TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÀI TIỂU LUẬN Đề tài : “ Các dược liệu chứa saponin” Họ và tên: Vũ Thị Ngọc Bích Lớp: 58D Hà Nội, tháng 4 năm 2016 DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN 1. Định nghĩa 2. Cấu trúc hóa học 3. Kiểm nghiệm Saponin 4. Chiết xuất 5. Tác dụng, công dụng của Saponin 6. Sự phân bố trong thực vật Một số dược liệu chứa Saponin: Actiso, Bạch thược, Cam thảo, Cát cánh, Cỏ nhọ nồi, Dâm dương hoắc, Dứa bà, Dại, Hoa hòe, Hoàng kỳ, Kim ngân, Mạch môn, Ngưu tất, Nhâm sâm, Phục linh, Rau má, râu mèo, …. 1. Định nghĩa Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. Saponin có một số tính chất đặc biệt: Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch. Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng. Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3bhydroxysteroid khác. Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol. Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt. Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetat, bari hydroxyd, ammoni sulfat. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid. 2. Cấu trúc hóa học 2.1 Saponin triterpenoid Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen. Người ta chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic. 2.1.1. Saponin triterpenoid pentacyclic: loại này chia ra các nhóm: olean,ursan, lupan, hopan. a Nhóm olean (I) : Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3b hydroxy olean 12 ene, tức là bamyrin. Một vài aglycon làm ví dụ (công thức A): Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = CH3, R3 = COOH. Hederagenin: R2 = R4 = R5 = CH3 , R1 = CH2OH , R3 = COOH . Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = CH3 , R1 = CHO , R3 = COOH. Mạch đường có thể nối vào C3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 1011 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường. b Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C30 không đính vào vị trí C20 mà lại đính ở vị trí C19. Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3bhydroxy ursan 12ene, tức là aamyrin. Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean. Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canhkina, asiaticosid có trong rau má là những saponin của nhóm này. c Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 2029. Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis Linn.: aL arabinofuranosyl (14) bD glucoropyranosid (13)3bhydroxylup20(29) ene (IIIa). Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này. d Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C18 thay vì ở C17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L. 2.1.2. Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính: dammaran,lanostan, cucurbitan. a Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol. Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst. b Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này. Một nhóm phụ của nhóm lanostan là nhóm cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9b) lanostan. Các saponin abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dâyAbrus precatorius là những saponin thuộc nhóm này. c Nhóm cucurbitan (VII). Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9. 2.2. Saponin steroid: 2.2.1. Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin,smilagenin, tigogenin. Những chất này có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 2027 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi 1 carbon chung ở C22. Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal. Ba chất trên là 3 đồng phân. Smilagenin và tigogenin khác nhau do cấu hình ở C5. Còn sarsasapogenin và smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C25. Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S, smilagenin thì nhóm methyl ở C25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R. Các sapogenin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosid tim). Còn vòng A và B có thể là cis như ở chất sarsasapogenin và smilagenin hoặc có thể là trans như ở chất tigogenin. Công thức lập thể của 3 chấtsarsasapogenin Smilagenin và tigogenin. Nhóm OH ở C3 thường hướng b, một số hướng a ví dụ các saponin của tỳ giải. Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng nhất làdiosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave). Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C3, một số ít trường hợp ở C1. Mạch đường thường phân nhánh và phức tạp. Ví dụ digitonin là một saponosid có trong cây digital, có mạch đường gồm 5 đơn vị đường và phân nhánh: Xyl 1 3glc1 4gal digitogenin ¬2 | 1 glc1 3gal 2.2.2. Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi. Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C26 được nối với đường glucose. Nếu glucose ở C26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C26 sẽ chuyển thành parillin. Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 2225 epoxy ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ Lúa Poaceae) Avenacosid A cũng có 2 mạch đường . Khi thủy phân cắt đường glucose ở C26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Sarsaparillosid và avenacosid A đều có 2 mạch đường. Người ta gọi đây là các bidesmosid (desmos = mạch). 2.2.3. Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C3 đính nhóm NH2. Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum 2.2.4. Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C22 (khác với nhóm spirostan). Ví dụ solasonin có trong cây cà Úc (= cà lá xẻ ) Solanum laciniatum có cấu trúc (25R) 22a còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22b. 2.2.5. Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N. Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid. 2.2.6. Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin và oslandin được Jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây Polypodium vulgare L. Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt. aspinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) O. K.tze (Thea sinensis L.). 3. Kiểm nghiệm Saponin CÁC PHƯƠNG PHÁP ÐỂ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN: 3.1. Dựa trên tính chất tạo bọt: Ðây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 23 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Ðể yên, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. Có thể dựa vào chỉ số bọt để đánh giá một nguyên liệu chứa saponin: chỉ số bọt là sốml nước để hoà tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện qui định). Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,...,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Ðể yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt dưới 100. Nếu ống có cột bọt cao 1 cm nằm giữa gam, ví dụ ống số 4 chẳng hạn thì tính như sau: ống này có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột thì chỉ số là: 10x10,04=250 Nếu chỉ số bọt nằm trong ống số 1, 2 thì cần pha loãng để có chỉ số nằm giữa gam. 3.2. Dựa trên tính chất phá huyết: Ðây cũng là tính chất đặc trưng của saponin. Tuy nhiên cũng có một vài saponin không thể hiện rõ tính chất này. Khả năng phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho rằng tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức với cholesterol và các ester của nó trong màng hồng cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nhau nên người ta cho rằng phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết của saponin người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với một saponin. Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt, có thể dùng máu của súc vật có sừng khác, hoặc dùng máu thỏ thường dễ kiếm đối với các phòng thí nghiệm. Ðể đánh giá một nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa trên chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một thứ máu đã chọn (tiến hành trong điều kiện qui định). Cách tiến hành: Pha dung dịch đệm: Dung dịch mono kali phosphat 9,07 % 28ml Dung dịch dinatri phosphat 11,87 % 162ml NaCl tinh khiết 1,8 g Pha dung treo máu: Ðể làm cho máu không đông thì phải loại fibrin bằng cách lấy 300ml máu súc vật có sừng mới cắt tiết cho vào bình 1 lít có miệng rộng, dùng đũa quấy tròn đều hoặc cho vào bình một ít bi thủy tinh và lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua gạc để loại fibrin, để tủ lạnh có thể dùng được vài ngày. Từ máu đã loại fibrin này đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm. Có thể tiến hành chống đông máu và pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm bằng cách khác như sau: Lấy 4,5ml máu thỏ trộn với 0,5ml dung dịch 3,65% Natri citrat rồi thêm 220ml dung dịch đệm. Pha dung dịch saponin: Bột nguyên liệu đã rây qua rây 0,5 mm, cân chính xác 0,5 1 g, cho vào bình, thêm dung dịch đệm (50100ml) rồi đặt lên nồi cách thủy (9598oC) trong 30 phút. Lọc rồi pha đến thể tích