Tạo kháng thể độc tố thần kinh Alpha trong nọc rắn hổ mang chúa

Tạo kháng thể độc tố thần kinh Alpha, nọc rắn hổ mang chúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC ********************** NGUYỄN HỮU HÙNG TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG ĐỘC TỐ THẦN KINH ALPHA TRONG NỌC RẮN HỔ MANG CHÚA (OPHIOPHAGUS HANNAH) KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2003 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS-TSKH NGUYỄN LÊ TRANG Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 2 Trong cuộc sống, tôi không thể làm được gì nếu tôi sinh ra và lớn khôn không có ba, không có mẹ, không có người thân, không có thầy cô cũng như không có bạn bè. Sự thành công của tôi hôm nay và ngày mai không thể phủ nhận những gì mà họ đã giành cho tôi. Chỉ xin nhờ luận văn này để bày tỏ lòng biết ơn của tôi. Xin kính dâng hương hồn ba. Xin cảm ơn mẹ. Xin cảm ơn PGS-TS Nguyễn Lê Trang, Th.S Nguyễn Thò Nguyệt Thu cùng các anh chò Phòng Miễn dòch học, Khoa Vi sinh Miễn dòch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Xin cảm ơn quý thầy cô Khoa Sinh học cùng toàn thể các bạn lớp 99CNSH Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Ngày 12 tháng 7 năm 2003. Nguyễn Hữu Hùng Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 3 MỤC LỤC Giới thiệu 1 Mục tiêu nghiên cứu .2 Phần I: Tổng quan tài liệu 1. Tai nạn do rắn cắn. 4 2. Rắn Hổ mang chúa Ophiophagus hannah 6 3. Nọc độc và độc tố thần kinh alpha. 10 4. Khớp thần kinh-cơ 11 5. Kháng thể chống độc tố và giải độc 13 Phần II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 1. Vật liệu. .17 2. Phương pháp nghiên cứu 17 A . Giai đoạn I : Tinh chế độc tố thần kinh alpha 19 1. Phương pháp Sắc ký lọc 19 2. Kiểm tra mức độ tinh chế bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS .21 3. Xác đònh độc lực. 24 B. Giai đoạn II : Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha 28 1. Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha .28 2. Tinh chế kháng thể bằng dung dòch Amonium sulfate bão hòa .31 3. Đònh tính kháng thể bằng phương pháp Ouchterlony. 32 Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 4 4. Đònh lượng kháng thể bằng phương pháp quang hấp thụ A 280 và phương pháp Bradford 33 C. Giai đoan III : Kiểm tra khả năng chống độc của kháng thể thu được đối với nọc toàn phần .36 Phần III: Kết quả và Thảo luận 1. Kết quả thực nghiệm .39 2. Thảo luận .44 Phần IV: Kết luận và Đề nghò 1. Kết luận .47 2. Đề nghò .47 Phần V: Tài liệu tham khảo 1. Tài liệu trong nước .50 2. Tài liệu ngoài nước 50 3. Tài liệu Internet .51 Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 5 Giới thiệu Hiện nay, ngành y tế còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc chế tạo và sử dụng kháng huyết thanh chống nọc độc của rắn. Khi gây miễn nhiễm động vật bằng nọc độc của rắn để tạo kháng huyết thanh, đáp ứng miễn dòch xảy ra không cao (kháng thể đặc hiệu thu được ít và ái lực thấp). Bên cạnh đó, tình trạng sốc phản vệ thường xảy ra đối với bệnh nhân bò rắn cắn khi sử dụng kháng huyết thanh kháng nọc. Các thành phần trong nọc (K. F. Stocker, 1990 & A. T. Tu, 1991) bao gồm các thành phần độc và không độc. Trong đó, một số thành phần dù không mang độc tính nhưng khi kết hợp với globulin miễn dòch lại gây phản ứng cho cơ thể nên cần phải loại bỏ, ví dụ yếu tố CVF (Cobra venom factor) (có