CÁC đột BIẾN GEN ở BỆNH NHÂN CƯỜNG INSULIN bẩm SINH ở TRẺ EM

Lưu ý: Xem phần Gen trong: A specialized team approach to diagnosis and medical versus surgical treatment of infants with congenital hyperinsulinism Hyperinsulinaemic hypoglycaemia Kapooor DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABCC8 ATP CDG ATP binding cassette transporter subfamily C member Adenosin triphosphat Congenital Disorders of Glycosylation – Rối loạn thủy phân CHI DNA GCK GDH GLUD1 HADH HNF4A IQ KCNJ 11 Kir6.2 MCT1 NST 18 F-DOPA-PET glucose bẩm sinh Congenital hyperinsulinism - Cường insulin bẩm sinh Deoxyribonucleic acid Glucokinase glucose 1-dehydrogenase glutamate dehydrogenase hydroxyacyl-CoA dehydrogenase hepatocyte nuclear factor 4, alpha Intelligence quotient – số thông minh Potasium inwardly rectifying channel subfamily J member 11 Inwardly rectifying potassium channels monocarboxylate transporter Nhiễm sắc thể Fluorine-18L-3, 4-hydroxyphenylalanine positron emission PT Rh SCHAD SLC16A1 SUR1 UCP2 tomography Phẫu thuật Rhesus L -3- hydroxyacyl- CoA dehydrogenase solute carrier family 16 sulfonylurea receptor uncoupling protein ĐẶT VẤN ĐỀ Cường insulin bẩm sinh (congenital hyperinsulinism – HI) mơ tả tình trạng điều hoà tiết insulin tế bào β tiểu đảo tuỵ gây hạ đường máu tiết insulin khơng tích hợp Cho đến gen biết đến có liên quan đến CHI, bao gờm gen mã hóa cho kênh KATP (ABCC8 và KCNJ11); gen mã hóa cho enzyme protein vận chuyển (GLUD1, GCK, HADH, SLC16A1, UCP2) yếu tố điều hòa HNF4A, HNF1A Sinh học phân tử (SHPT) nhánh sinh học nghiên cứu sở phân tử hoạt động sinh học Trong tương tác đại phân tử DNA, RNA protein chế điều hòa tương tác đặc biệt quan tâm Trong bệnh CHI, nhờ có tiến sinh học phân tử có vai trò quan trong, giúp cho chẩn đoán định hướng điều trị cho bệnh nhân Hiện nhiều kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật PCR, real‐ time PCR, cloning, sequence, ELISA, microarray,….đã ứng dụng hiệu bệnh viện để chẩn đoán bệnh Trong chuyên đề “Các đột biến gen bệnh cường insulin bẩm sinh trẻ em” Chúng tơi sâu vào tìm hiểu vấn đề sau: MỤC TIÊU Phương pháp PCR và phương pháp giải trình tự gen Các loại đột biến gen bệnh cường insulin bẩm sinh NỘI DUNG Phương pháp PCR 1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp Kary Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR thực hoàn toàn máy ly tâm ống eppendoff thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử Ngày PCR kỹ thuật then chốt sinh học phân tử ngày ứng dụng có hiệu chẩn đốn bệnh , 1.2 Ngun tắc kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR phương pháp tổng hợp DNA dựa dựa mạch khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc biệt cho đoạn DNA Primer lad đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm enthidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: giai đoạn biến tính tách đơi sợi (denaturation) Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (94oC - 95oC) vòng 30 - 60 giây, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trò mạch khn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: giai đoạn bắt cặp (annealing) Trong bước này, nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ nóng chảy primer, cho phép primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 40oC - 70oC tuỳ thuộc nhiệt độ nóng chảy primer mà thời gian bắt cặp kéo dài 30 - 60 giây Bước 3: giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation - extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Dưới tác động DNA polymerase, nucleotide gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sau chu kỳ chuỗi đôi DNA tạo thành tiếp tục dùng để làm DNA khuôn cho tổng hợp DNA chu kỳ Sản phẩm cuối phản ứng PCR đoạn DNA chuỗi đơi có chiều dài khoảng cách hai đoạn gen mồi hai đầu tận sản phẩm xác định đầu tận 5’ hai đoạn gen mời Hình Các bước phản ứng PCR (Theo Andy Vierstraete, 1999) Số lượng chu kỳ phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu, thường không vượt 40 chu kỳ Sau chu kỳ làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Như sau n chu kỳ, từ DNA đích nhân thành 2n Nhờ đủ số lượng để tách điện di phát sau nhuộm, đủ để tạo dòng giải trình tự Trong trình thực phản ứng PCR, chu kỳ sau lượng khuôn tăng lượng mồi dNTP tự giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính tốn hàm lượng mời, dNTP, enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết tốt 1.3 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 1.3.1 DNA khuôn Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh yếu tố quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo sản phẩm xác Kích thước đoạn DNA khuôn nhỏ 3kb cho kết nhân gen tốt DNA khn mẫu chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi, từ mô sinh thiết, từ tinh dịch lâu ngày, từ tóc xương người chết, Lượng DNA khuôn thường dùng khoảng 100-1000 ng cho phản ứng PCR 25-50 μl 1.3.2 Primer (mồi) Mời chìa khóa quan trọng cho thành cơng hay thất bại thí nghiệm PCR Mời đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15 - 30 nucleotid Để thực nhân đoạn DNA phản ứng PCR, cần có cặp mời thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khn Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi mồi ngược Mời xi có trình tự acid nucleic tương đờng với trình tự mạch đơn DNA khơng mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp đầu 3’ mạch antisense Mời ngược có trình tự tương đờng với trình tự mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense) bắt cặp với mạch sense đầu 3’ Nồng độ mồi phản ứng 0,1-0,5 μΜ 1.3.3 Các nucleotid tự Gồm loại deoxynucleotid triphosphat (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP dCTP, dùng làm chất để tổng hợp DNA Nồng độ độ dNTP loại khoảng 50 - 200μM cho phản ứng PCR Khi hàm lượng dNTP tự ít, tạo sản phẩm PCR khơng đủ để phát Ngược lại nồng độ dNTP cao dễ dẫn đến khuếch đại “ký sinh” 1.3.4 Enzym DNA polymerase Là yếu tố đóng vai trò định hiệu phản ứng PCR Enzym thường sử dụng Taq polymerase, phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Hàm lượng enzym ảnh hưởng lớn đến hiệu PCR Khi hàm lượng enzym ít, không đủ tạo sản phẩm PCR cần thiết.Ngược lại, nhiều enzym, tạo sản phẩm PCR không đặc hiệu Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho phản ứng tích 25 μl 0,5 U 1.3.5 Dung dịch đệm phản ứng Dung dịch đệm phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần cần thiết cho hoạt động enzym DNA polymerase MgCl 2, KCl, tris-HCl, Trong đó, Mg++ thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu phản ứng PCR ion Mg++ ảnh hưởng đến khả bắt cặp gắn mồi với mạch khuôn Nồng độ Mg++ thường - 5mM 1.4 Các loại PCR 1.4.1 PCR đa mồi (multiplex PCR) Là phương pháp PCR sử dụng đồng thời lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhân đoạn DNA đặc trưng khác phân tử DNA phân tử DNA khác Kỹ thuật PCR đa mồi thường sử dụng để nhân đờng thời exon gen sinh vật bậc cao Điều quan trọng phải thiết kế cặp mời có nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đờng thời mời không bắt cặp với quan trọng độ nhạy phát bệnh không giảm mà tương đương độ nhạy PCR đơn mồi Tuy nhiên khó để đạt