Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của vi tảo biển dunaliella salina phân lập từ ruộng muối giao thủy nam định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI TRỊNH MINH THU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH CỦA VI TẢO BIỂN Dunaliella salina PHÂN LẬP TỪ RUỘNG MUỐI GIAO THỦY - NAM ĐỊNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐĂNG KHOA Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Đăng Khoa tận tình giúp đỡ, bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoài Hà bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Thầy Cô trường ĐHSP Hà N i cán b Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học ĐHQGHN cung cấp kiến thức tảng hỗ trợ cho q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Cuối cùng, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân, bạn bè đ ng viên giúp đỡ suốt thời gian học tập hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên T ịnh Minh Thu ỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu, số liệu trình bày luận văn trung thực không tr ng l p với c c đề tài kh c Tôi xin cam đoan r ng c c thông tin tr ch dẫn luận văn r ngu n gốc Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên Trịnh Minh Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Dunaliella 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Vị trí phân loại Dunaliella 1 Đ c điểm sinh học Dunaliella 1.1.4 Sinh sản 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng 1.2 Carotenoid 11 1.2.1 Caroten 13 1.2.2 Xanthophyll 15 1.3 Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngồi nước 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu Dunaliella nước 16 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngồi nước 16 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Đối tượng nghiên cứu 18 1 Đối tượng 18 2 Địa điểm nghiên cứu 18 Môi trường 18 2.1.4 Thiết bị 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phân lập vi tảo 19 2 X c định khả sinh trưởng 20 2 Phương ph p phân loại 20 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng tổng hợp βcaroten vi tảo Dunaliella 21 2 Phương ph p t ch chiết carotenoid 21 2 Phương ph p phân t ch sắc ký mỏng (TLC) 22 2.2.7 Phương ph p phân t ch sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 22 2.2.8 Các phân tích thống kê 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Phân lập sàng lọc vi tảo Dunaliella 24 Đ c điểm hình th i học hình thức sinh sản Dunaliella DUN23 25 3 Phân t ch giải trình tự 18S rDNA 27 3.4 Ảnh hưởng c c điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng t ch lũy caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 31 3.4.1 Ảnh hưởng n ng đ NaCl đến sinh trưởng t ch lũy -caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 31 3.4.2 Ảnh hưởng cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng t ch lũy caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 33 3.5 Lựa chọn phương ph p dung môi th ch hợp cho tách chiết carotenoid 35 3.6 Phân tích carotenoid b ng sắc ký mỏng TLC 37 3.7 Phân tách carotenoid b ng phương ph p HPLC 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ANH MỤC CÁC CH Chữ viết tắt VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ EDTA Ethylene DiamineTetraacetic Acid Môi trường J