3.1. Nguyên tắc
Đây là phương pháp khuyếch tán kép trên gel agarore thường được dùng trong các xét nghiệm miễn dịch để định tính kháng thể sau khi gây miễn nhiễm động vật. Các dung dịch kháng nguyên và kháng thể được đặt trong các giếng khác nhau trên gel agarose với một khoảng cách thích hợp để chúng có khả năng gặp nhau (dựa vào khả năng khuếch tán). Khi đó, các phân tử kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán vào gel. Nồng độ của mỗi phân tử giảm dần từ tâm giếng đến vị trí khuếch tán xa nhất. Tại nơi tiếp xúc giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ xảy ra tương tác kháng nguyên-kháng thể tạo thành tủa. Tuy vậy, sự kết tủa chỉ có được khi có một tỉ lệ thích hợp giữa lượng kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu [7, 18]. Mặc dù vậy, tỉ lệ thích hợp này còn phụ thuộc rất nhiều vào tính chất kháng nguyên, loại kháng nguyên, số lượng hóa trị (epitope) của kháng nguyên cũng như tính chất của kháng thể có được.
3.2. Tiến hành
Pha loãng bậc hai liên tục kháng nguyên (nọc toàn phần và độc tố thần kinh alpha). Xây dựng các xét nghiệm như bảng 4:
Bảng 4: Các xét nghiệm định tính kháng thể trước và sau miễn nhiễm với độc tố thần kinh alpha.
Kháng thể Kháng nguyên Xét nghiệm
Thời gian thu Pha loãng bậc hai Mẫu Pha loãng bậc hai A Trước miễn 1 Độc tố 1- 1/32, 1/10 - 1/320
B Sau miễn 1 Độc tố 1- 1/32, 1/10 - 1/320
C Sau miễn 1 Nọc 1- 1/32, 1/10 - 1/320
Phản ứng thực hiện với gel agarose 1%, thời gian phản ứng từ 48 đến 60 giờ. Phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch Ponceau-S 0,2%.
4. Định lượng kháng thể bằng phương pháp quang hấp thụ A280 và phương pháp Bradford
4.1. Nguyên tắc
a. Phương pháp quang hấp thụ A280
Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 280nm, sự hấp thụ này có được chủ yếu là do các amino acid có nhân thơm như Phenylalanine, Tryptophan… Tuy nhiên, ứng với mỗi loại protein sẽ có một hệ số tắt E (extinction) tương ứng. Trong trường hợp protein là kháng thể IgG thì hệ số tắt là 1%,1 14
280 cm =
nm
E .
Như vậy, nếu giá trị A280 = 1,4 thì nồng độ IgG = 1mg/ml.
b. Phương pháp Bradford
Định lượng protein bằng phương pháp Bradford trở nên phổ biến do độ nhạy cao, rẻ tiền, ít tốn thời gian và chuyên biệt đối với protein. Đồng thời, phương pháp này ít bị ảnh hưởng bởi các hóa chất dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu protein như Amonium sulfate.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì bước sóng hấp thụ cực đại là 465nm, khi tạo phức với protein thì bước sóng hấp thụ cực đại là 595nm.
Để xác định được protein có trong mẫu quan tâm, việc xây dựng đường chuẩn là rất quan trọng. Việc xây dựng đường chuẩn này dựa trên protein chuẩn đã biết trước nồng độ, thường là Bovine plasma γ-globulin hay Bovine serum albumin.
∆OD = ODx - ODo
Trong đó: ODx là độ hấp thụ của mẫu protein.
ODo là độ hấp thụ của mẫu đối chứng (nước cất).
Như vậy, nồng độ protein trong mẫu cần khảo sát sẽ có được dựa trên đường chuẩn đã xây dựng. Với mẫu protein là IgG, giá trị nồng độ thực tế bằng hai lần giá trị có được từ đường chuẩn.