điều kiện nên phương pháp PCR đa mời có nhược điểm đơi cho kết khơng xác PCR đơn mồi 1.3.2 Phương pháp PCR đơn mồi (monoplex PCR) Là PCR kinh điển nhất, phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA tế bào Phương pháp giải trình tự gen Giải trình tự gen (DNA sequencing) phương pháp xác định vị trí xếp nucleotid phân tử DNA 2.1 Các phương pháp xác định trình tự acid nucleic Có hai phương pháp dùng để xác định trình tự acid nucleotid phương pháp hóa học Maxam Gilbert phương pháp enzym Sanger cộng (phương pháp dideoxynucleotid) 2.1.1 Phương pháp Maxam Gilbert Nguyên tắc: sử dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ ( 32P) xử lý hóa học để phá hủy nucleotid, tạo hàng loạt đoạn DNA có kích thước khác Hình 4.Phương pháp Maxam Gilbert (Các đoạn DNA bị phá hủy nucleotid và điện di gel polyacrylamid) Các khâu phương pháp này: + Đánh dấu đầu đoạn DNA cần giải trình tự gốc phospho đờng vị phóng xạ (32P) + Xử lý đoạn DNA đãđánh dấu với chất hóa học làm biến đổi đặc hiệu loại base nucleotid đoạn DNA Ví dụ: dimethylsulphat làm biến đổi guanin cách thêm gốc methyl vị trí N7 + Các nucleotide bị biến đổi bị lấy khỏi mạch khung đường – carbon đoạn DNA, từđó tách đoạn mạch đơn có đầu đánh dấu 32P đầu bị phân tử base + Điện di mẫu DNA xử lý gel polyacrylamid biến tính để mạch đơn mẫu di chuyển gel không bị biến đổi trình điện di + Áp gel điện di phim nhạy tia X, vị trí dừng lại mạch đơn gel điện di tạo thành vạch phim vị trí bị đánh dấu phóng xạ, từđó đọc trình tự nucleotid đoạn DNA autoradiography (phim xạ ký tự ghi, bảng phóng xạ tự ghi) Trình tự nucleotide đọc từ lên theo chiều 5’– 3’ Hiện phương pháp sử dụng khó thực 2.1.2 Giải trình tự theo phương pháp Sanger (phương pháp dideoxynucleotid) Phương pháp Frederick Sanger cộng phát năm 1977, phương pháp giải trình tự gen áp dụng rộng rãi khoảng 25 năm năm qua Nguyên lý phương pháp sau: ngồi loại nucleotid thơng thường còn sử dụng thêm loại dideoxynucleotid (là deoxynucleotid có nhóm 3’OH thay H), dideoxynucleotid khơng còn khả hình thành nối phosphatdieste làm ngưng trình tổng hợp DNA, tạo đoạn DNA có kích thước nucleotid, sở xác định trình tự nucleotid Dideoxynucleotid (ddNTP) phân tử nhân tạo, cấu trúc tương tự phân tử deoxynucleotid (dNTP), nhiên carbon số đường deoxyribose khơng phải nhóm hydroxyl (– OH) mà – H (hình ) Hình Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP Các khâu phương pháp này: + Biến tính DNA sợi kép thành sợi đơn + Mối tiếp hợp với DNA sợi đơn + Phản ứng tổng hợp chuỗi polynucleotid gồm DNA sợi khuôn, primer, DA polymerase, deoxynucleotid (dNTP) dideoxynucleotid (ddNTP) Việc gắn dideoxynucleotid làm trình tổng hợp bị dừng lại ddNTP có cấu trúc hóa học bị gốc OH carbon thứ đường deoxyribose, mà gốc OH vị trí nơi để dNTP gắn vào + Điện di gel polyacrylamid biến tính để giải trình tự + Đọc kết phim xạ ký tự ghi (autoradiography) Hiện phương pháp ngày hoàn thiện thực dễ dàng phòng xét nghiệm Trong trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, dNTP tự gắn vào chuỗi tổng hợp liên kết phosphodieste 5’ phosphat với nhóm 3’ hydroxyl nucleotid cuối chuỗi (hình 6.A) Tuy nhiên, ddNTP gắn vào đầu 3’ chuỗi tổng hợp tổng hợp DNA dừng lại khơng hình thành liên kết phosphodieste với nucleotid (hình 6.B) nhân khác HI, thường bỏ sót chẩn đốn tháng đầu sau sinh Hạ đường máu bệnh nhân HI đột biến GDH thường dễ kiểm soát diazoxide với liều – 10 mg/kg/ngày HADH cường insulin Đột biến gen HADH ty thể (gen mã hóa enzyme L -3 hydroxyacyl – coenzyme A dehydrogenase (HADH), chúng liên quan đến bước cuối trình β oxy hóa), nguyên nhân gặp HI Cho tới có bệnh nhân chẩn đoán HI đột biến gen HADH Enzym xúc tác trình chuyển L -3 hydroxyacyl – CoAs chuỗi dài thành – ketoacyl CoAs tương ứng tăng cường hoạt động – hydroxybutyryl – CoA Gen HADH nằm nhiễm sắc thể số (4q22-26) Gen có hầu hết mô thể, hoạt động enzym mạnh tụy, đặc biệt đảo Langerhans Đột biến chức gen HADH gây HI Cơ chế điều hòa tiết insulin bệnh nhân thiếu HADH chưa hiểu rõ liên quan tới tương tác GDH HADH Di truyền lăn nhiễm sắc thể thường Phân tích gen tìm đột biến gen HADH định cho tất bệnh nhân hạ đường máu cường insulin đáp ứng với diazoxide gia đình kết huyết thống, bệnh nhân khơng tìm thấy đột biến gen mã hóa kênh KATP Marker hóa sinh thiếu HADH hỗ trợ thêm cho chẩn đoán HI tăng – hydroxybutyryl – carnitine máu tăng 3- hydroxyglutarate nước tiểu Triệu chứng lâm sàng thay đổi, xuất sớm trẻ sơ sinh với biểu hạ đường máu nặng xuất muộn với biểu hạ đường máu nhẹ Tất bệnh nhân đáp ứng với diazoxide vài bệnh nhân có chuyển hóa acylcarnitin bất thường HNF4A cường insulin Gen HNF4A mã hóa cho yếu tố chép HNF4α (hepatocyte nuclear factor alpha) HNF4α yếu tố chép then chốt cho phát triển gan biểu lộ gen đặc biệt tê bào gan Trong tế bào β tụy, HNF4α điều hòa nhiều gen quan trọng liên quan đến glucose kích thích tiết insulin Theo Flanagan cộng sự, 220 bệnh nhân HI đáp ứng với diazoxide giải trình tự gen cho gen ABCC8, KCNJ11, GCK, GLUD1 HNF4A, phát đột biến gen 27% bệnh nhân (59/220), đột biến kênh KATP thường gặp (15%), đột biến GLUD1 (5.9%) đột biến HNF4A (5%) Như đột biến HNF4A nguyên nhân đứng hàng thứ gây HI đáp ứng với diazoxide Đột biến dị hợp tử trội gen HNF4A biết nguyên nhân gây đái đường khởi phát tuổi vị thành niên typ (MODY1), chúng đặc trưng trình chức tế bào β thất bại đường máu gây tiết insulin Nghiên cứu gần cho thấy, đột biến di hợp tử gen HNF4A gây thai to hạ đường máu cường insulin thoáng qua hay dai dẳng Biểu lâm sàng bệnh nhân đặc trung cân nặng to sinh hạ đường máu tuần đầu sau sinh Mức độ nặng bệnh nhân khác từ nhẹ, hạ đường máu kiểm soát chế độ ăn đến hạ đường máu cường insulin dai dẳng cần phải điều trị diazoxide Trong nghiên cứu Flanagan, 11 bệnh nhân có đột biến gen HNF4A, hạ đường máu cường insulin xuất từ tháng đến tuổi, bệnh nhân có hạ đường máu dai dẳng cần phải điều trị diazoxide tuổi, bệnh nhân đái đường lúc 12 tuổi Có chế xác đột biến HNF4A gây HI chưa rõ liên quan đến giảm bộc lộ tiểu đơn vị Kir6.2 kênh K ATP giảm mức độ PPARα PPARα yếu tố chép, biết đến yếu tố kiểm soát biểu gen mã hóa enzym q trình beta oxy hóa acid béo Mức PPARα thấp gặp tế bào β thiếu HNF4A Có thể cho thiếu HNF4A gây giảm mức độ PPARα giảm beta oxy hóa acid béo dẫn đến tích tụ lipid (như malonyl – CoA) bào tương Tăng malonyl – CoA gây ức chế hoạt động enzym carnitinepalmitoyltransferase1 gây tăng mức acyl – CoA chuỗi dài bào tương, tín hiệu gây giải phóng insulin Cường insulin gây gắng sức (SLC16A1) SLC16A1 mã hóa monocarboxylat transporter Cường insulin gây gắng sức đặc trưng tiết insulin khơng thích hợp dẫn đến hạ đường máu thời gian gắng sức yếm khí sau cung cấp pyruvate Di truyền trội nhiễm sắc thể thường Sự vận chuyển lactat pyruvat gián tiếp monocarboxylate transporter (MCT1) chúng mã hóa gen SLC16A1 (solute carrier family 16, member1) Trong điều kiện tình trạng sinh lý học bình thường nờng độ lactat pyruvate thấp tế bào β chúng khơng kích thích tiết insulin Tuy nhiên đột biến hoạt hóa gen SLC16A1 gây bộc lộ MCT1 tế bào β (nơi gen thường không chép), cho phép hấp thu pyruvate pyruvate kích thích giải phóng