Môi trường Johnsons HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng cao áp Tb Tế bào TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký mỏng TLK Trọng lượng khô VTB Vi tảo biển DANH MỤC ẢNG Bảng 2.1 Môi trường Johnsons (J) 18 Bảng 2.2 Vị trí thu mẫu chủng Dunaliella 19 Bảng 3.1 Khả sinh trưởng t ch lũy carotenoid chủng Dunaliella sau 16 ngày 24 Bảng 3.2 Các ký hiệu chi mã GenBank 18S rDNA ITS vi tảo tham khảo 29 ANH MỤC H NH Hình 1.1 Cấu tạo tế bào Dunaliella Hình 1.2 Hợp dạng đỏ xanh D salina hình thành giao tử Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc hóa học chung m t số carotenoid 12 Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc hai đ ng phân -caroten 14 Hình 3.1 Hình dạng tế bào sinh dưỡng Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) 25 Hình 3.2 Thể giao tử Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) 25 Hình 3.3 Sinh sản hữu tính Dunaliella DUN23 26 Hình 3.4 Sinh sản vơ tính Dunaliella DUN23 27 Hình 3.5 Cây phả hệ dựa phân tích giải trình tự18S rDNA Dunaliella DUN23 chủng có quan hệ họ hàng gần 28 Hình 3.6 Cây phân phả hệ dựa phân tích giải trình tự ITS Dunaliella DUN23 chủng có quan hệ họ hàng gần 29 Hình 3.7 Ảnh hưởng n ng đ NaCl đến sinh trưởng hàm lượng caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng t ch lũycaroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 34 Hình Hàm lượng carotenoid tách chiết b ng phương ph p (a) vortex (b) sonic, (c) hỗn hợp dung môi 36 Hình 3.10 Sắc ký đ TLC carotenoid vi tảo Dunaliella salina DUN23 38 Hình 3.11 Sắc ký đ chuẩn Lutein 9.814; Astaxanthin 12.985; -caroten 14.299 39 Hình 3.12 Sắc ký đ HPLC Dunaliella salina DUN23 (Thời gian lưu: Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298) 40 MỞ ĐẦU chọn đ tài Vi tảo m t cấu thành quan trọng sinh vật ph du đóng vai trò quan trọng việc trì phát triển hệ sinh th i nước Chúng có giá trị dinh dưỡng cao phạm vi ứng dụng r ng rãi m t số lồi vi tảo Chlorella, Dunaliella, Spirulina ni cấy để sản xuất protein β-caroten, glycerol, nhiên liệu sinh học, dạng dược phẩm… Vi tảo lục-cam Dunaliella (ngành tảo lục) lồi có hình dạng khác từ hình que tới dạng trứng đơn bào di đ ng (9 tới 11 µm), xuất nhiều v ng nước m n đại dương c c h nước m n c c đầm lầy, b n chứa mương ngập m n gần biển, chiếm ưu thủy vực có chứa hàm lượng muối n ng đ 2M M t vài lồi vi tảo t n c c điều kiện đ muối cao c c ao bay muối Để t n tại, vi tảo t ch lũy c c β-carotene glycerol với n ng đ cao để bảo vệ chúng trước yếu tố cường đ ánh sáng áp suất khí Lồi Dunaliella nghiên cứu nhiều chúng có hoạt tính chống oxy hóa cao, chúng có khả t ch lũy lượng lớn carotenoid Chi Dunaliella có 22 lồi m t số dạng biến thể, dạng sinh sống biển loài ưa m n, vi tảo nuôi cấy tương đối đơn giản không kết thành đ m hay c c dạng chuỗi Loài biết tới nhiều Dunaliella salina ưa m n Dunaliella ngu n ch nh t ch lũy m t lượng carotenoid lớn tự nhiên[34] Trong mơi trường nước m n, Dunaliella salina có màu lam Tuy nhiên, c c điều kiện đ muối cường đ ánh sáng cao, vi tảo lại biến thành màu đỏ sinh t ch lũy carotenoid có chức bảo vệ tế bào Cơng nghệ sinh học tảo có ưu điểm lớn hàng thập kỷ qua kết nghiên cứu mang lại giá trị to lớn cho người Hiện nay, carotenoid quan tâm nhiều thị trường, chúng sử dụng c