Trong trường hợp độ hấp thụ của mẫu vượt ra khỏi giới hạn của đường chuẩn thì phải tiến hành pha loãng (vượt giới hạn trên) hay cô đặc (vượt giới hạn dưới) mẫu.
4.2. Tiến hành
a. Phương pháp quang hấp thụ A280
Đo độ hấp thụ của dung dịch kháng thể IgG thu được bằng máy quang phổ ở bước sóng 280nm.
b. Phương pháp Bradford
• Dựng đường chuẩn Albumine huyết thanh bò (BSA)
Thí nghiệm được tiến hành với dung dịch BSA chuẩn ở các nồng độ 0, 2, 4, 8, 16, 32µg/µl.
• Chuẩn bị mẫu protein kháng thể
Pha loãng mẫu sao cho sự quan sát có được nằm trong giới hạn cho phép của đường chuẩn.
• Xử lý dữ liệu
Mẫu được đọc bằng máy ELISA (PR 2100). Dữ liệu nghiệm thu được xử lý bằng phần mềm kc4.
C. Giai đoạn III: Kiểm tra khả năng chống độc
của kháng thể thu được đối với nọc toàn phần
Khả năng trung hòa độc lực là làm mất tính gây độc của nọc. Các phân tử kháng thể bắt lấy thành phần gây độc là độc tố thần kinh alpha trong nọc và làm vô hiệu hóa chúng (như đã trình bày ở phần I). Do đó, con mồi sẽ được cứu sống.
a. Các thông số kỹ thuật
• Động vật: chuột nhắt trắng 18g.
• Đường tiêm: tĩnh mạch đuôi.
• Liều tiêm: 0,2ml/chuột.
• Số chuột mỗi lô: 3 con.
• Dung dịch nọc rắn và dung dịch kháng thể bảo quản ở 4oC.
b. Phản ứng trung hòa
• Chuẩn bị dung dịch nọc rắn
Dung dịch nọc rắn đã pha sẵn có nồng độ 0,61mg/ml (A280 = 0,61 với
10 1 %, 1 280 cm = nm
E ). Lấy một thể tích xác định dung dịch nọc này tương ứng với lượng 3LD50 (xem phần III) để thực hiện phản ứng trung hòa.
Chọn các độ pha loãng bậc hai liên tục của dung dịch kháng thể sao cho các độ pha loãng chứa hai nồng độ mà khả năng trung hòa vẫn gây chết 0% và 100% số chuột thử nghiệm.
• Phản ứng trung hòa giữa kháng thể kháng độc tố alpha với nọc toàn phần
Phản ứng thực hiện trong bể ổn nhiệt 37oC trong 30 phút. Hỗn hợp sau phản ứng được đem thử trên chuột bằng cách tiêm 0,2ml/chuột vào tĩnh mạch đuôi. Quan sát kết quả trong vòng 48 giờ kể từ lúc tiêm.
Đánh giá công hiệu bảo vệ của kháng thể thu được: Hiệu giá bảo vệ (LD50/ml) =
Trong đó:
T: số LD50 phản ứng.
D: độ pha loãng của dung dịch kháng thể gây 100% chuột sống. V: liều tiêm (ml).
T-1 DxV
Phần III
1. Kết quả thực nghiệm
Từ 702mg nọc khô toàn phần hòa trong 6ml dung dịch đệm Amonium acetate 0,05M pH7,2 và cho qua cột Sắc ký Sephadex G-50 SF (27x5,5cm). Với tốc độ đẩy của dung dịch đệm Amonium acetate 0,05M pH7,2 là 10ml/40 phút tức 0,25ml/phút, các thành phần trong nọc được phân giải thành nhiều phân đoạn như trình bày trong đồ thị 1: Kết quả sắc ký lọc Sephadex G- 50 SF 0 1 2 3 4 5 6 7 1 11 21 31 41 51 61 71 Đoạn 10 ml O D 280
Đồ thị 1: Sự phân giải của các thành phần trong nọc sau khi Sắc ký lọc.