insulin hạ đường máu xảy sau Khi gắng sức thiếu oxy, gây tích tụ lactat pyruvate, chúng kích thích tiết insulin Cho tới nay, theo y văn có 13 bệnh nhân chẩn đốn HI đột biến gen SLC16A1, 12 bệnh nhân từ gia đình bệnh nhân khơng liên quan tới yếu tố gia đình Những bệnh nhân với HI gắng sức thường có biểu hạ đường máu sau 30 -45 phút sau giai đoạn gắng sức tích cực thiếu oxy Điều trị bệnh nhân có thê điều trị tốt với diazoxide, nhiên diazoxide không phòng hạ đường máu sau gắng sức thiếu oxy Hoạt động sinh lý mức độ trung bình điều kiện oxy tốt thường thích nghi tốt, khơng có triệu chứng hạ đường máu, gắng sức điều kiện thiếu oxy kích thích tiết insulin gây hạ đường máu Glucokinase gây cường insulin Gen GCK mã hóa cho enzym glucokinase Glucokinase enzym phân giải glycogen chủ chốt, đóng vai trò then chốt cảm biến glucose tế bào β tụy Trong tế bào β, glucokinase hạn chế tốc độ chuyển hóa glucose, chi phối tiết insulin kích thích glucose Đột biến GCK ảnh hưởng đến hoạt động glucokinase gây HI Những đột biến hoạt hóa GCK làm hạ thấp ngưỡng tiết insulin kích thích glucose dẫn đến tiết insulin khơng thích hợp thời điểm hạ đường máu gây HI Những đột biến glucokinase hoạt hóa di truyền theo kiểu di truyền trội nhiễm sắc thể thường với mức độ nặng biểu bệnh khác đáng kể gia đình khác Đột biến hoạt hóa glucokinase gây HI, ngược lại đột biến bất hoạt glucokinase dẫn đến đái đường tuổi vị thành niên (monogenic diabetes of young – MODY2) Đột biến bất hoạt đồng hợp tử gen GCK gây đái đường vĩnh viễn trẻ sơ sinh Tuổi xuất cường insulin gây đột biến glucokinase khác nhau, dao động từ tuổi bú mẹ tuổi trưởng thành Bệnh nhân bị bệnh có hạ đường máu đói biểu đáp ứng mức độ khác với điều trị Một vài bệnh nhân đáp ứng tốt với điều trị diazoxide, ngược lại có bệnh nhân cần điều trị tích cực hơn, ngồi diazoxide phải phối hợp với octreotide đơi phải cần định phẫu thuật cắt tụy Đột biến gen UCP2 hạ đường máu cường insulin Gen UCP2 mã hóa mitochondrial uncoupling protein Uncoupling protein (UCP2) ty thể yếu tố điều hòa âm tính việc tiết insulin giảm tỷ lệ ATP/ADP tế bào β Đột biến chức gen UCP2 dẫn đến tăng tổng hợp ATP tăng tiết insulin glucose gây Theo nghiên cứu Gonzalez – Barroso MM cơng sự, có bệnh nhân HI đột biến gen UCP2, hai bệnh nhân sinh đủ tháng, khơng có cân nặng to sinh Bệnh nhân xuất hạ đường máu tuổi sơ sinh điều trị thành công diazoxide, ngừng diazoxide sau năm, khơng có hạ đường máu tái phát Bệnh nhân thứ xuất co giật lúc tháng tuổi điều trị thành công với diazoxide thời gian năm Tăng sản tế bào đảo tụy khu trú thường liên quan đến đột biến đồng hợp tử dị hợp tử di truyền từ bố sulfonylurea receptor (SUR1 gen ABCC8) inward – rectifying potassium channel (Kir6.2 gen KCNJ11) nhiễm sắc thể 11p15.1 allele từ mẹ đặc biệt tế bào tụy tăng sản Mặt khác, cường insulin thể lan tỏa rối loạn không đờng liên quan đến gen mã hóa cho SUR1 (ABCC8) Kir6.2 (KCNJ11) di truyền lặn Biêu lâm sàng CHI nặng, gặp CHI di truyền trội CHI di truyền trội đột biến gen glucokinase (GCK), gen GLUD1 mã hóa enzym glutamate dehydrogenase (GDH) biểu hội chứng HI/HA (hyperammonemia), gen SLC16A1 mã hóa monocarboxylate transporter (MCT1) vân động thể lực mạnh gây hạ đường máu , gen HNF4A đái đường khởi phát tuổi vị thành niên (maturity – onset diabetes of youth = MODY) gặp , gen mã hóa cho receptor insulin Hầu hết trường hợp CHI đáp ứng với diazoxide tất tương ứng với CHI thể lan tỏa Đáp ứng thoáng qua gặp di truyền trội Những nghiên cứu gần cho thấy thiếu short chain L-3 hydroxyacyl – CoA dehydrogenase (SCHAD, gen HADH) xác