Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh trong nọc rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

Phần I: Tổng quan tài liệu 1. Tai nạn do rắn cắn. 4 2. Rắn Hổ mang chúa Ophiophagus hannah. .6 3. Nọc độc và độc tố thần kinh alpha. 10 4. Khớp thần kinh-cơ 11 5. Kháng thể chống độc tố và giải độc

KHOA SINH HỌC

**********************

NGUYỄN HỮU HÙNG

TẠO KHÁNG THỂ

KHÁNG ĐỘC TỐ THẦN KINH ALPHA TRONG NỌC RẮN HỔ MANG CHÚA

(OPHIOPHAGUS HANNAH)

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2003

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS-TSKH NGUYỄN LÊ TRANG Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

Trong cuộc sống, tôi không thể làm được gì nếu tôi sinh ra và lớn khôn không có ba, không có mẹ, không có người thân, không có thầy cô cũng như không có bạn bè Sự thành công của tôi hôm nay và ngày mai không thể phủ nhận những gì mà họ đã giành cho tôi Chỉ xin nhờ luận văn này để bày tỏ lòng biết ơn của tôi

Xin kính dâng hương hồn ba Xin cảm ơn mẹ

Xin cảm ơn PGS-TS Nguyễn Lê Trang, Th.S Nguyễn Thị Nguyệt Thu cùng các anh chị Phòng Miễn dịch học, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

Xin cảm ơn quý thầy cô Khoa Sinh học cùng toàn thể các bạn lớp 99CNSH Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

Giới thiệu 1

Mục tiêu nghiên cứu 2

Phần I: Tổng quan tài liệu 1 Tai nạn do rắn cắn .4

2 Rắn Hổ mang chúa Ophiophagus hannah 6

3 Nọc độc và độc tố thần kinh alpha .10

4 Khớp thần kinh-cơ 11

5 Kháng thể chống độc tố và giải độc 13

Phần II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 1 Vật liệu .17

2 Phương pháp nghiên cứu 17

A Giai đoạn I: Tinh chế độc tố thần kinh alpha 19

1 Phương pháp Sắc ký lọc 19

2 Kiểm tra mức độ tinh chế bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS 21

3 Xác định độc lực .24

B Giai đoạn II: Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha .28

1 Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha 28

2 Tinh chế kháng thể bằng dung dịch Amonium sulfate bão hòa 31

3 Định tính kháng thể bằng phương pháp Ouchterlony .32

4 Định lượng kháng thể bằng phương pháp quang hấp thụ A280 và phương pháp Bradford 33

C Giai đoan III: Kiểm tra khả năng chống độc của kháng thể thu được đối với nọc toàn phần 36

Phần III: Kết quả và Thảo luận

1 Kết quả thực nghiệm 39

2 Thảo luận 44

Phần IV: Kết luận và Đề nghị

1 Kết luận 47 2 Đề nghị 47

Phần V: Tài liệu tham khảo

1 Tài liệu trong nước 50 2 Tài liệu ngoài nước 50 3 Tài liệu Internet 51

kháng nọc

Các thành phần trong nọc (K F Stocker, 1990 & A T Tu, 1991) bao gồm các thành phần độc và không độc Trong đó, một số thành phần dù không mang độc tính nhưng khi kết hợp với globulin miễn dịch lại gây phản ứng cho cơ thể nên

cần phải loại bỏ, ví dụ yếu tố CVF (Cobra venom factor) (có hoạt tính như C3b của bổ thể) Về độc tính, ở những loài thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae), phải kể đến

thành phần gây độc chủ yếu là độc tố thần kinh (độc tố alpha) và thành phần kém quan trọng hơn là độc tố tim (độc tố gamma)

Trong giới hạn của đề tài, đối tượng nghiên cứu là rắn Hổ mang chúa

(Ophiophagus hannah) thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae) chứa độc tố hậu khớp thần

kinh alpha (post synaptic neurotoxin) Do vậy, mục tiêu của chúng tôi là tạo kháng

thể đặc hiệu kháng một kháng nguyên là độc tố thần kinh alpha tinh chế với cấu trúc nguyên dùng làm huyết thanh kháng nọc toàn phần Xử lý huyết thanh

có được để loại trừ toàn bộ chất gây sốt, gây phản ứng quá mẫn và khi dùng, có thể tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch, dễ dàng sử dụng đối với y bác sĩ Từ đó, việc cứu chữa trở nên hiệu quả, có thể cứu sống nhanh chóng, hạn chế tối đa thương tật cho nạn nhân bị rắn cắn Khi đó, góp phần giải quyết những khó khăn của ngành y tế.