Có 4 thành phần chính trong nọc toàn phần được thể hiện bằng 4 đỉnh trên
đồ thị 1, những phần còn lại là các peptide, acid amin… Sau đó, dùng kỹ thuật điện di trên thạch với nồng độ polyacrylamide tăng dần theo độ dốc cong từ 8%T đến 18%T để kiểm tra khả năng tinh chế protein của cột Sắc ký. Sau khi protein đã được xử lý với Sodium dodecylsulfate (SDS) và Dithiothreitol (DTT), các thành
Đỉnh 1
Đỉnh 2
Đỉnh 3 Đỉnh 4
phần trong nọc ban đầu được đối chiếu với các phân đoạn sau Sắc ký lọc. Hình 11
cho thấy kết quả sau điện di với các đoạn protein nhuộm bằng Coomassie-R250.
Giếng Mẫu Khối lượng (µg) 1 2 3 4 5 Nọc Đỉnh 1 Đỉnh 2 Đỉnh 3 Đỉnh 4 4 4 4 4 4 6 7 8 9 10 Đỉnh 4 Đỉnh 3 Đỉnh 2 Đỉnh 1 Nọc 2 2 2 2 2
Hình 11 : Kết quả điện di gradient 8%T->18%T có SDS.
Vì kết quả tương tự ở hai nhóm 1-5 và 6-10 nên chỉ cần xét nhóm 1-5 do nhóm này cho kết quả rõ ràng hơn. Kết quả điện di cho thấy, các mẫu protein ở giếng 2, 3 và 5 (theo thứ tự đỉnh 1, 2 và 4 trên đồ thị 1) đạt độ tinh khiết tương đối đáng tin cậy. Còn ở giếng 4 (tương ứng với đỉnh 3 trên đồ thị 1) xuất hiện hai cặp vạch nên không cho phép khẳng định là đã được tinh chế.
Sau khi đã phân đoạn các thành phần của nọc và đã đánh giá độ tinh chế, hoạt tính độc lực của các đỉnh (thành phần) đã được thử nghiệm trên chuột song song với nọc toàn phần. Bảng 5 dưới đây trình bày về lượng protein thu hồi sau Sắc ký lọc (đồ thị 1) cùng với hoạt tính gây độc trên chuột (18g) khi tiêm nọc và từng thành phần trong nọc qua đường tĩnh mạch (i.v) ở đuôi.
8%T
Bảng 5: Phần trăm thu hồi và độc lực của mỗi phân đoạn sau Sắc ký lọc so sánh với nọc toàn phần.
Mẫu Protein (%) Độc lực (LD50, µg, i.v/18g)
Nọc toàn phần 100 9,46 Đỉnh 1 14,1 >100 Đỉnh 2 13,6 57,9 Đỉnh 3 5,7 36,9 Đỉnh 4 28,8 3,01 Đỉnh (1+2+3+4) 62,2
Kết quả này nói lên rõ vai trò của thành phần 4 trong sự tham gia tính gây độc của nọc toàn phần:
• Về lượng: thành phần này chiếm hầu như 1/3 (28,8%) tổng lượng protein có trong nọc.
• Về độc lực: mạnh hơn hẳn gấp nhiều lần so với các thành phần có độc lực khác.
Bảng 6: So sánh độc lực của các thành phần 1, 2, 3 trong nọc và nọc toàn phần với thành phần 4.
Thành phần Độ yếu hơn về độc lực so với thành phần 4 (lần)
1 12,2 2 19,2 3 33,2 Nọc toàn phần 3,14
Những nhận xét trên đã gợi mở ý tưởng tạo huyết thanh chỉ chống lại thành phần tinh chế mang độc lực chủ yếu thay cho việc tạo huyết thanh kháng nhiều
thành phần của nọc. Huyết thanh đặc hiệu với thành phần 4 có một vai trò then chốt trong thử nghiệm giải độc trong nghiên cứu của Phòng Miễn dịch. Do đó, qui trình gây miễn nhiễm đã được thiết kế để tạo kháng thể có ái lực cao nhất đối với thành phần 4 (xem Phần II).