c chất tạo màu loại thực phẩm dinh dưỡng dược phẩm, mỹ phẩm Những hợp chất có c c đ c tính chống oxy hóa thu hút nhiều ý c c đ c tính tiềm ẩn chúng qu trình ngăn ngừa ung thư[28] Trong số khoảng 1000 c c carotenoid tìm thấy tự nhiên, m t vài số chúng có chứa β-carotene (cà rốt), lycopene (cà chua) lutein (sau bina) M c dù m t số loại carotenoid, ví dụ β-carotene zeaxanthin tổng hợp nhân tạo, ngu n carotenoid từ vi tảo tự nhiên từ vi khuẩn nấm men sử dụng chất bổ sung tạo ý lớn c ng đ ng giới Ngày nay, vi tảo Dunaliella thu hút nhiều ý khả t ch lũy β-carotene M t phân tử β-carotene trung hòa tới 1000 phân tử oxy gốc tự Nam Định vựa muối lớn miền Bắc với 870 sử dụng cho sản xuất muối Giao Thuỷ huyện ven biển, cực nam đ ng b ng châu thổ sông H ng ph a Nam Đông Nam tiếp giáp với biển Đông Việt Nam, tiếp giáp huyện Xuân Trường, Hải Hậu (Nam Định) Kiến Xương Tiền Hải (Thái Bình) Hai xã Giao Phong Bạch Long thu c huyện Giao Thủy hai xã có sản lượng muối cao tỉnh Ru ng muối thu c xã Giao Phong n m sát phía đê trung ương gi p thị trấn Quất Lâm Từ 250 ru ng muối, năm xã Bạch Long đóng góp khoảng 40000 muối Gần gia tăng nhiệt đ , trình bay nước trực tiếp đ muối tăng lên; quần thể Artemia (loài giáp xác) giảm đa dạng mật đ Dunaliella ru ng muối hai xã tăng lên màu đỏ ru ng muối từ mà hình thành Vì chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số tiêu sinh lý, hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina phân lập từ ruộng muối Giao Thủy-Nam Định” nh m tạo sở cho việc đưa chủng vi tảo Dunaliella salina vào nhân nuôi quy mô công nghiệp, nh m đạt hiệu cao việc khai thác giá trị kinh tế to lớn chủng vi tảo Mục đ ch nghiên cứu X c định m t số tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina Tuyển chọn vi tảo biển Dunaliella tiềm sinh tổng hợp carotenoid Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập x c định tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina 32 0.60 Hàm lượng β-caroten Tốc đ sinh trưởng 16 14 0.50 0.40 10 0.30 Hàm lượng β-caroten (mg/l) Tốc độ sinh t ƣởng (k/ngày) 12 0.20 0.10 0.00 0.5 1.5 Nồng độ NaCl (M) Hình 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến sinh t ƣởng và hàm lƣợng caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 Ở n ng đ NaCl 0,5M, tốc đ sinh trưởng vi tảo thấp 0,11/ngày Khi tăng n ng đ NaCl tốc đ sinh trưởng vi tảo tăng n ng đ NaCl 1,5M tốc đ sinh trưởng đạt cao 0,52/ngày, tiếp tục tăng n ng đ NaCl 2M tốc đ sinh trưởng giảm nhẹ xuống 0,50/ngày N ng đ NaCl thấp gây ức chế sinh trưởng đ ng thời n ng đ NaCl làm giảm tốc đ sinh trưởng N ng đ NaCl cho sinh trưởng nhanh vi tảo Dunaliella salina DUN23 1,5M Nghiên cứu tương đ ng với kết nghiên cứu Farhat c ng (2011) loài Dunaliella salina, n ng đ NaCl tối ưu cho sinh trưởng 1,5M [15] Tuy nhiên, có sai khác với nghiên cứu Rad c ng (2011) chủng Dunaliella Iran, n ng đ NaCl tối ưu cho sinh trưởng 2,2M Có sai khác nghiên cứu hai đối tượng nghiên cứu hai chủng kh c điều kiện đ m n cho sinh trưởng kh c [27] Có tương quan số lượng tế bào (tb/ml) hàm lượng -caroten (mg/l) Tại n ng đ NaCl 1,5M, số lượng tế bào đạt cao 18,37×106 tb/ml 33 hàm lượng -caroten đạt cao 12 78 mg/l Tăng n ng đ NaCl hàm lượng -caroten giảm (ở n ng đ NaCl 5M hàm lượng -caroten giảm xuống thấp: 1,23 