Những phương thức và kỉ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong phòng thí nghiệm

Những phương thức và kỉ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong phòng thí nghiệm

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP Họ và tên sinh viên: HOÀNG THỊ DUNG lớp K33C – Sinh, khóa 2007 – 2011 Họ và tên người hướng dẫn khoa học: TS.Lê Xuân Đắc Đơn vị công tác: Viện công nghệ sinh học Địa điểm thực tập: Viện công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt Hà Nội Thời gian thực tập: Từ 14/02/2011 đến 24/04/2011 Mục đích – mục tiêu thực tập - Các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Kỹ thuật nhân nhanh ngưu tất ống nghiệm Nội dung và kỹ cần đạt được đợt thực tập Nợi dung cần thực tập - Pha hóa chất, làm môi trường nuôi cấy ống nghiệm - Tạo đa trồi ngưu tất - Tạo hoàn chỉnh, trồng vườn ươm Các kỹ thuật cần đạt được thời gian thực tập Các kỹ thuật phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật (chuẩn bị làm môi trường, nuôi cấy ống nghiệm, trồng vườn ươm …) Các công việc đã thực hiện và kết quả thu được 3.1.Phương pháp pha hóa chất ni cấy mơ tế bào thực vật 31.1 Mục đích Giúp học sinh nắm vững phương pháp pha số hóa chất cần thiết sử dụng nuôi cấy mô tế bào tực vật như: MS, chất kích thích sinh trưởng… 3.1.2 Nguyên lý Hóa chât sau pha không kết tủa, không lắng cặn háo chất đượ pha thành dung dịch “stock” bảo quản tủ lạnh để sử dụng cho việc pha môi trường nuôi cấy 3.1.3 Dụng cụ hóa chất a) Dụng cụ: - Cốc thủy tinh có định mức, ống đong, đũa thủy tinh, phễu,lọ nút nhám - nước cất lần - Giấy lọc, giấy gián nhãn - Máy khuấy từ, bếp đun - Cân điện tử b) Hóa chất: - để pha môi trường bản nuôi cấy đều tan nước cất Cân lần lượt các loại hóa chất - Các loại hóa chất cần thiết để pha môi trường MS - Các chất kích thích sinh trưởng Các bước tiến hành 4.1 Chuẩn bị - Dụng cụ thủy tinh phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô Lọ dựng dung dịch phải được dán nhãn ghi tên hóa chất, nồng độ, ngày pha, người pha - Hóa chất: chuẩn bị theo danh sách, kiểm tra tên hóa chất, hãng sản xuất, hạn sử dụn 4.2 Pha môi trường bản MS Tất cả hóa chất óa chất cho vào cốc thủy tinh có định mức có định sẵn một lượng nước cất, khuấy tan hóa chất bằng máy khuấy từ, bổ sung nước cất đến thể tích cần thiết Lọc dung dịch bằng giấy lọc Đựng vào lọ có dán nhãn đầy đủ và bảo quản tủ lạnh Lượng hóa chất cần thiết cho 100ml stock được quy từ nồng độ chất đó cần cho một lít môi trường nuôi cấy và phụ thuộc vào cách ta sẽ lấy 1ml hay hoặc 10ml stock cho một lít môi trường nuôi cấy Ví dụ: lượng CaCl2.2H2O cần thiết cho một lít môi trường nuôi cấy là 44 - Nếu pha stock loại cần 10 ml cho lít môi trường nuôi cấy thì 10 ml dung dịch stock sẽ phải có 440 mg CaCl2.2H2O Trong 100 ml stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O - Nếu pha loại cần ml cho một lít môi trường nuôi cấy thì ml stock sẽ phải có 440 ml CaCl2.2H2O Trong 500 ml dung dịch stock sẽ phải có 44000 mg CaCl2.2H2O 4.3 Pha các chất kích thích sinh trưởng: Thường pha lượng ít (50 đến 100 ml một lần), vì các chất này ở dạng dung dịch khó bảo quản Các chất kích thích sinh trưởng BAP, NAA, 2,4 D… ta có thể pha với nồng độ từ 0,2 đến mg/ml Ví dụ: BAP là chất tan dung dịch NaOH 1N Muốn pha 100ml dung dịch BAP nồng độ mg/l ta cân 100 mg BAP, cho gọn vào đáy cốc thủy tinh nhỏ 100 ml, sau đó nhỏ giọt dung dịch NaOH 1N vào, chỉ cho vừa đủ để tan hoàn toàn tinh thể BAP (vì nếu ta cho nhiều NaOH sau này sẽ ảnh hưởng đến độ pH của môi trường nuôi cấy) Lắc cho tinh thể BAP tan hết, dung dịch suốt, sau đó định mức nước cất