Huyết thanh thu hồi sau quá trình gây miễn nhiễm được tủa ở 50% bão hòa Amonium sulfate để tách kháng thể IgG và đồng thời cũng để bảo quản IgG ở dạng tủa giữ trong 4oC.
Những điều cần biết của IgG tạo nên là:
• Khả năng bắt thành phần 4 tinh chế và trong nọc toàn phần.
• Khả năng trung hòa độc lực của nọc toàn phần.
Những thử nghiệm nhằm có những thông tin về hai điểm trên cho kết quả như sau: IgG tủa đã được thẩm tích để loại Amonium sulfate và làm tan trong đệm PBS có nồng độ là 8,488mg/ml (theo phương pháp Bradford) và 11,2mg/ml (theo phương pháp quang hấp thụ A280, dùng 1%,1 14
280 cm =
nm
E ). Do đó, có thể lấy giá trị trung bình của hai phương pháp này là 9,844mg/ml làm giá trị nồng độ của dung dịch kháng thể IgG. Dung dịch IgG này dùng để:
• Thử phản ứng với kháng nguyên theo phương pháp Ouchterlony.
• Thử khả năng bảo vệ chuột nhiễm độc với nọc rắn Hổ mang chúa. Phản ứng của IgG tạo nên với kháng nguyên (thành phần 4) tinh chế và trong nọc toàn phần được thấy trên hình 12. Với nồng độ IgG là 9,844mg/ml, dung dịch kháng nguyên tinh chế cho đường tủa ở độ pha loãng từ 1 đến 1/40 tương ứng nồng độ từ 3,68mg/ml đến 0,092mg/ml và dung dịch nọc toàn phần cho đường tủa ở độ pha loãng từ 1 đến 1/4tương ứng nồng độ từ 6,1mg/ml đến 1,525mg/ml.
Hình 12: Kết quả phản ứng định tính Ouchterlony.
A (đối chứng): Phản ứng giữa huyết thanh trước miễn nhiễm với thành phần 4 tinh chế. Kết quả âm tính.
B: Phản ứng giữa kháng thể IgG sau miễn nhiễm với thành phần 4 tinh chế. Kết quả dương tính.
C: Phản ứng giữa kháng thể IgG sau miễn nhiễm với nọc toàn phần. Kết quả dương tính.
Thử nghiệm nhiễm độc chuột với nọc toàn phần và dùng dung dịch IgG nồng độ 9,488mg/ml để trung hòa độc lực cho thấy: 1ml dung dịch IgG này trung hòa được 20LD50 (LD50 nọc = 9,46µg, i.v/18g).
Kết quả trên chứng minh khả năng trung hòa của IgG tạo nên với thành phần 4 chống lại độc lực của nọc toàn phần.
2. Thảo luận
Theo y văn [13, 14, 15, 17, 19], trong nọc rắn có nhiều loại độc tố, ví dụ: các rắn thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae) có độc tố hậu khớp thần kinh (độc tố alpha), độc tố tim (độc tố gamma)… Do đó, kháng huyết thanh tạo nên cho mục đích điều trị nạn nhân nhiễm độc nọc rắn cho đến nay là chống nọc toàn phần (antivenom).
Những kết quả thử nghiệm với nọc rắn Hổ mang chúa như đã trình bày cho thấy vai trò của thành phần 4 với những đặc điểm: về lượng thì tỉ lệ trội hơn chiếm trong nọc (gần 1/3 nọc toàn phần) và về độc lực thì rất mạnh (như so sánh trong
bảng 6). Trong khi các thành phần khác hoặc không có độc lực (gần 37,8%) hoặc có độc lực rất nhẹ (thành phần 1 có LD50 > 100µg/chuột…). Do có nhiều độc tố trong nọc, một câu hỏi có thể đặt ra là: các độc tố trong nọc có “kết hợp” hoạt động để tạo nên độc lực không? Ý tưởng có sự kết hợp hoạt động để tăng độc lực biện luận cho sự cần thiết tạo huyết thanh kháng nọc toàn phần.