mg/l) Với hàm lượng -caroten t ch lũy tế bào vi tảo NaCl 5M điều kiện để t ch lũy cao β-caroten Vậy tăng n ng đ muối sinh trưởng giảm khả t ch lũy β-caroten tế bào giảm Vi tảo Dunaliella salina DUN23 có khả sinh trưởng dải n ng đ NaCl r ng N ng đ cao điều kiện thích hợp cho t ch lũy -caroten khơng thích hợp cho sinh trưởng Khả sinh trưởng mơi trường có n ng đ NaCl cao có lợi cho ni cấy đại trà, n ng đ NaCl cao ức chế sinh trưởng nhiều loài vi sinh vật nên giảm lây nhiễm nhiều loài vi sinh vật cạnh tranh Đ ng thời nước ta có bờ biển dài, cung cấp ngu n NaCl d i dào, thuận tiện cho việc nuôi cấy vi tảo Dunaliella salina DUN23 3.4.2 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng tích lũy -caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 Ánh sáng ngu n lượng cho trao đổi chất Dunaliella [12] Sinh trưởng t ch lũy -caroten phụ thu c vào cường đ chiếu sáng Vì vậy, thay đổi cường đ chiếu s ng để theo dõi tốc đ sinh trưởng khả t ch lũy caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 Tốc đ sinh trưởng tính tốn khoảng thời gian – 10 ngày Hàm lượng -caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 dựa theo phương ph p Shaish Kết thể hình 3.8 34 Hình 3.8 Ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng đến sinh t ƣởng và t ch lũycaroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 Cường đ chiếu sáng ảnh hưởng đến tốc đ sinh trưởng khả t ch lũy -caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 Khi tăng cường đ chiếu sáng, tốc đ sinh trưởng tăng đ ng kể Tăng cường đ chiếu sáng từ 10 kLux lên 13 kLux, tốc đ sinh trưởng tăng từ 38/ngày lên 52/ngày (tăng xấp xỉ 1,4 lần) Tăng cường đ chiếu sáng lớn 13kLux tốc đ sinh trưởng vi tảo giảm, cường đ chiếu sáng 14 kLux tốc đ sinh trưởng 9,32×106 tb/ml tương ứng 0,45/ngày Tương tự tăng cường đ chiếu s ng hàm lượng -caroten (mg/l) tăng đạt cao cường đ chiếu s ng 13 kLux (13 96 mg/l) Cường đ chiếu s ng tăng lên 14 kLux làm sinh trưởng đ ng thời giảm hàm lượng -caroten xuống 8,64 mg/l Tuy nhiên, cường đ chiếu sáng 13,5 kLux số lượng tế bào giảm hàm lượng -caroten không giảm nhiều so với cường đ chiếu sáng 13 kLux Như cường đ chiếu s ng cao điều kiện thích hợp cho t ch lũy -caroten tế bào vi tảo 35 Cường đ chiếu sáng thích hợp cho t ch lũy -caroten vi tảo Dunaliella salina DUN23 thấp so với chủng vi tảo Dunaliella salina NT6 phân lập từ ru ng muối Kh nh Hòa 14 kLux [3] Nhưng hàm lượng -caroten t ch lũy Dunaliella salina DUN23 (13,96 mg/l) lại cao Dunaliella salina NT6 (khoảng 10,85 mg/l) Cho thấy tiềm sản xuất -caroten tự nhiên từ vi tảo Dunaliella salina DUN23 lớn 3.5 Lựa chọn phƣơng pháp và dung mơi thích hợp cho tách chiết carotenoid Trong thí nghiệm việc lựa chọn dung mơi dựa vào đ c tính phân cực carotenoid sử dụng m t số dung môi thông dụng như: methanol acetone chloroform, n-hexane, ethanol, diethyl ether, petroleum ether dimethyl sulfoxide (DMSO) Do carotenoid tách chiết từ chủng DUN23 chưa biết thu c phân cực hay không phân cực nên d ng ba phương ph p với hỗn hợp đơn dung môi kết hợp vortex sonic cho tách chiết Kết trình bày hình 3.9 Phương pháp 1: Tách chiết đơn dung môi vortex Hàm lượng carotenoid thu từ vi tảo Dunaliella DUN23 sau chiết với dung môi b ng phương ph p vortex hạt thủy tinh trình bày hình 3.9a: lượng