định nguyên nhân thứ CHI di truyền lặn đáp ứng với diazoxide Nhiều gen khác liên quan, đặc biệt gen đóng vai trò chuyển hóa lượng tế bào β (ví dụ gen UCP2 mã hóa protein khơng liên kết ty thể, chúng điều hòa thoát proton qua màng ty thể thay đổi tỷ lệ ATP/ADP) tiết insulin (ví dụ đột biến gen mã hóa tiền hocmon convertase-1 dẫn đến bất thường khơng có q trình tiền insulin, biểu hạ đường máu liên quan đến cường insulin, bệnh nhân có tiêu chảy, béo phì thiếu nội tiết khác (chuyển hóa hydrocortisol, giảm hocmon kích dục) CHI thể lan tỏa chia thành nhóm: bệnh lý kênh di truyền trội lặn (ABCC8 KCNJ11), CHI chuyển hóa chu trình Krebs đóng vai trò quan trọng tiết insulin (GCK, GLUD1, SLC16A1 HADH), nhóm liên quan đến thiếu yếu tố chép insulin (HNF4A) receptor insulin trình tiền insulin TÀI LIỆU THAM KHẢO Hussain K., Blankenstein O., De Lonlay P., et al (2007) Hyperinsulinaemic hypoglycaemia: biochemical basis and the importance of maintaining normoglycaemia during management Arch Dis Child, 92(7), 568-70 Senniappan S., Shanti B., James C., et al (2012) Hyperinsulinaemic hypoglycaemia: genetic mechanisms, diagnosis and management J Inherit Metab Dis, 35(4), 589-601 Menni F., de Lonlay P., Sevin C., et al (2001) Neurologic outcomes of 90 neonates and infants with persistent hyperinsulinemic hypoglycemia Pediatrics, 107(3), 476-9 Dunne M.J., Cosgrove K.E., Shepherd R.M., et al (2004) Hyperinsulinism in infancy: from basic science to clinical disease Physiol Rev, 84(1), 239-75 Lord K and De Leon D.D (2013) Monogenic hyperinsulinemic hypoglycemia: current insights into the pathogenesis and management Int J Pediatr Endocrinol, 2013(1), Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y học Phạm Hùng Vân (2009) PCR real time PCR - vấn đề ứng dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Hồ Huỳnh Thùy Hương (2003) Sinh học phân tử, lần thứ Nhà xuất giáo dục McPherson M.J H.B.D., Taylor G.R (1995) "Optimizing PCR" in PCR : A practical approach Oxford University Press, - 22 10 D.H S (1997) DNA amplification techniques, Molecular Diagnostics, Humana Press; 98-101 11 R.J R (2004) Polymerase chain reaction, Analysis of Genes and Genomes, John Wiley & Sons Ltd; 153-182 12 Sanger F., Nicklen S., and Coulson A.R (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, 74(12), 5463-7 13 J K (2005) DNA sequencing, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition, 260-262 14 James C., Kapoor R.R., Ismail D., et al (2009) The genetic basis of congenital hyperinsulinism J Med Genet, 46(5), 289-99 15 Yorifuji T (2014) Congenital hyperinsulinism: current status and future perspectives Ann Pediatr Endocrinol Metab, 19(2), 57-68 16 Arnoux J.B., Verkarre V., Saint-Martin C., et al (2011) Congenital hyperinsulinism: current trends in diagnosis and therapy Orphanet J Rare Dis, 6(63 17 Barthlen W., Blankenstein O., Mau H., et al (2008) Evaluation of [18F]fluoro-LDOPA positron emission tomography-computed tomography for surgery in focal congenital hyperinsulinism J Clin Endocrinol Metab, 93(3), 869-75 18 Bax K.N and van der Zee D.C (2007) The laparoscopic approach toward hyperinsulinism in children Semin Pediatr Surg, 16(4), 245-51 19 Mazor-Aronovitch K., Gillis D., Lobel D., et al (2007) Long-term neurodevelopmental outcome in conservatively treated congenital hyperinsulinism Eur J Endocrinol, 157(4), 491-7 20 Hardy O.T., Hernandez-Pampaloni M., Saffer J.R., et al (2007) Diagnosis and localization of focal congenital hyperinsulinism by 18F-fluorodopa PET scan J Pediatr, 150(2), 140-5 