Mục tiêu nghiên cứu

1 Mục tiêu

Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha và đánh giá khả năng chống độc của kháng thể này đối với nọc toàn phần của rắn Hổ mang chúa

(Ophiophagus hannah)

2 Các bước tiến hành

• Tinh chế độc tố thần kinh alpha từ nọc rắn Hổ mang chúa

• Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha

• Kiểm tra khả năng bảo vệ của kháng thể kháng độc tố thần kinh

alpha đối với nọc toàn phần

Phần I

Tổng quan tài liệu

6 Tai nạn do rắn cắn

Vì mục đích sinh tồn (khả năng tự nuôi sống và tự bảo vệ) đối với môi trường xung quanh, rắn buộc phải có vũ khí để tự vệ và tấn công, đó là nọc độc [2, 14] Tính độc có được của nọc là do các thành phần độc tố có trong nọc tác động vào các quá trình sinh lý bình thường của con mồi nhằm mục tiêu bất hoạt chúng

Khi sống trong vùng có nhiều rắn, nhất là các loài rắn độc, con người cần phải có hiểu biết về rắn và các tập tính của nó để có biện pháp tốt nhất trong việc đề phòng rắn cắn Trong tự nhiên, rắn không phải là con vật hung dữ vì chúng không tấn công người mà luôn tìm cách tránh xa họ [2]ï Vì những lợi ích của rắn trong các bài thuốc y học cổ truyền hoặc thịt rắn có thể làm các món ăn “khoái khẩu”… nên người ta đã cố tình săn đuổi để bắt chúng, hoặc vì chúng cảm thấy mình đang bị tấn công khi con người đến gần hoặc vô tình con người động phải nơi ẩn núp của chúng nên chúng mới cắn để tự vệ Trong mùa sinh sản, rắn hay tấn công hơn để bảo vệ trứng hoặc rắn con trong tổ làm bằng lá cây Nếu không may dậm phải tổ rắn thì sẽ bị cắn

Vì rắn thường săn mồi về đêm và không phổ biến rộng nên số tai nạn xảy ra do rắn cắn chủ yếu là nông dân bao gồm những người sống bằng nghề nuôi rắn, những người làm công tác kiểm lâm, những người làm vườn và những thợ săn… Những báo cáo có được về các tai nạn rắn cắn đều dựa trên những trường hợp nhập viện Con số thật sự còn cao hơn rất nhiều

Nước ta thuộc khu vực Châu Á chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới nên rất thích hợp cho việc phát triển của các loài rắn độc Theo y văn [3, 4], tỉ lệ tử vong trong khu vực Châu Á chiếm 80% tổng số nạn nhân bị rắn cắn trên thế giới Tuy vậy, chưa có hệ thống giám sát nào về tai nạn do rắn cắn Một số

trường hợp nhập viện do rắn cắn chủ yếu là rắn Cạp nong (Bungarus faciatus), rắn

Lục tre (Trimeresurus albolabris), rắn Hổ mang đất (Naja kaouthia), rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)…

Do vậy, cần có các biện pháp hữu hiệu nhằm đạt được kết quả thống kê rõ ràng để có thông tin chính xác về tình hình rắn cắn ở Việt Nam

Một số hình ảnh sau mô tả một số hậu quả do rắn cắn để nói lên tính trầm trọng của thương tích khi nạn nhân thoát chết

Hình 1: Hoại tử tổ chức mô tại vị trí bị rắn Hổ (Elapidae) cắn (S Minton, 2002)

Hình 2: Hoại tử mô do Naja antra

cắn (S Minton, 2002)

Hình 3: Hoại tử mô do rắn Hổ

mang chúa (Ophiophagus hannah)

cắn (Nguyễn Lê Trang, 2002)