carotenoid chiết xuất dung mơi acetone đạt hiệu cao 18,64µg/ml Hai dung mơi n-hexan diethyl ether đạt 16,02µg/ml, 15,98µg/ml (hình 3.9a) Dung môi ethanol hiệu tách chiết thấp nhất, đạt 5,87µg/ml ly tâm phân lớp thu dịch chiết carotenoid nhận thấy màu sắc lớp c n vi tảo khơng màu hồn tồn mà có màu đỏ điều cho thấy carotenoid chưa hòa tan hồn tồn dung mơi Phương pháp 2: Tách chiết đơn dung môi sonic Kết hàm lượng carotenoid tách chiết với dung môi khác b ng sonic thể hình 3.9b Hàm lượng carotenoid thu tách chiết b ng dung môi acetone, diethyl ether n-hexan đạt 16,43; 15,82 15,38µg/ml, ba dung mơi cho hiệu tách chiết cao so với dung môi methanol, chloroform, ethanol, petroleum ether dimethyl sulfoxide (DMSO), 36 tương tự d ng phương ph p Tách chiết carotenoid với ethanol không đạt 20 20 18 18 16 Hàm lượng carotenoid (µg/ml) Hàm lượng carotenoid (µg/ml) hiệu cao nên bị loại phương ph p 14 12 10 16 14 12 10 2 0 (a) (b) Hàm lượng carotenoid (µg/ml) 25 20 15 10 (c) Hình 3.9 Hàm lƣợng carotenoid tách chiết phƣơng pháp (a) vo tex, (b) sonic, (c) hỗn hợp dung môi 37 Nhưng phương ph p sử dụng với mục đ ch kiểm tra lại tính chất dung mơi Kết hàm lượng carotenoid tách chiết ethanol phương pháp thấp đạt 65µg/ml điều cho thấy tính hòa tan carotenoid dung môi ethanol thấp Như vậy, dùng dung môi acetone hai phương ph p cho hiệu tách chiết carotenoid cao Hàm lượng carotenoid tách chiết dung môi acetone b ng phương ph p sonic đạt 88% so với phương ph p vortex Do lựa chọn phương ph p t ch chiết carotenoid b ng dung môi acetone vortex cho nghiên cứu Phương pháp 3: Tách chiết hỗn hợp dung môi vortex Trong phương ph p acetone n-hexan kết hợp với 30% dung môi ethanol, methanol diethyl ether Khi tr n hai dung môi ethanol, methanol nhận thấy hàm lượng carotenoid tách chiết giảm (hình 1c) Với hỗn hợp dung mơi hexane-ethanol/methanol tách chiết hình thành hai lớp lượng carotenoid đạt 10,51 9,86µg/ml, cho thấy hiệu không cao Hỗn hợp không dùng cho việc tách chiết Hỗn hợp acetone-diethylether, acetone-hexan cho lượng carotenoid 12,75; 17,12µg/ml Hỗn hợp dung mơi cho hiệu tách chiết không cao d ng đơn dung mơi acetone (18 64µg/ml) diethyl ether (15 98µg/ml) n- hexan(16,02µg/ml) Với hỗn hợp acetone-ethanol/methanol hàm lượng carotenoid thu 18,91 18,15µg/ml cho hiệu tách chiết cao gần giống tách chiết với acetone đạt 18 64µg/ml Như vậy, việc dùng hỗn hợp dung môi acetone:ethanol/methanol (7: 3) cho hiệu cao 3.6 Phân tích carotenoid sắc ký mỏng TLC Carotenoid hợp chất có sắc tố tổng hợp từ thực vật, vi sinh vật đ ng vật, chúng tạo màu vàng - đỏ cho thực vật sản phẩm đ ng vật Trong nghiên cứu này, thành phần carotenoid vi tảo Dunaliella salina DUN23 định tính sắc ký mỏng TLC Dựa chất chuẩn màu sắc quan sát vùng TLC theo Arnon (1949) Davies (1965) [5, 14] 38 Ở hình 3.10 cho thấy TLC vi tảo Dunaliella salina DUN23 phân tách xuất c c băng có tương đ ng vị trí màu sắc với băng β–caroten, Astaxanthin, Lutein chuẩn Điều cho thấy vi tảo Dunaliella salina DUN23 có chứa dẫn xuất quan trọng carotenoid β–caroten, astaxanthin lutein Astaxanthin có màu cam Băng pheophytin có màu trắng ngà Chlorophyll a, b có màu xanh n m vùng pheophytin Violaxanlthin neoxanthin x c định băng màu cam nhạt băng lutein [5, 14] Vi tảo Dunaliella salina DUN23 