hoạt tính như C 3b của bổ thể). Về độc tính, ở những loài thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae), phải kể đến thành phần gây độc chủ yếu là độc tố thần kinh (độc tố alpha) và thành phần kém quan trọng hơn là độc tố tim (độc tố gamma). Trong giới hạn của đề tài, đối tượng nghiên cứu là rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae) chứa độc tố hậu khớp thần kinh alpha (post synaptic neurotoxin). Do vậy, mục tiêu của chúng tôi là tạo kháng thể đặc hiệu kháng một kháng nguyên là độc tố thần kinh alpha tinh chế với cấu trúc nguyên dùng làm huyết thanh kháng nọc toàn phần. Xử lý huyết thanh có được để loại trừ toàn bộ chất gây sốt, gây phản ứng quá mẫn và khi dùng, có thể tiêm trực tiếp vào tónh mạch, dễ dàng sử dụng đối với y bác só. Từ đó, việc cứu chữa trở nên hiệu quả, có thể cứu sống nhanh chóng, hạn chế tối đa thương tật cho nạn nhân bò rắn cắn. Khi đó, góp phần giải quyết những khó khăn của ngành y tế. Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 6 Mục tiêu nghiên cứu 1. Mục tiêu Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha và đánh giá khả năng chống độc của kháng thể này đối với nọc toàn phần của rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah). 2. Các bước tiến hành • Tinh chế độc tố thần kinh alpha từ nọc rắn Hổ mang chúa • Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha • Kiểm tra khả năng bảo vệ của kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha đối với nọc toàn phần Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 7 Phần I Tổng quan tài liệu Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 8 6. Tai nạn do rắn cắn Vì mục đích sinh tồn (khả năng tự nuôi sống và tự bảo vệ) đối với môi trường xung quanh, rắn buộc phải có vũ khí để tự vệ và tấn công, đó là nọc độc [2, 14]. Tính độc có được của nọc là do các thành phần độc tố có trong nọc tác động vào các quá trình sinh lý bình thường của con mồi nhằm mục tiêu bất hoạt chúng. Khi sống trong vùng có nhiều rắn, nhất là các loài rắn độc, con người cần phải có hiểu biết về rắn và các tập tính của nó để có biện pháp tốt nhất trong việc đề phòng rắn cắn. Trong tự nhiên, rắn không phải là con vật hung dữ vì chúng không tấn công người mà luôn tìm cách tránh xa họ [2]ï. Vì những lợi ích của rắn trong các bài thuốc y học cổ truyền hoặc thòt rắn có thể làm các món ăn “khoái khẩu”… nên người ta đã cố tình săn đuổi để bắt chúng, hoặc vì chúng cảm thấy mình đang bò tấn công khi con người đến gần hoặc vô tình con người động phải nơi ẩn núp của chúng nên chúng mới cắn để tự vệ. Trong mùa sinh sản, rắn hay tấn công hơn để bảo vệ trứng hoặc rắn con trong tổ làm bằng lá cây. Nếu không may dậm phải tổ rắn thì sẽ bò cắn. Vì rắn thường săn mồi về đêm và không phổ biến rộng nên số tai nạn xảy ra do rắn cắn chủ yếu là nông dân bao gồm những người sống bằng nghề nuôi rắn, những người làm công tác kiểm lâm, những người làm vườn và những thợ săn… Những báo cáo có được về các tai nạn rắn cắn đều dựa trên những trường hợp nhập viện. Con số thật sự còn cao hơn rất nhiều. Nước ta thuộc khu vực Châu Á chòu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới nên rất thích hợp cho việc phát triển của các loài rắn độc. Theo y văn [3, 4], tỉ lệ tử vong trong khu vực Châu Á chiếm 80% tổng số nạn nhân bò rắn cắn trên thế giới . Tuy vậy, chưa có hệ thống giám sát nào về