7 Rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

Loài: Ophiophagus hannah

Tên thường gọi: rắn Hổ mang chúa

Hổ mang chúa là loài rắn độc có cơ thể dài và lớn nhất trong tất cả các loài rắn trên thế giới [20, 22], chiều dài trung bình từ 3,9m đến 5,4m Chúng phân bố chủ yếu từ Ấn Độ đến Philipines, có mặt ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và Trung Quốc Chúng di chuyển bằng cách trườn trên mặt đất, tuy nhiên, chúng có thể ngẩn đầu lên cao 1,8m bằng một phần ba chiều dài cơ thể và ngang với chiều

cao của người trưởng thành (hình 5)

Da rắn Hổ mang chúa được phủ bởi một lớp vảy có bản chất là keratin, cơ thể tròn dài và thu nhỏ về phía đuôi Đầu rắn phẳng phía trên với hai mắt đen lánh phía trước [20] Cổ rắn có thể phình to ra hai bên và trở nên ghê sợ khi bị kích động

(hình 1) Sắc tố da rắn Hổ mang chúa rất phong phú Tùy vào nơi sinh sống, chúng

có thể có màu nâu, đen xen kẽ các vạch trắng hay vàng Màu sắc ở bụng cũng khá biến động, có khi là màu kem sáng đồng nhất, có khi lại xen với các vạch đen Nhìn chung, màu sắc của rắn Hổ mang chúa sống trong các vùng âm u thì xậm hơn những con sống trong vùng nhiều ánh sáng

Hình 4: Rắn Hổ mang chúa

Rắn Hổ mang chúa thay da từ 4-6 lần trong năm để trưởng thành Để làm được việc này, rắn phải cọ xát cơ thể vào những vật có cạnh cứng nhám Việc thay da làm cho rắn Hổ mang chúa giảm tầm quan sát trong 10 ngày Số lượng và sự sắp xếp của vảy hầu như không có gì thay đổi sau mỗi lần thay da Vảy trên lưng thì nhỏ và trơn, còn vảy ở bụng thì dài, rộng bằng với chiều rộng của bụng và xếp thành một cột duy nhất theo chiều hướng xuống

Nọc rắn Hổ mang chúa được chú ý nhiều nhất Nó có trong tuyến hạch nọc ngay đằng sau mắt dẫn đến hai răng móc thẳng đứng gắn vào phía trước xương hàm trên Răng móc có ống dẫn nọc, dài 12mm, bất động và nằm ở hàm trên Hàm dưới có hai xương nối khớp theo kiểu bản lề với nhau giúp rắn có thể nuốt chửng các con mồi lớn Con mồi có thể là một con rắn cùng kích thước, thậm chí dài hơn

Rắn Hổ mang chúa có tầm quan sát rất tốt, có thể quan sát trong phạm vi 100m bán kính Mặc dù không có tai nghe nhưng chúng vẫn có thể cảm nhận được âm thanh Chúng nếm và ngửi bằng lưỡi chẻ, thường thò ra ngoài để cảm nhận

(hình 1) Tuổi thọ của rắn có thể đạt 20 năm

Hình 5: Rắn Hổ mang chúa

Ophiophagus hannah (Nguyễn Lê

Trang, 2002)

Nhìn chung, rắn Hổ mang chúa được tìm thấy ở rất nhiều nơi như rừng mưa nhiệt đới, rừng đước ngập mặn, rừng tre, bãi cỏ và thậm chí nơi con người cư ngụ [3, 23] Chúng bơi rất giỏi và trèo rất tài nên có thể tìm thấy ở các bờ suối hay trên cây hoặc trên các vùng cao như đồi, núi Chúng có khả năng săn mồi suốt ngày đêm Thức ăn của rắn Hổ mang chúa là các loài bò sát, kể cả các loài rắn khác Chúng săn các loài rắn như rắn Chuột Châu Á (Asian ratsnake), trăn Ấn Độ (Indian cobros), rắn Cạp nong, thậm chí rắn Hổ mang chúa cùng loài Ngoài ra, chúng cũng ăn cả các loài thằn lằn