có - -caroten chứa chlorophyll a, b giúp cho vi tảo hấp thụ ánh sáng m t trời chuyển hóa thành dạng lượng mà vi tảo sử dụng Vi tảo Dunaliella salina DUN23 chứa sắc tố quang hợp: β–caroten; astaxanthin; lutein; - Astaxanthin; chlorophyll a, b; - Chlorophyll a, b violaxanlthin neoxanthin - Pheophytin pheophytin, - Lutein Các - Violaxanlthin carotenoid như: β–caroten; astaxanthin; - Neoxanthin lutein; pheophytin, violaxanlthin neoxanthin đóng vai trò chất chống oxy hóa, bảo vệ tế bào tránh tổn hại gốc tự DUN23 Astaxanthin Lutein -caroten Hình 3.10 Sắc k đồ TLC carotenoid vi tảo Dunaliella salina DUN23 Carotenoid góp phần ổn định bảo vệ b gen tế bào Khơng có tác dụng vi tảo, mà carotenoid có nhiều ứng dụng đời sống [25] C c điểm TLC đ nh dấu, cạo hòa tan trở lại acetone cho phân tích HPLC 39 3.7 Phân tách carotenoid phƣơng pháp HP C Phân tích b ng phương ph p HPLC sử dụng hỗn hợp dung môi methanol: acetonitrile: dichloromethane (50:42:8) c t silicagel Kết thể hình 3.11 3.12 Hình 3.11 Sắc k đồ chuẩn Lutein 9.814; Astaxanthin 12.985; -caroten 14.299 40 Kết phân tích mẫu chuẩn Lutein; Astaxanthin -caroten trình bày hình 3.11, cho thấy thời gian lưu Lutein 9.814 phút, Astaxanthin 12.985 phút -caroten 14.299 phút Sử dụng methanol cho thấy phân tách rõ ràng c c carotenoid Do dung môi sử dụng cho tất phân tích Sắc đ Dunaliella salina DUN23 cho thấy có xuất peak có thời gian lưu gần với giá trị Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298 phút, chứng tỏ mẫu có xuất loại carotenoid lutein, astaxanthin -caroten phù hợp với kết phân tích TLC Tuy nhiên, sắc đ có xuất nhiều c c peak kh c peak carotenoid khác hay dung môi -caroten rửa giải sau 14 phút Hàm lượng caroten x c định dựa vào diện tích peak chất phân tích chất chuẩn với n ng đ tương ứng Sắc ký đ Dunaliella salina DUN23 cho thấy diện -caroten m t thành phần với m t số carotenoid khác Thành phần -caroten chiếm 68,35 % (hình 3.12) Hình 3.12 Sắc k đồ HPLC Dunaliella salina DUN23 (Thời gian lƣu: Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298) 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào kết thu từ thí nghiệm tơi có kết luận sau: Phân lập, sàng lọc lưu giữ chủng Dunaliella có ký hiệu DUN11, DUN12 (ru ng muối Giao Phong) DUN21, DUN22, DUN23 (ru ng muối Bạch Long) t ch lũy lượng carotenoid 3,26 – 8,58 µg/ml - Vi tảo Dunaliella DUN23 dạng đơn bào hình cầu hai doi điểm mắt màu đỏ có m t lục lạp đơn hình chén Tế bào vi tảo Dunaliella DUN23 màu xanh chuyển sang màu vàng xanh ngày sinh trưởng thứ mười Dunaliella sinh sản theo hai hình thức hữu tính vơ tính - Dựa đ c điểm hình thái học phân tích trình tự gen 18S rDNA, ITS, Dunaliella DUN23 có đ tương đ ng 99 – 100% với chủng Dunaliella salina ký hiệu KF825551, JN034031 Đ m n cường đ chiếu sáng thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp carotenlà n ng đ NaCl 1,5M 13 kLux Ở n ng đ NaCl 1,5M, tốc đ sinh trưởng đạt 0,52/ngày (18,37×106 tế bào/ml) hàm lượng -caroten 12,78 mg/l Tốc đ sinh trưởng đạt cao cường đ sáng 13kLux (17,35×106 tb/ml) hàm lượng -caroten cao đạt 13,96 mg/l Phương ph p vortex với dung môi acetone đạt hiệu tách chiết carotenoid cao 18,64µg/ml Hỗn hợp acetone-ethanol/methanol sử dụng để t ch carotenoid hàm lượng carotenoid đạt 18,91 18,15µg/ml - Phân