tai nạn do rắn cắn. Một số trường hợp nhập viện do rắn cắn chủ yếu là rắn Cạp nong (Bungarus faciatus), rắn Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 9 Lục tre (Trimeresurus albolabris), rắn Hổ mang đất (Naja kaouthia), rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)… Do vậy, cần có các biện pháp hữu hiệu nhằm đạt được kết quả thống kê rõ ràng để có thông tin chính xác về tình hình rắn cắn ở Việt Nam. Một số hình ảnh sau mô tả một số hậu quả do rắn cắn để nói lên tính trầm trọng của thương tích khi nạn nhân thoát chết. Hình 1: Hoại tử tổ chức mô tại vò trí bò rắn Hổ (Elapidae) cắn (S. Minton, 2002). Hình 2: Hoại tử mô do Naja antra cắn (S. Minton, 2002). Hình 3: Hoại tử mô do rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) cắn (Nguyễn Lê Trang, 2002). Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng Khóa 1999-2003 10 7. Rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) Bộ: Squamata. Bộ phụ: Serpentes (Ophidia). Dòng: Elapidae. Họ: Bungarinae. Tông: Najini. Giống: Ophiophagus. Loài: Ophiophagus hannah. Tên thường gọi: rắn Hổ mang chúa. Hổ mang chúa là loài rắn độc có cơ thể dài và lớn nhất trong tất cả các loài rắn trên thế giới [20, 22], chiều dài trung bình từ 3,9m đến 5,4m. Chúng phân bố chủ yếu từ Ấn Độ đến Philipines, có mặt ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và Trung Quốc. Chúng di chuyển bằng cách trườn trên mặt đất, tuy nhiên, chúng có thể ngẩn đầu lên cao 1,8m bằng một phần ba chiều dài cơ thể và ngang với chiều cao của người trưởng thành (hình 5). Da rắn Hổ mang chúa được phủ bởi một lớp vảy có bản chất là keratin, cơ thể tròn dài và thu nhỏ về phía đuôi. Đầu rắn phẳng phía trên với hai mắt đen lánh phía trước [20]. Cổ rắn có thể phình to ra hai bên và trở nên ghê sợ khi bò kích động (hình 1). Sắc tố da rắn Hổ mang chúa rất phong phú. Tùy vào nơi sinh sống, chúng có thể có màu nâu, đen xen kẽ các vạch trắng hay vàng. Màu sắc ở bụng cũng khá biến động, có khi là màu kem sáng đồng nhất, có khi lại xen với các vạch đen. Nhìn chung, màu sắc của rắn Hổ mang chúa sống trong các vùng âm u thì xậm hơn những con sống trong vùng nhiều ánh sáng. Hình 4: Rắn Hổ mang chúa Ophiophagus hannah [30]. [...]... trong nọc rắn Hổ mang chúa, nọc xét nghiệm phải đi từ hỗn hợp nọc của một số lớn rắn Hổ mang chúa khác nhau 29 Luận văn tốt nghiệp Ngành CNSH Khóa 1999-2003 B Nguyễn Hữu Hùng Giai đoạn II: Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha 1 Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha 1.1 Nguyên tắc Để tạo được kháng thể, buộc phải dựa vào cơ thể động vật Kháng nguyên là độc tố thần kinh alpha. .. nọc độc 8 Nọc độc và độc tố thần kinh alpha Rắn Hổ mang chúa có nhiều cách để đưa nọc độc gây chết vào con mồi [3, 22] Một số phun nọc vào mắt gây đau và mù mắt Tuy nhiên, cách tốt nhất là đưa trực tiếp vào cơ thể con mồi bằng cú mổ, mục đích làm bất tỉnh con mồi Rắn Hổ mang chúa thuộc nhóm nhỡn kính (Elapidae) Có hơn 270 loài rắn thuộc nhóm này Hình 6: Phân tử độc tố thần kinh alpha [22] Nọc rắn Hổ. .. tinh chế độc tố thần kinh alpha đến khi thu được kháng thể IgG đặc hiệu kháng độc tố này được tóm tắt bằng sơ đồ 1 như sau: 20 Luận văn tốt nghiệp Ngành CNSH Khóa 1999-2003 Nguyễn Hữu Hùng Nọc toàn phần Giai đoạn I Tinh chế độc tố thần kinh bằng Sắc ký lọc (I) Xác đònh độc lực SDS-PAGE gradient 