Nhằm xác định được kháng nguyên mục tiêu, một xét nghiệm xác định độc lực gây chết được tiến hành đối với từng thành phần trong nọc sau Sắc ký lọc và so sánh với nọc toàn phần.
3.1. Nguyên tắc
Độc lực được biểu thị bằng giá trị LD50 (lethal dose 50%). LD50 là liều tối thiểu (của nọc hoặc độc tố) gây chết 50% số động vật thí nghiệm. Do đó, nọc hoặc độc tố càng độc thì giá trị LD50 càng thấp.
Động vật dùng thử nghiệm là thỏ hay chuột nhắt trắng nhưng chuột nhắt trắng thường được sử dụng nhiều hơn.
Nọc hoặc độc tố đưa vào cơ thể bằng đường tiêm như tiêm da, tiêm bắp, tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch hay tiêm màng não. Đường tiêm khác nhau cho kết quả LD50 khác nhau. Thông thường, liều gây chết khi tiêm tĩnh mạch < tiêm não < tiêm dưới da [4]. Tuy nhiên, cách tiêm tĩnh mạch đuôi (i.v) cho kết quả đồng nhất cao và được dùng trong các qui trình chuẩn.
Để kết quả thu được có độ lặp lại cao, các điều kiện tiến hành thí nghiệm phải được tuân thủ chặt chẽ. Trọng lượng và tuổi chuột phải ít dao động, sức khỏe chuột phải tốt, không mang mầm bệnh, cùng giới tính, cùng một dòng và không mang thai. Ngoài ra, đường tiêm và cách tiêm vào mỗi chuột phải như nhau, nhiệt độ môi trường ổn định và ấm trong quá trình thử nghiệm. Các loài động vật khác nhau nhạy cảm khác nhau, dù cùng một loài nhưng khác dòng thì sự đáp ứng với độc tố cũng khác nhau.
3.2. Tiến hành
a. Các thông số kỹ thuật
• Động vật: chuột nhắt trắng 18g hoàn toàn khỏe mạnh.
• Đường tiêm: tĩnh mạch đuôi (i.v).
• Liều tiêm: 0,2ml/chuột.
• Đơn vị tính: liều gây chết 50% động vật thí nghiệm được diễn tả bằng số µg nọc hay độc tố/chuột.
• Số chuột mỗi lô: 3 con.
b. Kỹ thuật tiến hành
• Pha dung dịch nọc
Cân 15mg nọc O.hannah (dạng tinh thể đông khô) pha trong 3ml đệm PBS được dung dịch 5mg/ml.
Pha dung dịch nọc rắn thử nghiệm 0,25mg/ml bằng đệm PBS. Tất cả dung dịch đệm đều được bổ sung dung dịch bảo quản NaN3 0,05%.
• Chuẩn bị dung dịch độc tố
Dung dịch độc tố bao gồm các dung dịch của các thành phần thu được sau Sắc ký lọc (xem phần III).
Lô đối chứng: mỗi chuột nhận 0,2ml nước muối sinh lý NaCl 0,9%.
Các lô thí nghiệm: chọn các nồng độ nọc và độc tố khác nhau sao cho trong đó có chứa nồng độ gây chết 0% và 100% số chuột thí nghiệm.
Đọc kết quả trong 48 giờ kể từ lúc tiêm.
Giá trị LD50 được tính theo phương pháp của Spearman_Karber như sau: n R d d X LD = + − ∑ i 2 log10 50 0 Trong đó:
X0: log10 của độ pha loãng tại đó gây ra 100% số chuột chết. d: log10 của tác nhân độ pha loãng.
Ri: số chuột chết trong mỗi lô. n: số chuột trong mỗi lô.
Thành phần nọc và độ độc tương ứng có thể thay đổi ở từng cá thể trong cùng một loài rắn, thậm chí thay đổi ở những thời điểm khác nhau trong suốt thời gian sống của một cá thể. Các thay đổi này có thể do nguồn gốc địa lý, chế độ ăn uống, tuổi rắn… đã ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp nọc độc.
Nhằm thực hiện tốt xét nghiệm này và để tạo một kháng huyết thanh có khả năng trung hòa độc tố thần kinh alpha trong nọc rắn Hổ mang chúa, nọc xét nghiệm phải đi từ hỗn hợp nọc của một số lớn rắn Hổ mang chúa khác nhau.