chính xác. Thử sơ bộ: Pha các hỗn hợp theo bảng dưới đây: Ống (ml) I II III IV Dung dịch chiết dược liệu 0,10 0,20 0,50 1,00 Dung dịch đệm 0,90 0,80 0,50 Dung treo máu 2% 1,00 1,00 1,00 1,00 0,90 0,80 0,50 Lắc nhẹ ngay hỗn hợp (tránh tạo bọt). Sau 30 phút, lắc lại rồi để yên trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Quan sát các ống và xác định ống (hoặc các ống) có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, nghĩa là ống đỏ đều và trong, không có hồng cầu lắng đọng. Nếu chỉ có ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì cứ dùng dung dịch dược liệu ban đầu, nếu ống III và IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì dùng dung dịch đệm để pha loãng gấp đôi (1:1), nếu cả 3 ống II, III, IV thì pha loãng gấp 5 (1+4), nếu cả 4 ống đều trong suốt và đỏ thì pha loãng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1+9) và làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu. Nếu trường hợp ngược lại, nghĩa là cả 4 ống đều không có hiện tượng phá huyết hoàn toàn thì tiến hành thử sơ bộ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đặc hơn. Thí nghiệm quyết định: Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (còn gọi là ống phá huyết), đánh số thứ tự rồi cho vào mỗi ống lần lượt như sau: dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ nhất 0,05ml, ống thứ hai 0,10ml,..., dung dịch đệm theo thứ tư giảm dần: ống thứ nhất 0,95ml, ống thứ hai 0,90ml,..., dung treo máu 2% mỗi ống 1ml. Sau đó lắc khẽ ngay để trộn đều. Sau 30 phút lắc lại 1 lần nữa. Sau 24 giờ thì đọc kết quả: tìm ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn, tính độ pha loãng của nguyên liệu trong ống đó. Chính độ pha loãng của ống này là chỉ số phá huyết của nguyên liệu. Có thể đọc kết quả sớm hơn bằng cách ly tâm 10 phút (1500 vòngphút) sau khi đã để yên 2 giờ. 3.3. Dựa trên độ độc đối với cá: Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin nên người ta dùng các cây có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon). Ðể đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số cá cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá,... D Khả năng tạo phức với cholesterol: Những saponin triterpenoid tạo phức kém hơn loại steroid. Trong loại steroid thì digitonin kết hợp với cholesterol gần như hoàn toàn, do đó digitonin được dùng làm thuốc thử để định lượng cholesterol trong hoá sinh. 3.4. Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơxanh lá hay lơtím (phản ứng Salkowski). Saponin triterpenoid cho tác dụng với vanillin 1 % trong HCl và hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) sẽ có màu hoa cà. Saponin tác dụng với antimoin trichlorid trong dung dịch chloroform rồi soi dưới đèn phân tích tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang xanh còn saponin steroid thì vàng. Phản ứng LiebermannBurchardt cũng hay dùng để phân biệt 2 loại sapogenin: lấy vài miligram sapogenin hoà nóng vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơxanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía. 3.5. Sắc ký lớp mỏng: Chiết xuất và tinh chế sơ bộ saponin: đối với saponin trung tính và acid có thể tiến hành như sau: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo rồi chiết saponin bằng methanolnước (4:1). Loại methanol dưới áp suất giảm. Hoà cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với nbutanol. Tách lớp nbutanol, bốc hơi butanol dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để có dung dịch chấm sắc ký. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 1015 lần (có khi dùng aceton hoặc hexan thay ether). Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi đến khô trên nồi cách thủy. Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 80oC rồi kiềm hoá bằng ammoniac. Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký. Sau đây là một vài hệ dung môi dùng để khai triển trên các bản mỏng silicagelG. Saponin triterpenoid: a) Chloroformmethanolnước (65:35:10). b) Ethyl acetat acid acetic nước (8:2:1). c) n Butanol ethanol (10:2). Saponin nhóm spirostan: a) Chloroform methanol nước (65:35:10). b) Chloroform methanol (8:2). c) nButanol bão hoà nước. Saponin kiềm: a) Chloroform ethanol dd.ammoniac 1%nước (2:2:1). b) Ethanolpyridinnước (3:1:3). Cách hiện màu: Dựa vào tính phá huyết bằng cách tráng một lớp gelatinmáu (hoà tan 5 g gelatin trong 100ml dung dịch NaCl 9%o ở 600C, khi nguội đến 400C thì thêm máu bò đã loại fibrin) hoặc phun dung treo máu 2% đã loại fibrin lên bản mỏng. Các thuốc thử dùng cho các loại saponin và sapogenin nêu dưới đây sau khi phun cần phải sấy 10 phút ở 1100C rồi quan sát màu ở ánh sánh thường hoặc ánh sáng tử ngoại (365nm): thuốc thử CarrPrice (SbCl3 bão hoà trong chloroform), thuốc thử LiebermannBurchardt (1ml H2SO4 + 20ml anhydrid acetic + 50ml chloroform), thuốc thử Salkowski (dung dịch acid sulfuric 10%50% trong nước hoặc 5%10% trong ethanol), acid phosphomolybdic 10% trong ethanol, acid phosphotungstic 20% trong ethanol, dung dịch acid phosphoric 50% trong nước, vanillin sulfuric (vanillin 1% trong cồn tuyệt đối 100ml + acid sulfuric 2ml). Saponin nhóm spirostan còn có thể hiện màu bằng thuốc thử Sannié (dung dịch vanillin 1% trong cồn (a), anhydrid acetic + H2SO4 12:1 (b), phun dung dịch (a) rồi sấy 1200C trong 3 phút sau đó phun dung dịch (b), vết saponin có màu vàng. Ðối với nhóm spirostan và nhóm steroid alcaloid có thể dùng thuốc thử CarrPrice để phân biệt các dẫn chất có nối đôi và không có nối đôi ở vị trí C5. Các dẫn chất D5 có màu đỏ ở 200C và tím đỏ sau khi sấy 1050C. Cũng có thể phân biệt 2 loại dẫn chất trên bằng thuốc thử Marquis (0,2ml dung dịch formaldehyd 37% trong nước + 10ml H2SO4), chỉ có loại D5 cho phản ứng. Các saponin nhóm spirosolan và solanidan có thể phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÀI TIỂU LUẬN Đề tài : “ Các dược liệu chứa saponin” Họ tên: Vũ Thị Ngọc Bích Lớp: 58D Hà Nội, tháng năm 2016 DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN Định nghĩa Cấu trúc hóa học Kiểm nghiệm Saponin Chiết xuất Tác dụng, công dụng Saponin Sự phân bố thực vật Một số dược liệu chứa Saponin: Actiso, Bạch thược, Cam thảo, Cát cánh, Cỏ nhọ nồi, Dâm dương hoắc, Dứa bà, Dại, Hoa hịe, Hồng kỳ, Kim ngân, Mạch môn, Ngưu tất, Nhâm sâm, Phục linh, Rau má, râu mèo, … Định nghĩa Saponin gọi saponosid nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi thực vật Saponin có số động vật hải sâm, cá Saponin có số tính chất đặc biệt: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá tẩy - Làm vỡ hồng cầu nồng độ loãng - Ðộc với cá saponin làm tăng tính thấm biểu mô đường hô hấp nên làm chất điện giải cần thiết, ngồi có tác dụng diệt lồi thân mềm giun, sán, ốc sên - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, lỏng - Có thể tạo phức với cholesterol với chất 3-b-hydroxysteroid khác Saponin gọi saponosid chữ latin sapo = xà phịng (vì tạo bọt xà phịng), Tuy vài tính chất khơng thể vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid khơng có tính phá huyết tính tạo phức với cholesterol Saponin đa số có vị đắng trừ số glycyrrhizin có cam thảo bắc, abrusosid cam thảo dây, oslandin Polypodium vulgare có vị Saponin tan nước, alcol, tan aceton, ether, hexan người ta dùng dung mơi để tủa saponin Saponin bị tủa chì acetat, bari hydroxyd, ammoni sulfat Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất để tinh chế saponin trình chiết xuất Phần genin tức sapogenin dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh saponin Saponin triterpenoid có loại trung tính loại acid, saponin steroid có loại trung tính loại kiềm Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hố học chia ra: saponin triterpenoid saponin steroid 2 Cấu trúc hóa học 2.1 Saponin triterpenoid Phần genin loại có 30 carbon cấu tạo nhóm hemiterpen Người ta chia làm loại: Saponin triterpenoid pentacyclic saponin triterpenoid tetracyclic 2.1.1 Saponin triterpenoid pentacyclic: loại chia nhóm: olean*,ursan*, lupan*, hopan a - Nhóm olean (I) : Phần lớn saponin triterpenoid tự nhiên thuộc nhóm Phần aglycon thường có vịng thường dẫn chất 3-b hydroxy olean 12 - ene, tức b-amyrin Một vài aglycon làm ví dụ (cơng thức A): - Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH - Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH2OH , R3 = -COOH - Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CHO , R3 = -COOH Mạch đường nối vào C-3 theo dây nối acetal, có mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester Gần người ta phân lập saponin có đến 10-11 đơn vị đường kể mạch, riêng mạch đến đơn vị đường b - Nhóm ursan (II): Cấu trúc nhóm ursan tương tự nhóm olean khác nhóm methyl C30 khơng đính vào vị trí C-20 mà lại đính vị trí C-19 Các sapogenin nhóm ursan thường dẫn chất 3-bhydroxy ursan 12-ene, tức a-amyrin Những saponin nhóm gặp nhóm olean Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có canh-ki-na, asiaticosid có rau má saponin nhóm c - Nhóm lupan (III): Cấu trúc nhóm lupan có vịng A,B,C,D giống nhóm trên, khác vịng E vịng cạnh, C-20 ngồi vịng thường có nối đơi vị trí 20-29 Lấy ví dụ saponin có rễ Ơ rơ Acanthus iliciformis Linn.: [a-L - arabinofuranosyl (1-4) b-D glucoropyranosid (1-3)]-3-bhydroxy-lup-20(29) ene (IIIa) Một số saponin có ngũ gia bì chân chim thuộc nhóm d - Nhóm hopan (IV): Cấu trúc nhóm hopan có vịng A,B,C,D giống nhóm trên, khác vịng E vịng cạnh, C-22 ngồi vịng nhóm methyl góc đính C-18 thay C-17 Saponin biết chất mollugocin A có cỏ thảm Mollugo hirta L 2.1.2 Saponin triterpenoid tetracyclic: có nhóm chính: dammaran*,lanostan*, cucurbitan a - Nhóm dammaran (V): Ðại diện saponin nhân sâm Phần aglycon gồm vòng mạch nhánh Khi tác dụng acid mạch nhánh đóng vịng tạo thành vịng tetrahydropyran Bằng phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta thu genin thật Hai genin là: protopanaxadiol protopanaxatriol Phần đường nối vào OH cabon số có thêm mạch nối vào OH mạch nhánh Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran cịn gặp hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst b - Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, saponin có lồi hải sâm - Holothuria spp ví dụ nhóm Một nhóm phụ nhóm lanostan nhóm cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9b) lanostan Các saponin abrusosid A, B, C, D có cam thảo dâyAbrus precatorius saponin thuộc nhóm c/ Nhóm cucurbitan (VII) Phần lớn saponin nhóm cucurbitan gặp họ Cucurbitaceae Ở nhóm CH3 góc thay vị trí C10 lại đính C9 2.2 Saponin steroid: 2.2.1 Nhóm spirostan: Ta xét chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin,smilagenin, tigogenin Những chất có 27 carbon cholesterol, mạch nhánh từ C 20-27 tạo thành vịng có oxy (16,22 22,26 diepoxy), vòng hydrofuran (vòng E) vòng hydropyran (vòng F) Hai vòng nối với carbon chung C-22 Mạch nhánh gọi mạch nhánh spiroacetal Ba chất đồng phân Smilagenin tigogenin khác cấu hình C-5 Cịn sarsasapogenin smilagenin khác cấu hình C-25 Sarsasapogenin có nhóm methyl C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S, smilagenin nhóm methyl C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R Các sapogenin nhóm có nối vịng C D trans (khác với glycosid tim) Cịn vịng A B cis chất sarsasapogenin smilagenin trans chất tigogenin Công thức lập thể chấtsarsasapogenin Smilagenin tigogenin Nhóm OH C3 thường hướng b, số hướng a ví dụ saponin tỳ giải Nhóm spirostan ý nhiều nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp thuốc steroid Hai sapogenin quan trọng làdiosgenin (có chủ yếu lồi Dioscorea) hecogenin (có chủ yếu lồi Agave) Ở dạng glycosid phần đường nối vào OH C-3, số trường hợp C1 Mạch đường thường phân nhánh phức tạp Ví dụ digitonin saponosid có digital, có mạch đường gồm đơn vị đường phân nhánh: Xyl - 3glc-1 4gal digitogenin |1 glc-1 3gal 2.2.2 Nhóm furostan: Nhóm có cấu trúc tương tự nhóm spirostan khác vòng F bị biến đổi Trường hợp thứ nhất: vịng F mở nhóm alcol bậc C-26 nối với đường glucose Nếu glucose C-26 bị cắt (bởi enzym acid) xảy đóng vịng F thành vịng hydropyran chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan Ví dụ sarsaparillosid tác dụng enzym thủy phân cắt mạch glucose C-26 chuyển thành parillin Trường hợp thứ hai: vòng F vịng cạnh đóng vịng 22-25 epoxy ví dụ avenacosid có yến mạch (Avena L Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid A có mạch đường Khi thủy phân cắt đường glucose C-26 chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan Sarsaparillosid avenacosid A có mạch đường Người ta gọi bidesmosid (desmos = mạch) 2.2.3 Nhóm aminofurostan: Ở vịng F mở trường hợp sarsaparillosid nói vị trí C-3 đính nhóm NH2 Ví dụ jurubin, saponin có Solanum paniculatum 2.2.4 Nhóm spirosolan: Nhóm khác nhóm spirostan nguyên tử oxy vòng F thay NH Một điểm cần ý có isomer C-22 (khác với nhóm spirostan) Ví dụ solasonin có cà Úc (= cà xẻ ) Solanum laciniatum có cấu trúc (25R) 22a cịn tomatin saponin có cà chua có cấu trúc (25S) 22b 2.2.5 Nhóm solanidan: Solanin có mầm khoai tây thuộc nhóm Ở vịng E F chung 1C 1N Những chất thuộc nhóm aminofurostan, spirosolan solanidan có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên gọi chất glycoalcaloid 2.2.6 Ngồi nhóm saponin steroid kể người ta cịn gặp số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác ví dụ polypodosaponin oslandin Jizba phân lập 1971 từ thân rễ Polypodium vulgare L Oslandin bidesmosid có vị a-spinasterol glycosid có chè Camelia sinensis (L.) O K.tze (Thea sinensis L.) Kiểm nghiệm Saponin CÁC PHƯƠNG PHÁP ÐỂ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN: 3.1 Dựa tính chất tạo bọt: Ðây tính chất đặc trưng saponin phân tử saponin lớn có lúc đầu ưa nước đầu kỵ nước Người ta dựa tượng gây bọt môi trường kiềm acid để sơ phân biệt saponin steroid triterpenoid: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút Lấy ống nghiệm cỡ nhau, cho vào ống thứ 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13) Cho thêm vào ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết bịt ống nghiệm, lắc mạnh ống 15 giây Ðể yên, cột bọt ống cao ngang bền sơ xác định dược liệu có saponin triterpenoid Nếu ống kiềm có cột bọt cao ống sơ xác định saponin steroid Có thể dựa vào số bọt để đánh giá nguyên liệu chứa saponin: số bọt sốml nước để hoà tan saponin 1g nguyên liệu cho cột bọt cao 1cm sau lắc đọc (tiến hành điều kiện qui định) Cách tiến hành: cân 1g bột nguyên liệu (qua rây số 32), cho vào bình nón tích 500ml chứa sẵn 100ml nước sơi, giữ cho sôi nhẹ 30 phút, lọc, để nguội thêm nước cho 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm đường kính 16 mm, cho vào ống nghiệm 1,2,3, ,10ml nước sắc, thêm nước cất vào ống cho đủ ống 10ml Bịt miệng ống nghiệm lắc theo chiều dọc 15 giây, giây lần lắc Ðể yên 15 phút đo chiều cao cột bọt Nếu cột bọt ống thấp cm số bọt 100 Nếu ống có cột bọt cao cm nằm gam, ví dụ ống số chẳng hạn tính sau: ống có 4ml nước sắc 1% tương ứng với 0,04g bột số là: 10x1/0,04=250 Nếu số bọt nằm ống số 1, cần pha lỗng để có số nằm gam 3.2 Dựa tính chất phá huyết: Ðây tính chất đặc trưng saponin Tuy nhiên có vài saponin khơng thể rõ tính chất Khả phá huyết khác nhiều tùy loại saponin Người ta cho tính phá huyết có liên quan đến tạo phức với cholesterol ester màng hồng cầu lại thấy số phá huyết khả tạo phức với cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nên người ta cho phải xét đến ảnh hưởng saponin thành phần khác màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết saponin người ta thấy cấu trúc phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết phần đường có ảnh hưởng Hồng cầu động vật khác bị tác động khác saponin Hồng cầu cừu dễ bị phá huyết nên dùng tốt, dùng máu súc vật có sừng khác, dùng máu thỏ thường dễ kiếm phịng thí nghiệm Ðể đánh giá ngun liệu chứa saponin, người ta dựa số phá huyết số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có 1g nguyên liệu gây phá huyết hoàn toàn thứ máu chọn (tiến hành điều kiện qui định) Cách tiến hành: - Pha dung dịch đệm: Dung dịch mono kali phosphat 9,07 % 28ml Dung dịch dinatri phosphat 11,87 % 162ml NaCl tinh khiết 1,8 g - Pha dung treo máu: Ðể làm cho máu không đông phải loại fibrin cách lấy 300ml máu súc vật có sừng cắt tiết cho vào bình lít có miệng rộng, dùng đũa quấy trịn cho vào bình bi thủy tinh lắc tròn khoảng 10 phút, lọc qua gạc để loại fibrin, để tủ lạnh dùng vài ngày Từ máu loại fibrin đem pha thành dung treo máu 2% với dung dịch đệm Có thể tiến hành chống đông máu pha thành dung treo máu để làm thí nghiệm cách khác sau: Lấy 4,5ml máu thỏ trộn với 0,5ml dung dịch 3,65% Natri citrat thêm 220ml dung dịch đệm - Pha dung dịch saponin: Bột nguyên liệu rây qua rây 0,5 mm, cân xác 0,5 - g, cho vào bình, thêm dung dịch đệm (50100ml) đặt lên nồi cách thủy (95-98oC) 30 phút Lọc pha đến thể tích xác - Thử sơ bộ: Pha hỗn hợp theo bảng đây: Ống (ml) Dung dịch chiết dược liệu Dung dịch đệm Dung treo máu 2% , 0 , I 0,10 0,90 1,00 , II 0,20 0,80 1,00 III 0,50 0,50 1,00 IV 1,00 1,00 - Lắc nhẹ hỗn hợp (tránh tạo bọt) Sau 30 phút, lắc lại để yên nhiệt độ phòng Quan sát ống xác định ống (hoặc ống) có tượng phá huyết hồn tồn, nghĩa ống đỏ trong, khơng có hồng cầu lắng đọng Nếu có ống IV có tượng phá huyết hồn tồn dùng dung dịch dược liệu ban đầu, ống III IV có tượng phá huyết hồn tồn dùng dung dịch đệm để pha lỗng gấp đơi (1:1), ống II, III, IV pha lỗng gấp (1+4), ống suốt đỏ pha lỗng dịch chiết dược liệu gấp 10 lần (1+9) làm lại thí nghiệm sơ từ đầu Nếu trường hợp ngược lại, nghĩa ống khơng có tượng phá huyết hồn tồn tiến hành thử sơ lại với dung dịch nguyên liệu đậm đặc Thí nghiệm định: Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (còn gọi ống phá huyết), đánh số thứ tự cho vào ống sau: dung dịch chiết nguyên liệu theo thứ tự tăng dần: ống thứ 0,05ml, ống thứ hai 0,10ml, , dung dịch đệm theo thứ tư giảm dần: ống thứ 0,95ml, ống thứ hai 0,90ml, , dung treo máu 2% ống 1ml Sau lắc khẽ để trộn Sau 30 phút lắc lại lần Sau 24 đọc kết quả: tìm ống có tượng phá huyết hồn tồn, tính độ pha lỗng ngun liệu ống Chính độ pha lỗng ống số phá huyết nguyên liệu Có thể đọc kết sớm cách ly tâm 10 phút (1500 vòng/phút) sau để yên 3.3 Dựa độ độc cá: Cá động vật nhạy cảm với saponin nên người ta dùng có saponin để thuốc cá (đừng nhầm với rotenon) Ðể đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta dựa vào số cá Chỉ số cá phải tiến hành điều kiện quy định: môi trường, loại cá, D- Khả tạo phức với cholesterol: Những saponin triterpenoid tạo phức loại steroid Trong loại steroid digitonin kết hợp với cholesterol gần hồn tồn, digitonin dùng làm thuốc thử để định lượng cholesterol hoá sinh 3.4 Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hòa tan saponin cho màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơxanh hay lơ-tím (phản ứng Salkowski) - Saponin triterpenoid cho tác dụng với vanillin % HCl hơ nóng (phản ứng Rosenthaler) có màu hoa cà - Saponin tác dụng với antimoin trichlorid dung dịch chloroform soi đèn phân tích tử ngoại saponin triterpenoid có huỳnh quang xanh cịn saponin steroid vàng Phản ứng Liebermann-Burchardt hay dùng để phân biệt loại sapogenin: lấy vài miligram sapogenin hồ nóng vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm giọt H2SO4 đậm đặc, dẫn chất steroid có màu lơ-xanh lá, cịn dẫn chất triterpenoid có màu hồng đến tía 3.5 Sắc ký lớp mỏng: Chiết xuất tinh chế sơ saponin: saponin trung tính acid tiến hành sau: bột dược liệu chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo chiết saponin methanolnước (4:1) Loại methanol áp suất giảm Hoà cặn nước để có dung dịch 10% lắc với nbutanol Tách lớp n-butanol, bốc butanol áp suất giảm hoà cặn với methanol để có dung dịch chấm sắc ký Có thể tinh chế thêm cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có dùng aceton hexan thay ether) Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan solanidan chiết sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sơi nồi cách thủy Dịch lọc đem bốc đến khơ nồi cách thủy Cắn hồ tan acid acetic 5%, đun nóng đến 80oC kiềm hố ammoniac Tủa ly tâm hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký Sau vài hệ dung môi dùng để khai triển mỏng silicagel-G Saponin triterpenoid: a) Chloroform-methanol-nước (65:35:10) b) Ethyl acetat - acid acetic - nước (8:2:1) c) n Butanol - ethanol (10:2) Saponin nhóm spirostan: a) Chloroform - methanol - nước (65:35:10) b) Chloroform - methanol (8:2) c) n-Butanol bão hoà nước Saponin kiềm: a) Chloroform - ethanol -dd.ammoniac 1%/nước (2:2:1) b) Ethanol-pyridin-nước (3:1:3) Cách màu: Dựa vào tính phá huyết cách tráng lớp gelatin-máu (hồ tan g gelatin 100ml dung dịch NaCl 9%o 600C, nguội đến 400C thêm máu bị loại fibrin) phun dung treo máu 2% loại fibrin lên mỏng Các thuốc thử dùng cho loại saponin sapogenin nêu sau phun cần phải sấy 10 phút 1100C quan sát màu ánh sánh thường ánh sáng tử ngoại (365nm): thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hoà chloroform), thuốc thử Liebermann-Burchardt (1ml H2SO4 + 20ml anhydrid acetic + 50ml chloroform), thuốc thử Salkowski (dung dịch acid sulfuric 10%-50% nước 5%-10% ethanol), acid phosphomolybdic 10% ethanol, acid phosphotungstic 20% ethanol, dung dịch acid phosphoric 50% nước, vanillin sulfuric (vanillin 1% cồn tuyệt đối 100ml + acid sulfuric 2ml) Saponin nhóm spirostan cịn màu thuốc thử Sannié (dung dịch vanillin 1% cồn (a), anhydrid acetic + H2SO4 12:1 (b), phun dung dịch (a) sấy 1200C phút sau phun dung dịch (b), vết saponin có màu vàng Ðối với nhóm spirostan nhóm steroid alcaloid dùng thuốc thử Carr-Price để phân biệt dẫn chất có nối đơi khơng có nối đơi vị trí C-5 Các dẫn chất D5 có màu đỏ 200C tím đỏ sau sấy 1050C Cũng phân biệt loại dẫn chất thuốc thử Marquis (0,2ml dung dịch formaldehyd 37% nước + 10ml H2SO4), có loại D5 cho phản ứng Các saponin nhóm spirosolan solanidan phát thuốc thử Dragendorff 3.6 Ðịnh lượng: Phương pháp cân Chiết saponin cân Cách tiến hành chiết trình bày phần SKLM Có người ta thủy phân saponin, phần sapogenin tan nước lọc hồ tan dung mơi hữu đem bốc dung môi hữu cơ, sấy, cân Phương pháp đo quang Ðối với nhóm triterpenoid dùng thuốc thử vanillin-sulfuric Ví dụ định lượng acid glycyrrhetic cam thảo, phản ứng cho màu tím Ðối với nhóm spirostan, A Akahori dùng aldehyd có nhân thơm + acid phosphoric để định lượng: 50 mg sapogenin + 500 mg anis aldehyd ethanol 99%, đun 10 phút 1000C để yên đo mật độ quang 550 nm Các dẫn chất D5-sapogenin ví dụ diosgenin dùng thuốc thử FeCl3-H3PO4: 800mg FeCl3 10ml nước (a), lấy 1ml (a) thêm đủ 50ml với H3PO4 (b) 50 mg diosgenin + 50ml (b) làm lạnh phút nước đá, thêm 0,5ml H2SO4, làm lạnh 10 phút đặt tủ sấy nhiệt độ 700C phút Sau làm lạnh 10 phút để yên 60 phút đem đo 485 nm Phương pháp dùng định lượng riêng biệt sapogenin sau tách sắc ký giấy sắc ký lớp mỏng 3.7 Xác định quang phổ: Các sapogenin triterpenoid H2SO4 đậm đặc có đỉnh hấp thu cực đại vùng tử ngoại 310 nm Cực đại với saponin steroid Phổ hồng ngoại sapogenin steroid đặc biệt có pic đặc trưng mạch nhánh spiroacetal: pic thứ 850 - 857 cm-1 chất 25 S 860 - 866 cm-1 chất 25 R Pic thứ hai gần 900 (894-905), pic thứ ba gần 915 (915-923), pic thứ tư gần 980 (980-987) Ðể phân biệt sapogenin thuộc 25 R 25 S vào cường độ hấp thu pic thứ hai pic thứ ba: chất 25 R pic thứ hai có cường độ hấp thụ mạnh pic thứ ba; 25 S ngược lại Chiết xuất Có nhiều quy trình chiết xuất khác Ta tiến hành theo quy trình trình bày phần S.K.L.M Ðể tinh chế, thực với phương pháp sau: - Thẩm tích - Dùng bột Mg oxyd bột polyamid để tách saponin khỏi tanin: saponin hoà vào nước trộn với bột polyamid bột Mg oxyd nồi cách thủy 10 phút để có khối nhão Sau chiết saponin từ khối nhão ethanol 80% nóng Lọc bốc - Dùng Sephadex G-25,G-50,G-75: Lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc ký Dung dịch đậm đặc saponin nước cho lên phần cột khai triển nước cất Saponin có phân tử lớn khỏi cột trước saponin có phân tử nhỏ Bằng cách acyl hố alkyl hố nhóm OH phân tử loại Sephadex nói trên, người ta chế loại Sephadex vừa có tính thân nước vừa có tính thân dung mơi hữu Ví dụ từ Sephadex G-25 cách alkyl hoá người ta thu Sephadex LH-20 có khả hút nước, alcol chloroform Loại dùng để tách saponin hiệu - Ðể tinh chế saponin steroid dùng phương pháp kết hợp với cholesterol: g saponin hồ 200ml ethanol đun nóng đến 50-600C cho tác dụng với dung dịch chứa g cholesterol 200ml ethanol đun nóng, tủa phức tạo thành Sau nguội đem lọc tủa sấy khơ Phá phức cách hồ tan pyridin Saponin tinh khiết tủa ether Ðể loại hết cholesterol, tủa hoà tan methanol lại tủa với ether - Ðể tinh chế dẫn chất nhóm glycoalcaloid, ta hồ tan chúng vào n-butanol cho lên cột chứa nhôm oxyd, đẩy nước bão hồ n-butanol Tác dụng, cơng dụng - Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Saponin hoạt chất dược liệu chữa ho viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên mơn, mạch mơn - Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch mơn, - Saponin có mặt số vị thuốc bổ nhân sâm, tam thất số thuộc họ nhân sâm khác - Saponin làm tăng thấm tế bào; có mặt saponin làm cho hoạt chất khác dễ hoà tan hấp thu, ví dụ trường hợp digitonin Digital - Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus - Một số có tác dụng chống ung thư thực nghiệm - Nhiều saponin có tác dụng diệt loài thân mềm (nhuyễn thể) - Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp thuốc steroid - Digitonin dùng để định lượng cholesterol - Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len dạ, tơ lụa Sự phân bố thực vật Saponin steroid thường gặp mầm Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae Ðáng ý số loài thuộc chi Dioscorea L.; Agave L.; Yucca L Saponin triterpenoid thường gặp mầm thuộc họ như: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyll-aceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae Trong saponin thường tích lũy phận khác nhau: tích lũy bồ kết, bồ hịn; rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; dứa Mỹ ...DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN Định nghĩa Cấu trúc hóa học Kiểm nghiệm Saponin Chiết xuất Tác dụng, công dụng Saponin Sự phân bố thực vật Một số dược liệu chứa Saponin: Actiso, Bạch... (Thea sinensis L.) Kiểm nghiệm Saponin CÁC PHƯƠNG PHÁP ÐỂ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN: 3.1 Dựa tính chất tạo bọt: Ðây tính chất đặc trưng saponin phân tử saponin lớn có lúc đầu ưa nước... định dược liệu có saponin triterpenoid Nếu ống kiềm có cột bọt cao ống sơ xác định saponin steroid Có thể dựa vào số bọt để đánh giá nguyên liệu chứa saponin: số bọt sốml nước để hoà tan saponin