8-18%T Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha Giai đoạn II (II) Tinh chế kháng thể Đònh tính kháng thể Giai... Hùng Kháng thể ngăn chặn độc tố tự do bám vào thụ quan n (Kháng thể) + m (Độc tố tự do) (Kháng thể) n- (Độc tố) m Phức hợp (Kháng thể) n- (Độc tố) m không bám vào được thụ quan do hoặc kháng thể gắn vào vò trí gắn thụ quan của độc tố hoặc phức hợp trở nên quá lớn không kết hợp được với thụ quan Đã có nghiên cứu cho biết m = 1 và n = 4 đối với độc tố thần kinh alpha ii Tách phức hợp Thụ quan -Độc tố Trong trường... Khi tiêm độc tố alpha vào cơ thể động vật (thỏ), trong cơ thể sẽ hình thành một đáp ứng miễn nhiễm (ĐƯMN) để chống lại sự xâm nhập của kháng nguyên lạ, đó là độc tố alpha, bằng việc sản sinh ra kháng thể đặc hiệu với độc tố này [2, 8, 12, 17] Khi tiếp xúc lần đầu với phân tử độc tố thần kinh alpha, cơ thể sẽ hình thành một ĐƯMN gọi là đáp ứng sơ cấp Các đại thực bào nhận diện các phân tử độc tố alpha, ... hậu khớp thần kinh- cơ Ái lực của phân tử độc tố thần kinh alpha với thụ quan rất cao so với chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine (ACh) ( hằng số phân ly của độc tố là 10-9-10-10M trong khi hằng số phân ly của Acetylcholine là 10-6M) [17] Người ta đã xác đònh rằng chỉ cần một phần ba vò trí thụ quan trên cơ hoành bò khóa bởi độc tố thần kinh này sẽ gây liệt thở [22] Với nọc rắn Hổ mang chúa, quá... phần nọc và độ độc tương ứng có thể thay đổi ở từng cá thể trong cùng một loài rắn, thậm chí thay đổi ở những thời điểm khác nhau trong suốt thời gian sống của một cá thể Các thay đổi này có thể do nguồn gốc đòa lý, chế độ ăn uống, tuổi rắn đã ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp nọc độc Nhằm thực hiện tốt xét nghiệm này và để tạo một kháng huyết thanh có khả năng trung hòa độc tố thần kinh alpha trong. .. kinh alpha [22] Nọc rắn Hổ mang chúa có nhiều thành phần có và không có độc lực [12, 19] Độc lực mạnh nhất do thành phần độc tố thần kinh alpha đảm nhiệm 13 Luận văn tốt nghiệp Ngành CNSH Khóa 1999-2003 Nguyễn Hữu Hùng chiếm khoảng 30% protein trong nọc toàn phần Độc tố này được phân bố theo đường tuần hoàn con mồi để tác động vào tế bào đích (tế bào cơ) Phân tử độc tố thần kinh alpha (hình 6) có phân... các phân tử độc tố alpha đã gắn với các thụ quan trên các tế bào đích nhưng không đồng trò Các phân tử kháng thể đặc hiệu (từ kháng huyết thanh) sẽ gắn vào phân tử độc tố alpha này làm biến đổi cấu trúc của chúng khiến cho ái lực gắn thụ quan bò suy giảm và mất hẳn Khi đó, các thụ quan được giải phóng [3] Thụ quan -Độc tố + Kháng thể Kháng thể- Độc tố + Thụ quan Theo cơ chế đó, toàn bộ độc tố được giải... trong nọc sau Sắc ký lọc và so sánh với nọc toàn phần 3.1 Nguyên tắc Độc lực được biểu thò bằng giá trò LD50 (lethal dose 50%) LD50 là liều tối thiểu (của nọc hoặc độc tố) gây chết 50% số động vật thí nghiệm Do đó, nọc hoặc độc tố càng độc thì giá trò LD50 càng thấp Động vật dùng thử nghiệm là thỏ hay chuột nhắt trắng nhưng chuột nhắt trắng thường được sử dụng nhiều hơn Nọc hoặc độc tố đưa vào cơ thể . hành • Tinh chế độc tố thần kinh alpha từ nọc rắn Hổ mang chúa • Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha • Kiểm tra. tiêu Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha và đánh giá khả năng chống độc của kháng thể này đối với nọc toàn phần của rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus