 PHỤ LỤC Một số hình ảnh bố trí thí nghiệm 0ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm Dòng K326 chuyển vào mơi trường có bổ sung As ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm Dòng K9 sau tuần bổ sung As 45 ppm 200 ppm 400 ppm 600 ppm Dòng K9 sau tuần bổ sung As Chiều cao dòng K28 sau tuần bổ sung As 46 ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH HỌC HÀ THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG, SINH LÝ – HĨA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN (As) CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI... chuyển gen có chứa gen arsC Đánh giá số tiêu sinh trưởng, sinh lý -hóa sinh dòng thuốc chuyển gen ni cấy in vitro 1.3 Nội dung nghiên cứu - Kiểm tra có mặt gen arsC thuốc chuyển gen Đánh giá số tiêu. .. hướng nghiên cứu trên, tiến hành đề tài: Nghiên cứu số tiêu sinh trưởng, sinh lý - hóa sinh khả tích lũy asen (As) dòng thuốc chuyển gen arsC giai đoạn in vitro” nhằm đánh giá số tiêu sinh trưởng