XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN ABCC8 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG INSULIN

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ LÊ THỊ NGỌC VÂN XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ABCC8 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG INSULIN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khóa 2012 - 2016 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Trần Vân Khánh HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, em nhận hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình thầy, cơ, gia đình bạn bè Trước hết, với tất lòng trân trọng, em xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới PGS TS BS Trần Vân Khánh- Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y học, Phó giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, người hết lịng dạy bảo, tận tình hướng dẫn em bước đường học tập nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn- Phó hiệu trưởng Trường Đại Học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu GenProtein, PGS TS Nguyễn Thị Hà- Cố vấn khoa học Trung tâm GenProtein, người thầy người cô giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập, tạo thuận lợi cho em q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại học Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực khóa luận Em xin cảm ơn CN Lê Hồng Bích Nga- Bộ mơn Hóa sinh lâm sàng, Khoa Kỹ thuật Y học, anh chị cán bộ, anh chị Nghiên cứu viên Trung tâm Gen- Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em thực hồn thành khóa luận Xin cảm ơn bạn động viên, ủng hộ trình trình học tập Cuối cùng, thực biết ơn bố mẹ, người thân u gia đình ln tạo điều kiện tinh thần vật chất để vượt qua khó khăn học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại Học Y Hà Nội Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Lê Thị Ngọc Vân LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo đại học- Trường Đại học Y Hà Nội Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein - Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cam đoan thực q trình làm luận văn cách trung thực Các kết số liệu luận văn có thật chưa công bố tài liệu nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Người thực Lê Thị Ngọc Vân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADP ATP A bp C ddNTP DNA EDTA G KATP kb Kir6.2 NST PCI PCR PET SUR1 TBE TE Tm T Adenosine diphosphate Adenosine triphosphate Adenine base pair (cặp base) Ctytosine Deoxyribonucleotid triphosphate Deoxyribonucleic acid Ethylen diamin tetraacetic acid Guanin ATP- sensitive K+ channels (Kênh kali phụ thuộc ATP) Kilo base K+ inward- rectifier 6.2 Nhiễm sắc thể Phenol Chloroform Isoamyl Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại gen) Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp phát xạ positron) Sulfonylurea receptor (thụ thể sulfonylurea 1) Tris acetate EDTA Tris EDTA Nhiệt độ gắn mồi Thymine MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ Cường insulin bẩm sinh bệnh gây hạ đường huyết nặng kéo dài trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Bệnh có tỷ lệ mắc chung cộng đồng khác từ 1/40.000-1/50.000, chiếm tới 1/2.500 cộng đồng có truyền thống kết hôn huyết thống [1] Ở Việt Nam, cường insulin bẩm sinh bệnh cảnh thường gặp cấp cứu hồi sức, giai đoạn từ 1/1/2009-15/4/2012 có tới 27 trường hợp [2] Đây bệnh lý cấp cứu, việc chẩn đoán sớm điều trị kịp thời vô quan trọng nhằm hạn chế tổn thương não di chứng thần kinh Ở giai đoạn sơ sinh, bệnh hạ đường huyết cường insulin gây thương tổn não nặng, biểu hôn mê trạng thái co giật Ở trẻ lớn, hạ đường máu thường trầm trọng gây thương tổn não Bên cạnh di chứng chậm phát triển vận động tinh thần, động kinh, bại não gặp, đặc biệt trẻ biểu sớm sau sinh chẩn đốn muộn Chẩn đốn cường insulin bẩm sinh ngồi dựa vào biểu lâm sàng xét nghiệm đường huyết thấp, nồng độ insulin máu cao, cần xét nghiệm phân tích gen để phát đột biến, từ có định điều trị nội khoa hay phẫu thuật cắt tụy Các đột biến gen ABCC8 KCNJ11 xác định nguyên nhân phổ biến bệnh Những đột biến xác định 85% bệnh nhân trải qua phẫu thuật tụy [2] Nguyên nhân phổ biến nặng cường insulin bẩm sinh đột biến lặn bất hoạt kênh K-ATP màng tế bào beta tiểu đảo tụy Ngày nhờ phát triển công nghệ, đặc biệt sinh học phân tử đóng vai trị quan trọng giúp cho chẩn đoán đột biến gen gây bệnh dễ dàng xác, từ chẩn đốn sớm định hướng điều trị kịp thời Việc ứng dụng rộng rãi tiến lĩnh vực vào y học mang tới bước tiến giúp chẩn đốn xác hơn, bệnh liên quan đến vật liệu di truyền Kỹ thuật PCR giải trình tự gen hai kỹ thuật sử dụng phổ biến để xác định đột biến gen ABCC8 gây bệnh cường insulin Ở Việt Nam, bệnh cường insulin bẩm sinh chủ yếu nghiên cứu đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng, nhiên chưa có nhiều nghiên cứu phát đột biến gen ABCC8 Trong nghiên cứu nhóm đối tượng tập trung khuếch đại xác định đột biến exon 5, 6, 27, 28 exon nằm vùng hotpot theo nghiên cứu giới Trên sở đó, đề tài: “Xác định đột biến gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin” thực với mục tiêu: “Xây dựng quy trình xác định đột biến exon 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh cường insulin bẩm sinh 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh cường insulin bẩm sinh Hạ đường huyết kéo dài nhũ nhi, cịn có tên gọi khác cường insulin bẩm sinh, cường insulin gia đình sản tế bào đảo tụy nguyên 10 phát (nesidioblastosis) Đây nguyên nhân hay gặp gây hạ đường huyết kéo dài trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Bệnh đặc trưng tiết insulin khơng thích hợp khơng kiểm sốt tế bào beta tuyến tụy, tiết insulin khơng cịn quy định mức độ đường máu bình thường, biểu tăng tiết insulin mức từ tiểu đảo tụy Langerhans gây hạ đường huyết nặng kéo dài Bệnh nhân hạ đường huyết cường insulin phải chẩn đoán kịp thời điều trị sớm để ngăn chặn co giật di chứng thần kinh Hạ đường huyết kéo dài nồng độ khơng thích hợp cao insulin lưu hành phát chẩn đoán Hàm lượng acid béo tự (FFAs) ketones (Beta- hydroxybutyrate, acetoacetate) thấp [3],[27] Sinh lý bệnh: Bình thường nồng độ insulin glucose máu tỷ lệ với nhau, glucose máu tăng insulin máu tăng ngược lại Trong bệnh cường insulin bẩm sinh có rối loạn cân động glucose máu insulin máu, gia tăng chế tiết insulin mức cân với glucose làm đứa trẻ bị hạ đường huyết trầm trọng, kéo dài gây hệ lụy sau này, chí gây tử vong nhanh chóng [4] Giải phẫu bệnh lý: Trong bệnh cường insulin bẩm sinh, bất thường cấu trúc mô học tuyến tụy khơng đồng phân thành dạng sau đây: Quá sản u chỗ tế bào đảo Langerhans chiếm 30-40% trường hợp cường insulin bẩm sinh (Nesidioblastosis) Cường chức tế bào beta lan tỏa chiếm 60-70% trường hợp [5],[6] Ngoài ra, nghiên cứu gần cịn phát thấy dạng khơng điển hình đặc trưng đảo Langerhans dạng khảm Về di truyền học: Người ta thấy có đột biến tiểu đơn vị kênh K-ATP “nhạy cảm” tế bào beta, kênh giữ vai trò quan trọng việc điều phối chế tiết insulin đột biến xảy tiểu đơn vị 36 Hình 3.2 Hình ản kết điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% Trong đó: HI01, HI02, HI03 DNA mẫu bệnh nhân Nhận xét: Các mẫu DNA tách chiết tốt, không bị đứt gãy đáp ứng yêu cầu làm kỹ thuật PCR 3.2 Kết khuếch đại gen (PCR) Mẫu DNA sau tách chiết thực phản ứng PCR khuếch đại exon: 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 sử dụng cặp mồi đặc hiệu Sau khuếch đại, sản phẩm PCR kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,5%, ta thu hình ảnh sau: exon MK (+) (-) HI01 HI02 418bp 500bp exon (+) (-) HI01 HI02 370bp 37 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon exon gen ABCC8 Trong đó: MK: marker 100bp (-) đối chứng âm: khơng có DNA (+) đối chứng dương: sản phẩm PCR người bình thường HI01, HI02: sản phẩm PCR bệnh nhân exon 27 MK (+) (-) HI01 HI02 exon 28 (+) (-) HI01 HI02 304bp 324bp 500bp Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 27 exon 28 gen ABCC8 Trong đó: MK: marker 100bp (-) Đối chứng âm: khơng có DNA (+) Đối chứng dương: sản phẩm PCR người bình thường HI01, HI02: sản phẩm PCR bệnh nhân Nhận xét: 38 - Sản phẩm PCR mẫu cho băng sáng nhất, rõ nét, có kích thước phù hợp với kích thước đoạn gen cần khuếch đại sau so thang DNA chuẩn, không xuất băng phụ - Marker phân tách rõ ràng cho phép nhận định kết xác - Phản ứng PCR đạt hiệu quả, sản phẩm PCR thu đặc hiệu, đạt yêu cầu cho kỹ thuật giải trình tự 3.3 Kết giải trình tự gen Hiện giới labo sinh học phân tử Việt Nam áp dụng phổ biến phương pháp xác định trình tự DNA theo phương pháp tổng hợp Sanger cải biến với sinh phẩm xác định trình tự hãng ABI Cơng việc tiến hành qua ba bước chu trình nhiệt phản ứng PCR bao gồm: biến tính, mồi bám tổng hợp sợi đơn nucleotid Thành phần phản ứng giải trình tự chương trình nhiệt tiến hành theo dẫn nhà sản xuất Trong nghiên cứu chúng tơi, chúng tơi tiến hành giải trình tự exon: 5, 6, 27, 28 nhằm xác định đột biến gen ABCC8 gây bệnh cường insulin bẩm sinh Để so sánh kết với kết nghiên cứu gen ABCC8 tiến hành giới, truy cập vào ngân hàng gen địa chỉ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Trong mẫu bệnh nhân xác định bệnh nhân có đột biến Sau kết giải trình tự phát đột biến bệnh nhân mã số labo HI02: g.83201 C>G (Dị hợp tử) 39 GenBank Mẫu HI02 Hình 3.5 Kết giải trình tự gen với đột biến g.83201 C>G Nhận xét: Hình 3.6 hình ảnh minh họa trường hợp bệnh nhân mã số HI02 có đột biến (g.83201 C>G) intron 27 Kết cho thấy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử C thay thành G Tuy nhiên đột biến nằm intron 27 vùng không mã hóa gen nên khơng dẫn đến thay đổi ba mã hóa axit amin ảnh hưởng đến cắt nối exon Bảng 3.2 Kết xác định đột biến gen exon: 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 mẫu bệnh nhân cường insulin Mã bệnh nhân HI01 HI02 HI03 Kết Không đột biến g.83201 C>G (Dị hợp tử) (Intron 27) Không đột biến Gen ABCC8 gồm 39 exon Tuy nhiên, nghiên cứu nhóm nghiên cứu tập trung khuếch đại xác định đột biến exon: 5, 6, 27, 28 vùng hotpot theo nghiên cứu giới Đây sở, tiền đề để tiếp tục xác định đột biến exon lại với cỡ mẫu lớn 40 41 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Kỹ thuật tách chiết DNA Ngày kỹ thuật y sinh học phân tử có vai trị to lớn việc chẩn đốn bệnh mức độ phân tử giúp chẩn đốn sớm xác bệnh lý di truyền Trong nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực giai đoạn tách chiết DNA (hoặc RNA) khâu đầu tiên, quan trọng Phân tử DNA tách chiết phải đảm bảo đủ nồng độ, có độ tinh cao, không đứt gãy, không bị tạp nhiễm đủ điều kiện cho phản ứng đạt hiệu suất độ xác cao Trong nghiên cứu này, tiến hành phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol để tách chiết phân tử DNA bệnh nhân cường insulin Tất mẫu DNA bệnh nhân sau tách chiết xác định nồng độ kiểm tra độ tinh cách đo mật độ quang máy Nanodrop 1000 bước sóng 260nm (A260) 280nm (A280) Nguyên tắc phương pháp dựa hấp thụ ánh sáng đặc trưng chất bước sóng xác định DNA hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 260nm có mặt nhân base purin pyrimidine cấu trúc- loại đơn phân cấu tạo nên DNA Trong đó, protein hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 280nm có mặt acid amin nhân thơm dị vòng (tyrosin, tryptophan, phần nhỏ nhờ phenylalanine) Giá trị mật độ quang cho phép xác định nồng độ DNA mẫu nghiên cứu tỷ lệ A 260nm/A280nm cho phép đánh giá độ tinh DNA Sản phẩm DNA tách chiết đạt u cầu mẫu có nồng độ ≥50ng/µl độ tinh (A260/A280) đạt từ 1,8-2,0, mẫu sử dụng để tiến hành bước nghiên cứu Những mẫu không đạt điều kiện cần phải tiến hành tách chiết lại 42 Bảng 3.1 cho thấy tất DNA sau tách chiết đối tượng nghiên cứu đạt yêu cầu để tiến hành kỹ thuật PCR giải trình tự gen Để khẳng định kết tách chiết lần nữa, tiến hành chạy điện di mẫu DNA gel agarose 0,8% Hình ảnh điện di cho thấy DNA khơng bị đứt gãy, đảm bảo độ nguyên vẹn đạt đủ nồng độ mong muốn, tất mẫu DNA đem điện di lên băng sáng sau nhuộm Ethidium bromide chụp hình (Hình 3.2) 4.2 Kỹ thuật khuếch đại gen(PCR) Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại exon: 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin Sau khuếch đại, sản phẩm PCR kiểm tra độ nguyên vẹn, độ tinh độ đặc hiệu phương pháp điện di gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide soi tia tử ngoại Tỉ lệ agarose có gel định kích thước đoạn gen đích Trong trường hợp dựa kích thước đoạn gen đích là: 418bp, 370bp, 304bp, 324bp tương ứng với exon: 5, 6, 27, 28 thấy tỉ lệ agarose 1,5% thích hợp kết điện di tốt Kết điện di sản phẩm PCR (Hình 3.3) cho thấy có băng điện di sáng, phân tách rõ ràng, gọn, rõ nét, xuất mẫu vị trí đoạn gen đặc hiệu, khơng có vạch mồi thừa băng phụ Vị trí DNA mẫu bệnh nhân so sánh với Marker để đánh giá độ đặc hiệu Điều chứng tỏ nghiên cứu cặp mồi thiết kế tốt, hoạt động hiệu quả, chu trình nhiệt điều kiện khác tối ưu, phản ứng PCR thực thành cơng Trong phản ứng PCR có vấn đề đáng ý việc tạo sản phẩm phụ không mong muốn Nếu sản phẩm phụ xuất nhiều sản phẩm PCR ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR Bên cạnh đó, hình ảnh điện di chúng ảnh hưởng nhiều đến việc quan sát hình ảnh điện di gen mà ta cần khuếch đại Do đó, việc giảm 43 tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn điều cần thiết phản ứng PCR Kết PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chất lượng nồng độ DNA mẫu, nồng độ thiết kề mồi, nồng độ ion Mg2+, nồng độ dNTP, Taq DNA polymerase, hệ thống đệm, chu trình nhiệt Các yếu tố trước tiên ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR nồng độ độ tinh DNA mẫu, chu trình nhiệt thiết kế mồi Nhiệt độ biến tính DNA khn dao động từ 90-98ºC Nếu nhiệt độ cao kéo dài làm giảm số lượng chất lượng Taq polymerase thời gian bán hủy Taq polymerase khơng dài: 2giờ/92,5ºC, 40 phút/95ºC, phút/97,5ºC Nhiệt độ thời gian gắn mồi đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu độ đặc hiệu sản phẩm PCR Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base- trình tự nucleotid, kích thước nồng độ mồi Sau thử nghiệm, nhận thấy với nhiệt độ gắn mồi 55ºC cho kết tốt Tất mẫu khuếch đại máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính 95ºC phút, sau thực 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 95ºC 30 giây, gắn mồi 55ºC 30 giây, kéo dài 72ºC 30 giâyvà tiếp tục kéo dài 72ºC phút nữa, cuối giữ 15ºC Chu trình nhiệt chứng minh hiệu cao tất mẫu khuếch đại Mồi tiêu quan trọng để đạt khuếch đại đặc trưng có hiệu cao Trình tự mồi chọn cho khơng có bắt cặp bổ sung mồi xi mồi ngược khơng có cấu trúc kẹp tóc bắt cặp bổ sung phần khác mồi, Tm mồi xuôi mồi ngược không cách biệt nhau, thành phần nucleotide mồi phải cân tránh lặp lại nhiều lần cặp GC, mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại gen, trình tự nằm mồi xuôi ngược không lớn Kích thước mồi từ 44 16-30bp phù hợp, độ dài đủ dài để đặc trưng đầy đủ cho đoạn bắt cặp đủ ngắn mồi gắn cách dễ dàng vào đoạn gen Đối với DNA mẫu, phản ứng PCR tối ưu DNA thật tinh sạch, không tạp nhiễm, không đứt gãy Enzym DNA polymerase đóng vai trị quan trọng phản ứng PCR Hiện nay, enzym Taq polymerase thường sản xuất kèm theo hệ thống đệm với pH thích hợp, chứa Mg2+ dNTP với nồng độ phù hợp Trong trình tổng hợp DNA, enzym DNA polymerase lựa chọn nucleotid phù hợp để kéo dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp chuỗi DNA theo chiều 5’-3’ Ngoài ra, số DNA polymerase có hoạt tính enzym exonuclease xúc tác theo chiều 3’- 5’ gọi hoạt tính enzym sửa chữa Enzym có khả kiểm tra lại độ xác tất nucleotid gắn vào trình kéo dài đoạn DNA mồi Nếu có nucleotid gắn khơng theo ngun tắc bổ sung với sợi DNA khuôn, enzym xúc tác cắt bỏ nucleotid sai sót thay vào nucleotid khác theo nguyên tắc đối mã Độ xác hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào việc chọn enzym DNA polymerase cho phản ứng Bốn loại nucleotide (dNTP) thường sử dụng nồng độ 20200µM/ nucleotid Sự cân thành phần nucleotide làm tăng lỗi chép Taq polymerase MgCl2 dung dịch đệm thành phần quan trọng PCR nồng độ chất ảnh hưởng đến đặc hiệu hiệu suất phản ứng Taq DNA polymerase phụ thuộc vào nồng độ Mg 2+ thường có hoạt độ tối ưu nồng độ 1,2-1,3 mM Mg 2+ tự Dung dịch đệm chuẩn chứa 1.5mM MgCl2 Tuy nhiên, nồng độ Mg2+ tự bị ảnh hưởng nồng độ dNTP có q trình liên kết cân phân tử lượng giữ dNTP Mg2+ Không nên giảm nồng độ dNTP 200µM sử dụng 45 enzym polymerase có khả sửa chữa hoạt tính exonuclease 3’-5’ thúc đẩy q trình thối hóa chuỗi DNA đơn đoạn DNA mồi Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAse, enzym hạn chế… tức không chứa thành phần tạp nhiễm Các yếu tố ngoại nhiễm nói gây ức chế phản ứng, làm giảm ức chế hoàn toàn phản ứng PCR Trong thực tế, số lượng chu kỳ phản ứng PCR không vượt 40 chu kỳ hiệu khuếch đại giảm hẳn phân hủy hết thành phần phản ứng, xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng, vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với Ở thực phản ứng PCR với 35 chu kỳ đạt kết tốt 4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen Nghiên cứu sử dụng máy giải trình tự gen tự động Trình tự gen mẫu bệnh đối chiếu với trình tự gen bình thường ngân hàng gen giới phân tích để xác định vùng điểm đột biến Nếu sản phẩm đọc giải trình tự tinh khiết có hiệu suất cao, đỉnh tín hiệu sắc nhọn, cao phân tách rõ ràng, tín hiệu thấp, dễ dàng phân biệt nucleotid nhận biết trạng thái đồng hợp tử/ dị hợp tử Tuy nhiên, dung dịch đem giải trình tự khơng tinh tạo nhiều sản phẩm phụ ức chế hoàn toàn, việc xuất tín hiệu nhiễu gây cản trở q trình đọc trình tự gen khó phân biệt đột biến tín hiệu nhiễu xác định vị trí đột biến loại đột biến Các kết giải trình tự nghiên cứu cho thấy hình ảnh tín hiệu rõ ràng, gần khơng có tín hiệu nhiễu chứng minh cho tối ưu giai đoạn quy trình kỹ thuật xây dựng trước Tuy kỹ thuật giải trình tự gen có giá trị có số hạn chế Kỹ thuật cần phải tiến hành qua nhiều bước (tách chiết DNA, phản ứng PCR, giải trình tự chuỗi phân tích trình tự); đột biến điểm thường khó 46 phát đột biến đoạn nên phải giải trình tự gen hai chiều Bên cạnh tín hiệu nhiễu gây trường hợp sai sót kết quả, địi hỏi người làm kỹ thuật phải có kinh nghiệm để đem lại kết xác Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự gen cải tiến nhiều, nhờ tiến kỹ thuật huỳnh quang, PCR, điện di trợ giúp công nghệ đại giúp cho việc giải trình tự gen trở nên đơn giản thành cơng cụ có giá trị, làm tảng cho việc phân tích gen người nhiều loài vi sinh vật 47 KẾT LUẬN Nghiên cứu hồn thiện quy trình xác định đột biến exon: 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin Trong bệnh nhân, phát bệnh nhân có đột biến g.83201 C>G vùng intron 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO James C et al (2009) The genetic basis of congenital hyperinsulinism J Med Genet, 46 (5), 289-299 Đặng Ánh Dương, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Phú Đạt cộng (2012) Cường insulin bẩm sinh nặng trẻ sơ sinh Tạp chí Thơng tin y dược, (7) Vũ Chí Dũng (2014) “Hạ đường máu nặng cường insulin bẩm sinh” Lê Thị Hồng Huệ (2001) “Nghiên cứu tình trạng giảm glucose máu trẻ sơ sinh cân nặng thấp” Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Hồng (2003) “Hạ đường huyết sơ sinh” Tạp chí y học thực hành số 438, Bộ Y tế 44±83 Phạm Nhật An (2012) Bài giảng Nhi khoa, Nhà xuất Y học Trần Bá Thoại, Trương Nguyễn Thoại Nhân Hạ đường huyết kéo dài cường insulin nhũ nhi? Stanley C A., (1997), ʺHyperinssulinism in infants and childrenʺ Pediatr Clin North Am 44(2): 363-374 Dekelbab BH, Sperling MA (2006) ʺRecent advances in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ Acta Paediar 2006 Oct: 95(10): 1157-64 10.Nguyễn Vượng (2000) ʺU tụy nội tiết – nghiên cứu miễn dịch –mô bệnh họcʺ Kỷ yếu CTNCKH Nội tiết rối loạn chuyển hóa, Nxb Y học 526- ±8 11.Bộ mơn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội (2009) Hạ đường máu, Bài giảng nhi khoa, Tập 1, Nhà xuất Y học, 197-203 12.Flanagan S E., Kapoor R R., et al., (2010) ʺGenetics of congenital hyperinsulinemic hypoglycemiaʺ Semin Pediatr Surg 20(1): 13-17 13.Senniappan S., Shanti B., et al., (2012) ʺHyperinsulinaemic hypoglycaemia: genetic mechanisms, diagnosis and managementʺ J Inherit Metab Dis 35(4): 589-601 14.Arnosix J B, Verkarre V, et al, (2010), “Congenitalhyperinsulinism curent trends in diagnosis and therapy” Orphanet J Rare Dis 663 15.Palladino A.A., Stanley C.A (2011) A specialized team approach to diagnosis and medical versus surgica treatment of infants with congenital hyperinsulinism Semin Pediatr Surg, 20(1) pp.32-37 16.Modan-Moses D., Koren I., et al., (2011) ʺTreatment of congenital hyperinsulinism with lanreotide acetate (Somatuline Autogel)ʺ J Clin Endocrinol Metab 96(8): 2312-2317 17.Sperling MA,Menon RK (2004) ʺDifferetial diagnosis and management of neonatal hypoglycemiaʺ Pediatr Clin North Am 2004 Jun;51(3): 703-23 18.Hussain K., (2008) “Diagnosis and management of hyperinsulinaemic hypoglycaemia of infancy” Horm Res 69(1): 2-13 19.Aslamm, Safdar CA, Khailid A, A wans, Ahmed I, Ahmed Z (2004) “Persistent hyperinsulinemic” 20.Hardy OT, Hernandez-Pampaloni M and coll (2007) ʺDiagnosis and localization of focal congenital hyperinsulinism by 18F-fluorodopa PET scanʺ, J Pediatr 2007 Feb; 150(2): 140-5 21.Nguyễn Đắc Nhật (2001) “Nồng độ insulin máu người Việt Nam bình thường” Kỷ yếu CTNCKH Hội Nội tiết ± Đái tháo đường Việt Nam, Nxb Y học 370 ± 22.Sempoux CH (2003) ʺPersistent neonatal hyperinsulinism: new pathological findings which clarify the physiopathology of the syndrome and direct therapeutic approachʺ Bull Mem Acad R Med Belg: 158(5-6): 291-7 23.Sawathiparnich P, Likitmaskul S, Angsusingha K, Nimkarn S and coll (2002) ʺPersistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy: experiences at Sirijai Hospitalʺ, J Med Assoc Thai 2002 Aug: 85 Suppl 2: 506-12 24.Insulin: http://vi.m.wikipedia.org 25.Shah JH, Maguire DJ, Brown D, Cotterill A (2007) ʺThe role of ATP sensitive channels in insulin secretion and the implcations in persistent hyperinsulinemic hypoglycenima of infancyʺ Avd Exp Med Biol 2007, 599: 133-8 26.Pinney S.E, MacMullen C., Becker S et al (2008) Clinical characteristics and biochemical mechanisms ofcongenital hyperinsulinism asociated with dominant KATP chanel mutations J Clin Invest, 2008, 118(8), 2877-2886 27.Phan Văn Duyệt, Nguyễn Đắc Nhật, Mai Thế Trạch (1987) “Định lượng phóng xạ miễn dịch học insulin người Việt Nam bình thường mắc bệnh đái tháo đường” Kỷ yếu chương trình y học hạt nhân 1981-1985, Nxb Y học 104±8 28.Daredeliler F Fournet JC, Bas F, Junien C, Gross MS, Bundak R, Saka N, Gunoz H (2002) ʺABCC8 (SUR1) and KCNJ11 (KIR6.2) mutations in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy and evaluation of different therapeutic measuresʺ J Pediatr Endocrinol Metab, 2002 JulAug; 15(7): 993-1000 29.Mc Andrew HF Smith V Spitz L (2003) ʺSurgical complications of pancreatectomy for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ Pediatr Surg 2003 Jan: 38(1):13-6 30.Tạ Thành Văn, (2010) “PCR số kỹ thuật Y sinh học phân tử”, Nhà xuất Y học 31.Nguyễn Quỳnh Ngọc (2013) Phát vi khuẩn actinobacillus actinomycetemcomitans gây viêm nha chu kỹ thuật realtime PCR, Trường Đại Học Y Hà Nội ... tụy Các đột biến gen ABCC8 KCNJ11 xác định nguyên nhân phổ biến bệnh Những đột biến xác định 85% bệnh nhân trải qua phẫu thuật tụy [2] Nguyên nhân phổ biến nặng cường insulin bẩm sinh đột biến lặn... 3.2 Kết xác định đột biến gen exon: 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 mẫu bệnh nhân cường insulin Mã bệnh nhân HI01 HI02 HI03 Kết Không đột biến g.83201 C>G (Dị hợp tử) (Intron 27) Không đột biến Gen ABCC8. .. biến gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin? ?? thực với mục tiêu: “Xây dựng quy trình xác định đột biến exon 5, 6, 27, 28 gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin? ?? CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh cường insulin bẩm