tích TLC, vi tảo Dunaliella salina DUN23 có chứa chlorophyll a, b sắc tố quang hợp: β–caroten; astaxanthin; lutein; chlorophyll a, b; pheophytin violaxanlthin neoxanthin Đ c biệt dẫn xuất quan trọng β– caroten, astaxanthin, lutein - Phân tích HPLC Dunaliella salina DUN23 xuất peak carotenoid lutein, astaxanthin -caroten Thành phần -caroten chiếm 68,35 % Kiến nghị 42 Tiếp tục nghiên cứu c c điều ảnh hưởng đến sinh trưởng khả t ch lũy -caroten Tối ưu hóa c c điều kiện tách chiết -caroten cho sản xuất thương mại 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Huỳnh Hiệp Hùng, Lê Thị Thanh Loan, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Thị Mỹ Phước, Phạm Thành Hổ, (2013), “Khảo sát khả tạo Beta-carotene chủng vi tảo Dunaliella phân lập Việt Nam” Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, T 16, S 1T Hoàng Thị Kim Hoa (2006) “Nghiên cứu qui trình cơng nghệ phân lập, làm bảo quản m t số giống vi tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi tr ng thủy sản” viện Ứng dụng Công nghệ, Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Hà N i Nguyễn Thị Hải Thanh, Ngô Đ ng Nghĩa (2014) “Phân lập vi tảo Dunaliella salina NT6 Khánh Hòa nghiên cứu c c điều kiện sinh trưởng tổng hợp -caroten tảo” Tạp chí Khoa học Trường Đại Học Cần Thơ 1, pp 218-228 Tiếng Anh Ardesen R A (2005) “Algal culturing technique” Elsevier Acedemic Press, New York, pp 90-92 Arnon D.I (1949), “Copper enzymes in chloroplasts Polyphenyloxidase in Beta vulgaris” Plant Physiol, 24, pp 1-15 Avron M., Ben-Amotz A (1992), “Dunaliella: Physiology, Biochemistry, and Biotechnology” CRC Press, Boca Raton, pp 2-16 Ben-Amotz A (1980) “Glycerol production in the alga Dunaliella”, Biochemical and Photosynthetic Aspects of Energy Production, San Pietro, A New York: Academic Press, pp 91–208 Ben-Amotz A Avron M (1983) “On the factors which determine massive beta-carotene accumulation in the halotolerant alga Dunaliella bardawil” Plant Physiol, 72, pp 593–597 Ben-Amotz A Avron M (1989) “The wavelength dependence of massive carotene synthesis in Dunaliella bardawil (Chlorophyceae)” JPhycol, 25, pp 175–178 44 10 Ben-Amotz A Avron M (1990) “The biotechnology of cultivating the halotolerant alga Dunaliella” Elsevier Science Publishers Ltd(UK), pp.121125 11 Ben-Amotz A (1991) “The Biotechnology of cultinvating Dunaliella for production of b-carotene rich algea” Bioreesource Technology, 38, pp 233235 12 Borowitzka L J Borowitzka M A (1989) “-carotene (provitamin A) production with algae” Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors ed Vandamme 13 Borowitzka M.A and Borowitzka L.J (1987), Limits to growth and carotenogenesis in laboratory and large-scale outdoors of Dunaliella salina In Algal Biotechnology ed Stadler, T., Molhan, J., Verdus, M.C., Karamanos, Y and Morvan, H.D London: Elsevier Applied Science, pp 345–402 14 Davies B.H.,(1965), “Analysis of carotenoid pigments” Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, London, Acad Press, pp.489-532 15 Farhat N., M Rabhi, H Falleh, J Jouini, C Abdelly and A Smaoui (2011), “Optimization of salt concentrations for a higher carotenoid production in Dunaliella salina” J.Phycol, 47, pp 1072-1077 16 Fawley Marvin W and Fawley Karen (2004) “A simple and