lần đến thể tích 100 ml Đựng vào lọ thủy tinh nút mài, dán nhãn, bảo quản tủ lạnh 40C Đối với những chất kích thích sinh trưởng hòa tan cồn, ta dùng cồn để làm tan hóa chất sau đó mới định mức nước cất đến thể tích cần thiết II Phương pháp pha môi trường nuôi cấy Mục đích Giúp học viên nắm được phương pháp pha môi trường và khử trùng.s Nguyên lý Tùy theo đối tượng và mục đích nuôi cấy, để pha các loại môi trường đặc hoặc lỏng với thành phần và nồng độ các chất phù hợp Môi trường sử dụng phổ biến hiện là môi trường MS (Murashige – Skoog), có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… tất cả các hóa chất đều phải hòa tan đều, không kết tủa Môi trường có bổ sung chất độn làm giá đỡ thì không quá rắn, không quá mềm để cấy mẫu vật dễ dàng Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur Dụng cụ và hóa chất a) Dụng cụ - Bình tan giác, pipet, ống đong, cốc thủy tinh có định mức… - Bông, giấy làm nút - Nước cất b) Hóa chất - Dung dịch MSI, MSII,MSIII, MSIV, MSV - Hoocmon kích thích sinh trưởng (2,4 –D, NAA, BAP….), saccharose, agra… Các bước tiến hành Xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng Ví dụ: MS + 3% saccarose ) + 0,8% agra + 2mg 2,4 –D Dùng ống đong để lấy các dung dịch MS 3 Định mức nước cất đến thể tích cần pha, bổ sung saccharose Đo pH (pH môi trường thường là 5,8) 5.Đun sôi, bổ sung agra, khuấy đều Bổ sung chất kích thích sinh trưởng Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình khoảng 50 ml) Làm nút bông, nút giấy Khử trùng ở nhiệt độ 119 – 1210C, áp suất 0,8 – 1,2 at III Tạo đa chôi ngưu tất mục đích - Nắm cách hức lựa chọn mẫu vật thao tác kyx thuật tạo chồi nhân giống vơ tính ngun lí - Kỹ thuật tạo cụm chồi nhân giống vơ tính sử ụng chất kích thích sinh trưởng (ktst) để thúc đảy hìh thàh quan phụ cấu trúc khác mà từ hồn chỉnh phát sinh Cây tạo thành qua phát triển chồi nách cay tạo đỉnh sinh trưởng - chất kich thich sinh trưởng sử dụng chủ yếu thuộc nhóm cytokinin, tườn BAP kinetin Dụng cụ hóa chất a) Dùng để khử trùng bề mặt mẫu vật - Hóa chất dụng cụ khử trùng bề mặt mẫu b)Môi trường nuôi cấy - Môi trường cấy gây nhân chồi tạo cụm chồi: MS bản+0,9% agar+3% sucrose+KTST+10% nước dừa - Môi trường khử trùng trước sử dụng c)Các bước tiến hành Khử trùng bề mặt mẫu vật nuôi cấy - Chọn phận có chứa chồi( Đỉnh sinh trưởng,chồi nách, mắt) làm nuyên liệu nuôi cấy - Khử trùng bề mặt mẫu vật 2.Cấy gây - Thấm khô mẫu vật dã khử trùng giấy thấm vô trùng - Nếu mẫu vật thuộc loại có chúa chồi cắt thành 0,5-2 cm tùy loại đặt lên môi trường nhân chồi Nếu mẫu vât hạt phơi đặt lên môi trường nhân chồi - Môi trường nhân chồi giai doạn cấy gây thường có nồng độ KTST tương đối thấp tùy đối tượng - Theo dõi ngày, cần cấy chuyển để loại bỏ mẫu vật bị nhiệm - Để đánh giá hiệu phương pháp khử trùng sử dụng cần ghi lại tỉ lệ: mẫu vật bị nhiễm/tông lượng mẫu mẫu vật sống sót/tổng ượng mẫu, kết hợ với quan sát hình thái mẫu vật để có kết luận xác - Để đánh giá hiệu môi trường cấy gây cần quan sát tuần phản ứng hình thái mẫu vật gồm: màu sắc mẫu vật, khả phát triển mẫu vật 2.Nhân nhanh tạo cum chồi - Sau tuần môi trường cấy gây,các chồi cắt bỏ đoạn chết chuyển sang môi trường nhân nhanh.Môi trường nhân nhanh thường có nồng độ BAP kinetin lớn môi trường cấy gây - Theo dõi sau tuần ghi lại chi số sau: + Độ tăng chiều dài cua chồi + Màu sắc, hình dạng chồi + Thời gian xuất iện cum chồi Số lượng chồi/cụm chồi + Cấy chuyển sau tuần 2.Tạo rễ - Các chồi dược khoảng 1-2cm tùy loại dược chuyển sang môi trương tạo rễ Các ụm chồi dược tách thành chồi riêng lẻ trước chuỷen - Theo dõi sau tuần Ghi lại số sau: + Thời gian xuất rễ + Số lượng trung bình rê/chồi + Chiều dài trung bình rễ - Cấy chuyển sau tuần tạo rễ hoàn chỉnh - Khi tạo rễ có hồn chỉnh dưa đất IV Phương pháp 1.Mục đích Tạo sau giai đoạn ni cấy invitro phatr triển bình thường để trồng ngồi điều kiện tự nhiên Tỷ lệ sống chuyển từ nuôi cấy ống nghiệm vườn ươm định hiệu kinh tế phương pháp nhân gống invitro Do quy trình đạt hiệu cao có ý nghĩa lớn 2.Ngun lý Cây ni cấy ong ống nghiệm sống điều kiện nuôi cấy tối ưu mặt môi trường vô trường vô trùng Khi đưa ống nghiệm,cây phải chịu tác động nhiều điều kiện bât lợi môi trường Trong điều iện in vitro non yếu, dễ bị chết điều kiện koong thuận lợi môi trường tự nhiên bị vi khuẩn,nấm mốc công gây thối rữa… Do để đạt tỉ lệ sống cao cay ta phai theo nhũng nguyên tắc sau: Trong thời gian dầu đưa phải bảo vệ cẩn thận, tránh cho khỏi chịu tác động điều kiện không thuận lợi từ phía ngoại cảnh Từng bướ co làm quen dần với điều kiện sống bên ống nghiệm, cưng cáp phát triển điều kiện tự nhiên 1)Dụng cụ hóa chất a) Dụng cụ - Khay cây, khay nhựa hay gỗ,kích thước vừa phải để dễ dàng di chuyển vị trí che đậy, độ sâu khoảng 10-15 cm khay nhựa phải có lỗ đáy để nước dễ dàng, khay gỗ có tính chất khung sau lót lưới nhựa cho có độ thơng thống tốt - Hộp nhựa để đựng dung dịch nuôi cấy môi trương lỏng - rét trời lạnh - Bình phun dể tưới - Panh, kéo, chậu nhưa, rổ nhựa… - Các dung dịch muối khống để pha lỗng tưới - Zinep, kháng sinh để phòng chống nhiễm mốc, nhiễm khuẩn 1.Chuẩn bị 3-4 tuần, chiếu sáng tốt để phát triển khỏe mạnh, cưng cáp Khi caayddax co rễ khỏe, xanh đẹp, thời kì sung sức đưa mơi trường tự nhiên Nếu để bình ánh sáng mặt trời vài ba ngày trước gắp khỏi bình 2.Đưa - Các bình mở nút, binh thạch ta phải cho nước vào ngâm 15-20 phút, sau lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp khỏi bình, cố gắng để nguyên vẹn, không bị - Ngâm chậu nước sau rửa vịi nước chảy cho dài, cắt ngắn bớt rễ rễ dài - bị giá thê phù hợp Cây có khả chịu nước tỉ lệ đất trộn vào giá thể nhiều, Giá thể đựng vào khay trồng với bề dày o 1.Trồng cây: Cây trồng vào khay với mật độ dày Sau trồng phun nước nhẹ nhàng cho chặt gốc 2.Chăm sóc mạ - Cây trồng dung dịch đỡ tơn cơng chăm sóc Những ngày đầu thả nước lã, 2-3 ngày sau dùng dung dịch MS pha loãng 1/10 để tạo điều kiện cho phát triển tốt Ta cần thay dung dịch tuần lần, để nơi có đủ ánh sáng, thống đãng kín gió Sau 2-3 tuần rễ mới, nhấc miếng xốp len thấy rễ trắng xóa đưa vườn ươm - Cây trồng khay đất phải chăm sóc mát cơng Trong 2-3 ngày đầu tưới nước lã cách phun sương 3h/lần Trời rét, khô hanh phải che nilon tránh rét tránh thóa nước nhanh Nilon che phải đục với số lỗ thủng cho thống khí Sau ngày bỏ nilon che, để khay cay nơi đủ ánh sáng, thống khí khơng gió, tránh nắng, mưa trực tiếp Tưới nước bình phu 2-3 lần ngày Sau tuần tưới dung dịch MS pha lỗng với tỉ lệ 1/10, ngày lần Sau 3-4 tuần sống, rễ mới, đưa vườn ươm Đánh giá kết Sau 3-4 tuần, sống rễ mới, t đánh giá kết bừng cách tính tỉ lệ số % số sống  ... chuyển từ nuôi cấy ống nghiệm vườn ươm định hiệu kinh tế phương pháp nhân gống invitro Do quy trình đạt hiệu cao có ý nghĩa lớn 2.Nguyên lý Cây nuôi cấy ong ống nghiệm sống điều kiện nuôi cấy tối... cho mô? ?t lít môi trường nuôi cấy và phụ thuộc vào cách ta sẽ lấy 1ml hay hoặc 10ml stock cho mô? ?t lít môi trường nuôi cấy Ví dụ: lượng CaCl2.2H2O cần thiết cho mô? ?t lít môi... Khử trùng bề mặt mẫu vật nuôi cấy - Chọn phận có chứa chồi( Đỉnh sinh trưởng,chồi nách, mắt) làm nuyên liệu nuôi cấy - Khử trùng bề mặt mẫu vật 2 .Cấy gây - Thấm khô mẫu vật dã khử trùng giấy