Do đáp ứng miễn nhiễm không cao, như vậy, trong các thành phần của nọc, có thành phần nào có thể ức chế đáp ứng miễn nhiễm?
Hơn nữa, huyết thanh kháng nọc tạo nên dùng trong điều trị thường hay gây phản ứng phản vệ, như vậy, trong các thành phần của nọc, thành phần nào tham gia, hoặc kháng thể đặc hiệu với thành phần nào có thể tham gia tạo phản ứng phản vệ?
Trong bối cảnh đó, một câu hỏi đơn giản hơn rất phù hợp để tổ chức thực nghiệm mang lại lời đáp là: dùng kháng thể tạo nên với thành phần 4 có bảo vệ
chống nọc độc toàn phần được không?
Để làm sáng tỏ những vấn đề trên, các thành phần của nọc rắn O. hannah đã được tách riêng biệt và thành phần quan trọng nhất đã được dùng để tạo kháng thể. Tất nhiên, qui trình miễn nhiễm đã được thiết kế nhằm tạo kháng thể có thể trung hòa độc lực có hiệu quả cao nhất đối với thành phần 4.
Dùng kháng thể đặc hiệu với thành phần 4 trong thử nghiệm trung hòa với độc lực của nọc toàn phần đã đem lại lời đáp khá rõ ràng. Kết quả này có những ý nghĩa sau:
• Về vai trò sinh học của nọc rắn: độc lực chủ yếu do một loại phân tưû đảm nhiệm. Cụ thể đối với O. hannah, thành phần 4 làm cho động vật nhiễm bị tê liệt và theo y văn [13, 15, 17, 22]đây là độc tố thần kinh alpha.
• Về triển vọng tạo huyết thanh điều trị nhiễm độc nọc rắn: tạo huyết thanh kháng độc tố có thể giải quyết các nhược điểm của huyết thanh kháng nọc toàn phần.
Phần IV
1. Kết luận
Qua thời gian tương đối ngắn làm đề tài tại Phòng Miễn dịch, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, với mục tiêu đề ra là tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha và đánh giá khả năng chống độc của kháng thể này đối với nọc toàn phần, đề tài đã đạt được các thành công chính như sau:
• Độc tố thần kinh alpha đã được phân tách và tinh chế bằng Sắc ký lọc Sephadex G-50 SF dùng làm kháng nguyên.
• Đã tạo được kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha khi gây miễn nhiễm thỏ.
• Kháng thể thu được có khả năng trung hòa được độc lực của nọc toàn phần: với 1ml dung dịch kháng thể IgG này ở nồng độ 9,488mg/ml trung hòa được 20LD50 nọc toàn phần trên chuột nhắt trắng 18g theo đường tiêm tĩnh mạch đuôi.
2. Đề nghị
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi không thể đạt được mục tiêu xa hơn là tạo huyết thanh chữa trị cho bệnh nhân bị rắn Hổ mang chúa cắn dựa trên qui trình tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha mà chúng tôi đã thiết lập được trên thỏ để đưa vào thực tiễn cuộc sống. Do đó, chúng tôi có những đề nghị như sau:
a. Tiếp tục công trình nghiên cứu này đến mục tiêu cuối cùng là sản xuất kháng huyết thanh cứu chữa nạn nhân bị rắn Hổ mang chúa cắn
một cách hiệu quả nhất. Đây được xem là công việc thiết thực cho công tác khoa học.
b. Áp dụng tương tự cho một số qui trình tạo huyết thanh chống nọc độc