rapid technique for the isolation of DNA from microalgae” J Phycol 40, pp 223–225 17 Gerster H (1997) “The potential role of lycopene for human health” J Am Coll Nutr, 16, pp 109–26 18 Gibor A (1956) “The culture of brine algae” Biology Bull (Woods Hole) 3, pp 223–229 19 Hager A Bertenrath TM (1966) “Die isolierung und quantitative bestimmung der carotinoide und chlorophylle von blättern, algen und isolierten chloroplasten mit hilfe dünnschichtchromatographischer methoden” Planta, 69, pp.198-216 45 20 Hosseini Tafreshi A and Shariati M (2008) “Dunaliella biotechnology: methods and applications” Journal of Applied Microbiology ISSN, pp 13645072 21 Jahnke L S (1999) “Massive carotenoid accumulation in Dunaliella bardawil induced by ultraviolet-A radiation” J Photochem Photobiology B 48, pp 68– 74 22 Katz A Pick U (2001) “Plasma membrane electron transport coupled to Na+ extrusion in the halotolerant alga Dualiella” Biochim Biophys Acta, 1504, pp 423–431 23 Khoo H K N Prasad K Kong Y Jiang and A Ismail (2011) “Carotenoids and Their Isomers: Color Pigments in Fruits and Vegetables” Molecules, 16, pp 1710-1738 24 Lee Y (2001) “Microalgal mass culture system and method: the limitation and potential” J Appl Phycol, 13, pp 307–315 25 Moorhead K., Capelli B (2006), Spirulina Nature’s Superfood, Cyanotech Corporation 26 Oren A (2005) “A hundred years of Dunaliella research: 1905– 2005” Saline Syst 1, 27 Rad F A A Nilufer A M A Hejazi (2011) “Effect of salinity on cell growth and -carotene production in Dunaliella sp isolates from Urmia Lake in northwest of Iran” African Journal of Biotechnology, 10, pp 2328-2333 28 Rao A.A., Rao LG (2007) “Carotenoids and human health”, Pharmacological Research, 55, pp 207–216 29 Tomas C.R.,(1997), Identifying Marine Phytolankton Academic Press 30 Ribaya-Mercado JD Blumberg JB (2004) “Lutein and zeaxanthin and their potential roles in disease prevention” J Am Coll Nutr; 23(6), pp 567S–87S 31 Sarmad J M Shariati A Tafreshi Hosseini (2006) “Preliminary assessment of β-carotene accumulation in four strains of Dunaliella salina cultivated under 46 the different salinities and low light intensity” Pakistan Journal Biology, 9, pp 1492 - 1496 32 Shaish A., A Ben-Amotz and M Avron (1992) “Biosynthesis of β- carotein in Dunaliella” Methods Enzymology, 213, pp 439 – 444 33 Shariati M., Hadi M.R (2011), Microalgal Biotechnology and Bioenergy in Dunaliella, 34 Ye Z H J G Jiang G H Wu (2008) “Biosynthesis and regulation of carotenoids in Dunaliella: Progresses and prospects” Biotechnology Advances, 26, pp 953-959 ... chủng vi tảo Mục đ ch nghiên cứu X c định m t số tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina Tuyển chọn vi tảo biển Dunaliella tiềm sinh tổng hợp carotenoid Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập. .. hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina phân lập từ ruộng muối Giao Thủy- Nam Định nh m tạo sở cho vi c đưa chủng vi tảo Dunaliella salina vào nhân nuôi quy mô công nghiệp, nh m đạt hiệu cao vi c... x c định tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina 3 Nghiên cứu c c yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng t ch lũy β-caroten vi tảo Dunaliella salina T ch chiết carotenoid từ vi tảo Dunaliella