Rắn Hổ mang chúa có cách săn mồi rất độc đáo bằng cách ngửi (đánh hơi) không khí nhờ cái lưỡi chẻ của nó Khi tìm thấy con mồi, chúng nâng một phần ba cơ thể lên và mổ con mồi Trong trường hợp con mồi tẩu thoát, chúng có thể bám theo dấu vết ở một khoảng cách rất xa Khi chúng cắn (mổ) con mồi, các sợi cơ ở bộ phận tổ chức hạch co lại làm giải phóng nọc độc từ tuyến nọc vào con mồi nhờ hai răng móc Nọc độc gồm chủ yếu một chất độc thần kinh alpha (alpha-neurotoxin) [3, 4, 20, 22] làm cho cơ thể con mồi tê liệt, bất tỉnh và chết Triệu chứng bắt đầu chỉ 15-30 phút sau khi bị cắn Con mồi liệt hay chết sẽ bị nuốt chửng và rắn Hổ mang chúa có thể không ăn lại trong những tuần kế tiếp

Rắn Hổ mang chúa có rất nhiều kẻ thù tự nhiên, chúng bị săn đuổi bởi chồn, cầy hương, kiến, rếch khổng lồ… Trứng của chúng bị ăn, tổ và nơi trú ẩn bị hủy hoại bởi heo rừng và chồn

Tuy nhiên, kẻ thù lớn nhất của rắn Hổ mang chúa là con người Chúng bị giết vì mục đích thương mại Da, thịt và mật được dùng trong các bài thuốc Trung Hoa cổ truyền và nọc được dùng để chữa trị thấp khớp, lao phổi, dịch tả…

Rắn Hổ mang chúa thường sống đơn độc và chỉ đến với nhau khi bắt cặp giao phối Rắn thuần thục giới tính khi đạt 5-6 tuổi Mùa sinh sản bắt đầu từ tháng Giêng và biểu hiện bằng việc thay da Ở con cái, việc thay da làm tiết chất dẫn dụ

Pheromone hướng con đực tìm đến Khi chúng tìm thấy nhau, con đực quấn quanh, “âu yếm” con cái trong nhiều giờ Tinh trùng con đực thụ tinh cho trứng và con cái mang thai Con cái có thể tồn lưu tinh trùng trong nhiều năm và dùng nó để tự thụ tinh cho bản thân nhiều lần

Con cái đẻ 20-50 trứng sau thụ tinh hai tháng Trứng được đẻ trong tổ làm trong suốt hai tháng mang thai Rắn Hổ mang chúa là loài rắn duy nhất biết cách làm tổ Sau thời gian ấp trứng 60-70 ngày, trứng bắt đầu nở Cho đến khi nào rắn con tự nổi trên mặt nước được thì rắn mẹ mới bỏ chúng, để chúng độc lập và cũng để tránh được việc rắn mẹ ăn thịt các con của mình

Rắn con có các sọc vàng và đen xen kẻ, có kích thước 35cm chiều dài và 1,25cm chiều rộng Nọc của chúng chỉ có hiệu lực như một con rắn trưởng thành sau 10 ngày tuổi Lúc đó, chúng đã sẵn sàng cho việc săn mồi bằng vũ khí của

mình, nọc độc

8 Nọc độc và độc tố thần kinh alpha

Rắn Hổ mang chúa có nhiều cách để đưa nọc độc gây chết vào con mồi [3, 22] Một số phun nọc vào mắt gây đau và mù mắt Tuy nhiên, cách tốt nhất là đưa trực tiếp vào cơ thể con mồi bằng cú mổ, mục đích làm bất tỉnh con mồi

Rắn Hổ mang chúa thuộc nhóm nhỡn kính (Elapidae) Có hơn 270 loài rắn thuộc nhóm này Nọc rắn Hổ mang chúa có nhiều thành phần có và không có độc lực [12, 19] Độc lực mạnh nhất do thành phần độc tố thần kinh alpha đảm nhiệm

Hình 6: Phân tử độc tố thần kinh alpha [22]

chiếm khoảng 30% protein trong nọc toàn phần Độc tố này được phân bố theo đường tuần hoàn con mồi để tác động vào tế bào đích (tế bào cơ)

Phân tử độc tố thần kinh alpha (hình 6) có phân tử lượng 7000-8000D, chúng

kết hợp đặc hiệu với phân tử thụ quan hậu khớp thần kinh-cơ Ái lực của phân tử độc tố thần kinh alpha với thụ quan rất cao so với chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine (ACh) ( hằng số phân ly của độc tố là 10-9-10-10M trong khi hằng số phân ly của Acetylcholine là 10-6M) [17]

Người ta đã xác định rằng chỉ cần một phần ba vị trí thụ quan trên cơ hoành bị khóa bởi độc tố thần kinh này sẽ gây liệt thở [22] Với nọc rắn Hổ mang chúa, quá trình này xảy ra khoảng 30 phút sau khi bị cắn Tiếp đó, oxy không được đưa đủ vào phổi nên gây nhiều hậu quả bệnh lý dẫn đến tử vong Cách chống độc đặc hiệu duy nhất hiện nay là sử dụng ngay kháng huyết thanh kháng nọc càng sớm càng tốt sau khi bị cắn Trong trường hợp kháng huyết thanh kháng nọc không được chuẩn bị sẵn thì mạng sống sẽ phải được giữ bằng máy hô hấp nhân tạo cho tới khi cơ hoành hoạt động lại bình thường (nếu như độ nhiễm độc không quá trầm trọng)

9 Khớp thần kinh-cơ

Chức năng co của cơ được điều khiển bằng các xung động thần kinh Các xung thần kinh này nhanh chóng lan truyền dọc axon của tế bào thần kinh bằng cơ chế đảo cực điện thế cục bộ ở màng dẫn truyền đến các tế bào đích (tế bào cơ) để thực hiện chức năng như co thắt cơ hay bài tiết… [10] Kiểu liên lạc nội bào này xảy ra theo hai cơ chế: cơ chế điện hoặc/và cơ chế hóa học ngang qua khớp (synapse) giữa tế bào thần kinh (tế bào tiền khớp) và tế bào cơ (tế bào hậu khớp) Cơ chế điện xảy ra do sự tiếp xúc trực tiếp từ tế bào này với tế bào nối tiếp nhờ vào các ống dẫn ion cho phép điện thế hoạt động được dẫn truyền liên tục từ tế bào này đến tế bào kia Tuy nhiên, cơ chế dẫn truyền hóa học thông dụng hơn, sự dẫn

truyền có được nhờ vào các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmiter) được phóng thích ở màng tế bào tiền khớp Các chất hóa học này sau đó khuếch tán tới các thụ quan đặc hiệu gắn trên các tế bào hậu khớp là tế bào cơ, các thụ quan là Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), tạo ra một điện thế hoạt động mới

Acetylcholine là chất dẫn truyền thần kinh thông thường được biết đến nhiều nhất Nó được tổng hợp trong tế bào thần kinh nhờ enzyme Choline acetyl transferase như sau:

Khoảng 103-104 phân tử ACh được đóng gói thành một túi gọi là túi chứa chất dẫn truyền thần kinh nằm gần màng của axon tiền khớp Sự xuất hiện điện thế hoạt động của tế bào tiền khớp sẽ khởi động sự gia tăng lớn về tính thấm của màng tiền khớp với ion Ca2+ Dòng ion này đi vào trong axoplasm xuôi theo chiều gradient hóa học Sự hợp nhất túi chứa chất dẫn truyền thần kinh với màng tế bào và phóng thích ACh vào trong khe khớp (quá trình xuất bào) được tăng cường bởi sự gia tăng nồng độ Ca2+ nội bào (hình 7)

Hình 7: Sự truyền tín hiệu qua khớp thần kinh-cơ bằng cơ chế hóa học [10] Choline acetyl transferase

Lưới sợi liên kết

Hằng trăm túi chứa chất dẫn truyền thần kinh đổ ACh vào trong khe khớp làm tăng mạnh nồng độ ACh nội tại và được cảm nhận bởi thụ quan nAChR định vị trên màng tế bào hậu khớp Sự kết hợp chất dẫn truyền thần kinh với nhiều phân tử thụ quan sẽ khởi động một điện thế hoạt động trong tế bào hậu khớp bằng cách tăng tính thấm đối với ion Na+ và K+ ACh sau đó nhanh chóng bị thủy phân thành acetate và choline bởi một enzyme trong khe khớp là Acetylcholinesterase Khi đó, điện thế nghỉ của màng tế bào hậu khớp được khôi phục lại

10 Kháng thể chống độc tố và giải độc

Người mở đầu cho vấn đề tạo huyết thanh kháng nọc độc của rắn ở Việt Nam là A Calmette (1894) và cũng là người sáng lập ra Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh (Viện Pasteur thứ hai trên thế giới sau Viện Pasteur Pari, Pháp)

Nguyên tắc cơ bản là gây miễn nhiễm động vật với nọc độc để sản xuất kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa nọc độc này [4]

Kháng thể là sản phẩm của các dòng tế bào bạch huyết B trưởng thành (tương bào) có tính đặc hiệu với kháng nguyên [2, 8, 12] Kháng thể gồm chuỗi

nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) gắn kết với nhau bằng các cầu nối disulfide (hình 8).

Hình 8: Cấu trúc một phân tử Immunoglobulin điển hình [26] Acetylcholinesterase

Có nhiều loại phân tử kháng thể khác nhau do sự khác biệt ở các chuỗi

polypeptide như nêu trong bảng 1 sau:

Bảng 1: Các lớp kháng thể và nồng độ sinh lý của chúng trong huyết thanh

Chuỗi nặng Chuỗi nhẹ Lớp KT Nồng độ (g/l)

Vậy, khi nhiễm độc (rắn cắn), trong cơ thể sẽ có độc tố tự do lưu hành trong máu tuần hoàn và dịch kẽ tế bào Các phân tử độc tố tự do đến gần các thụ quan đặc hiệu và tạo thành phức hợp Thụ quan-Độc tố ngăn cản sự tiếp nhận Acetylcholine Đây là nguyên nhân làm cho các tín hiệu thần kinh bị tắt nghẽn dẫn đến sự mất chức năng vận động, bài tiết… của cơ quan đích đáp ứng với đòi hỏi trong hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể

+

Giải độc: khi sử dụng kháng thể làm nhân tố giải độc (cách giải độc đặc

hiệu duy nhất được biết hiện nay), kháng thể có hai vai trò như sau: Thụ quan tự do Độc tố Thụ quan-Độc tố

i Kháng thể ngăn chặn độc tố tự do bám vào thụ quan

n(Kháng thể) + m(Độc tố tự do) (Kháng thể)n-(Độc tố)m

Phức hợp (Kháng thể)n-(Độc tố)m không bám vào được thụ quan do hoặc kháng thể gắn vào vị trí gắn thụ quan của độc tố hoặc phức hợp trở nên quá lớn không kết hợp được với thụ quan Đã có nghiên cứu cho biết m = 1 và n = 4 đối với độc tố thần kinh alpha

ii Tách phức hợp Thụ quan-Độc tố

Trong trường hợp này, các phân tử độc tố alpha đã gắn với các thụ quan trên các tế bào đích nhưng không đồng trị Các phân tử kháng thể đặc hiệu (từ kháng huyết thanh) sẽ gắn vào phân tử độc tố alpha này làm biến đổi cấu trúc của chúng khiến cho ái lực gắn thụ quan bị suy giảm và mất hẳn Khi đó, các thụ quan được giải phóng [3]

Thụ quan-Độc tố + Kháng thể Kháng thể-Độc tố + Thụ quan

Theo cơ chế đó, toàn bộ độc tố được giải phóng nếu lượng kháng thể được tiêm vào đầy đủ cho bệnh nhân Phức hợp Kháng thể-Độc tố và kháng thể thừa tiếp đó đi theo qui trình bài tiết qua đường niệu ra khỏi cơ thể.

Phần II

Vật liệu &

Phương pháp nghiên cứu

1 Vật liệu

1.1 Đối tượng nghiên cứu

_ Nọc rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah), Trung tâm Nuôi trồng, Chế

biến và Nghiên cứu dược liệu Quân khu 9 cung cấp

_ Chuột nhắt trắng 18-20g, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp _ Thỏ 2-2,5kg, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

1.2 Hóa chất và dung môi

_ Sephadex G-50 SF, Pharmacia (Thụy Điển) _ Albumine huyết thanh bò (BSA) (Sigma) _ Mọi hóa chất và đệm đạt mức phân tích

1.3 Nơi tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Miễn dịch học, Khoa Vi sinh-Miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

2 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài tiến hành theo 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn bao gồm một số kỹ thuật Một quá trình từ khi tinh chế độc tố thần kinh alpha đến khi thu được kháng thể IgG

đặc hiệu kháng độc tố này được tóm tắt bằng sơ đồ 1 như sau:

Nọc toàn phần

Tinh chế độc tố thần kinh bằng Sắc ký lọc

Xác định độc lực

Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha

SDS-PAGE gradient 8-18%T

Tinh chế kháng thể

Định tính kháng thểĐịnh lượng kháng thể

Trung hòa độc lực nọc toàn phần in vivo

(I)

(III) (II)

Sơ đồ 1: Qui trình thí nghiệm tạo kháng thể chống độc tố thần kinh alpha

A Giai đoạn I: Tinh chế độc tố thần kinh alpha 1 Phương pháp Sắc ký lọc

1.1 Nguyên tắc

Sắc ký lọc dùng vật liệu là những vi hạt gel có khả năng ngậm nước rất cao Các hạt gel này là những sợi polymer (polyoside, polyacrylamide…) dài, có những cầu nối liên kết ngang để làm giảm bớt độ mềm, chịu được sức ép khi bị nén mà không bị biến dạng, vẫn cho phép dung môi lưu thông

Trên bề mặt cũng như ở phía trong của hạt gel, kích thước của các kẽ không gian trống giữa các sợi polymer cho phép các phân tử tan trong dung môi có thể thấm vào không gian trong hạt gel và do đó có thể di chuyển

quanh co trong cấu trúc của hạt gel (hình 9A)

Ví dụ: một lớp mỏng dung dịch mẫu gồm hai loại phân tử khác nhau được đặt rải trên bề mặt đi vào của cột gel, một loại không thể thấm vào hạt gel do phân tử quá lớn đối với kẽ giữa các sợi polymer và loại phân tử kia nhỏ hơn có thể đi qua các kẽ giữa lưới sợi polymer Khi lớp mẫu đã vào trong gel, dung môi được cho vào liên tục để di chuyển các phần tử qua cột sắc ký

Cách tiến hành trên nhằm mục đích để tách hai loại phân tử lẫn lộn lúc ban đầu

Phân tử tan trong dung môi khi gặp pha gel sẽ được phân phối theo cơ chế

khuếch tán giữa pha gel tĩnh (không di) và pha lỏng động (di) phía ngoài các hạt Hình 9: Sắc ký lọc

A

B A

gel Sự phân phối đó sẽ nhanh chóng được cân bằng giữa hai pha (hai mũi tên trên

hình 9B biểu hiện điều đó) Để sự thấm vào pha gel được hiệu quả, cần thực hiện

tốc độ di của pha lỏng tối ưu để khuếch tán của các phân tử đủ đạt cân bằng giữa hai pha động và tĩnh Đối với một cột gel, nếu tổng khối của cột gel là Vt, pha gel chỉ chiếm một khối Vg và ngoài các hạt gel, pha lỏng chiếm khối Vo Một phân tử thấm được vào hạt gel nhưng không thể phân phối được vào toàn bộ khối hạt gel, mà chỉ một phần của khối hạt gel, một phân số của khối có thể vào được, phân số Kv Do đó, đối với một phân tử, sau khi đã đi qua cột gel, tổng khối của pha gel cho phép phân tử đó có thể thấm vào là Kv x Vg Đối với một phân tử không thấm được vào pha gel, qua toàn bộ quá trình di qua cột, sẽ ra khỏi cột khi một khối dung môi Ve = Vo được đi qua cột Trong trường hợp của các phân tử không thấm được, Kv = 0 Đối với một phân tử thấm được vào thì Ve = Vo + (Kv x Vg) Như vậy:

got VV

Như vừa nêu, đối với các phân tử không thấm được vào pha gel, Kv = 0 Ngược lại, đối với các phân tử (rất nhỏ đối với kẽ giữa các sợi polymer) thấm được tối đa vào toàn bộ khối pha gel Vg, Ve -> Vt, Kv -> 1 Đối với các phân tử thấm được vào hạt gel, nếu Kv càng cao thì phân tử ra khỏi cột ở Ve càng lớn

Cho vào cột 6ml dung dịch nọc rắn Ophiophagus hannah (pha trong đệm

Amonium acetate 0,05M pH7,2) nồng độ là 117mg/ml Như vậy, có 702mg nọc khô trong 6ml dung dịch nọc

Đẩy protein bằng dung dịch đệm Amonium acetate 0,05M pH7,2 Hứng đoạn 10ml/đoạn/40 phút

Đo A280 bằng máy quang phổ để xác định nồng độ protein trong các phân đoạn thu được

2 Kiểm tra mức độ tinh chế bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS

Khi tan trong nước, APS tạo các gốc tự do theo cơ chế: S2O82- 2SO4-

Các gốc tự do này hoạt hóa các phân tử Acrylamide và N, bis-(acrylamide) tạo thành mạng lưới polymer liên kết chéo giữa các phân tử này Khi đó, trong mạng lưới sẽ tạo nên các vi lỗ phụ thuộc vào hai thông số: một là

N’-Methylene-lượng acrylamide tổng số sử dụng, hai là mức độ liên kết chéo Nhìn chung, N’-Methylene-lượng acrylamide tổng số càng cao thì lỗ tạo nên càng nhỏ và nếu 5% tổng acrylamide là do bis-(acrylamide) thì lỗ sẽ có kích thước nhỏ nhất

TEMED thường được thêm vào ở nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel vì vai trò làm tồn tại các gốc tự do của nó

Hệ thống đệm giúp duy trì pH không đổi trong thùng chứa đệm, trong gel và có vai trò như một chất điện phân cho phép dẫn dòng điện ngang qua điện trường Do vậy, hệ đệm phải hội đủ 3 điều kiện sau:

• Không tương tác với các đại phân tử cần phân tích

• pH của môi trường điện di không làm biến tính các đại phân tử • Lực ion và nồng độ đệm phải thích hợp

Có hai phương pháp diện di dùng gel polyacrylamide: có SDS và không SDS (SDS: Sodium dodecylsulfate) SDS có vai trò làm biến tính protein do SDS kết hợp với các vùng kị nước của protein và tách chúng thành các tiểu phần, đồng thời làm âm tính hóa các tiểu phần này

Ngoài ra, nếu các tiểu phần của protein gắn với nhau bằng các liên kết disulfite, những liên kết này bị bẽ gãy khi có mặt SDS và β-Mercaptoethanol hay Dithiothreitol (DTT) tạo thành nhóm –SH Những nhóm này sau đó sẽ bị khóa bởi tác nhân alkyl hóa để chống lại sự tái tạo liên kết disulfite

Hầu hết protein đều tích điện âm, do đó, khi di chuyển trong điện trường, protein sẽ hướng về điện cực dương (anode) Tại cực âm (cathode) và cực dương (anode) xảy ra quá trình điện phân nước như sau:

• Cực âm: 2H2O + 2e- -> 2OH- + H2 HA + OH- <-> A- + H2O

• Cực dương: H2O - 2e--> 2H+ + ½ O2 H+ + A- <-> HA

Để tăng hiệu quả phân tách, người ta đã sử dụng phương pháp điện di không liên tục bằng cách dùng hai hệ gel gồm:

• Lớp gel tập trung: có vai trò làm cho các đại phân tử tập trung lại tại một vạch xuất phát (bề mặt tiếp xúc giữa hai lớp gel là lớp gel tập trung và lớp gel phân tích), nồng độ acrylamide thấp, pH6,8

• Lớp gel phân tích: là lớp chính dùng để phân tách các đại phân tử trong mẫu, nồng độ acrylamide cao, pH8,8

2.2 Tiến hành

Thí nghiệm sử dụng phương pháp điện di gel polyacrylamide với gradient dốc cong từ 8%T tới 18%T đối với lớp gel phân tích và 4,25%T đối với lớp gel tập trung

Mẫu điện di là nọc toàn phần và các thành phần tinh chế được sau quá trình

Sắc ký lọc (xem phần III) với phân bố theo bảng 2 như sau:

Bảng 2: Phân bố mẫu trong xét nghiệm điện di gel polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS

Giếng Mẫu Khối lượng (µg) 1

2 3 4 5

Nọc Đỉnh 1 Đỉnh 2 Đỉnh 3 Đỉnh 4

4 4 4 4 4 6

7 8 9 10

Đỉnh 4 Đỉnh 3 Đỉnh 2 Đỉnh 1 Nọc

2 2 2 2 2