21 Ribeiro M.J., Boddaert N., Delzescaux T., et al (2007) Functional imaging of the pancreas: the role of [18F]fluoro-L-DOPA PET in the diagnosis of hyperinsulinism of infancy Endocr Dev, 12(55-66 22 Ashcroft F.M., Harrison D.E., and Ashcroft S.J (1984) Glucose induces closure of single potassium channels in isolated rat pancreatic beta-cells Nature, 312(5993), 446-8 23 Inagaki N., Gonoi T., Clement J.P.t., et al (1995) Reconstitution of IKATP: an inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor Science, 270(5239), 116670 24 Ashcroft F.M (2005) ATP-sensitive potassium channelopathies: focus on insulin secretion J Clin Invest, 115(8), 2047-58 25 Tucker S.J., Gribble F.M., Proks P., et al (1998) Molecular determinants of KATP channel inhibition by ATP EMBO J, 17(12), 3290-6 26 Aguilar-Bryan L., Nichols C.G., Wechsler S.W., et al (1995) Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion Science, 268(5209), 423-6 27 Senniappan S., Arya V.B., and Hussain K (2013) The molecular mechanisms, diagnosis and management of congenital hyperinsulinism Indian J Endocrinol Metab, 17(1), 19-30 28 Simsek E., Binay C., Flanagan S.E., et al (2013) Congenital hyperinsulinism presenting with different clinical, biochemical and molecular genetic spectra Turk J Pediatr, 55(6), 584-90 29 Flanagan S.E., Kapoor R.R., Banerjee I., et al (2011) Dominantly acting ABCC8 mutations in patients with medically unresponsive hyperinsulinaemic hypoglycaemia Clin Genet, 79(6), 582-7 30 Flanagan S.E., Patch A.M., Locke J.M., et al (2011) Genome-wide homozygosity analysis reveals HADH mutations as a common cause of diazoxide-responsive hyperinsulinemic-hypoglycemia in consanguineous pedigrees J Clin Endocrinol Metab, 96(3), E498-502 31 Pinney S.E., MacMullen C., Becker S., et al (2008) Clinical characteristics and biochemical mechanisms of congenital hyperinsulinism associated with dominant KATP channel mutations J Clin Invest, 118(8), 2877-86 32 Hardy O.T., Hernandez-Pampaloni M., Saffer J.R., et al (2007) Accuracy of [18F]fluorodopa positron emission tomography for diagnosing and localizing focal congenital hyperinsulinism J Clin Endocrinol Metab, 92(12), 4706-11 33 Stanley C.A., Thornton P.S., Ganguly A., et al (2004) Preoperative evaluation of infants with focal or diffuse congenital hyperinsulinism by intravenous acute insulin response tests and selective pancreatic arterial calcium stimulation J Clin Endocrinol Metab, 89(1), 288-96 34 Stanley C.A (2004) Hyperinsulinism/hyperammonemia syndrome: insights into the regulatory role of glutamate dehydrogenase in ammonia metabolism Mol Genet Metab, 81 Suppl 1(S45-51 35 Palladino A.A., Bennett M.J., and Stanley C.A (2008) Hyperinsulinism in infancy and childhood: when an insulin level is not always enough Clin Chem, 54(2), 25663 36 MacMullen C., Fang J., Hsu B.Y., et al (2001) Hyperinsulinism/hyperammonemia syndrome in children with regulatory mutations in the inhibitory guanosine triphosphate-binding domain of glutamate dehydrogenase J Clin Endocrinol Metab, 86(4), 1782-7 37 Hussain K (2008) Diagnosis and management of hyperinsulinaemic hypoglycaemia of infancy Horm Res, 69(1), 2-13 38 Hsu B.Y., Kelly A., Thornton P.S., et al (2001) Protein-sensitive and fasting hypoglycemia in children with the hyperinsulinism/hyperammonemia syndrome J Pediatr, 138(3), 383-9 39 Meissner T., Mayatepek E., Kinner M., et al (2004) Urinary alpha-ketoglutarate is elevated in patients with hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome Clin Chim Acta, 341(1-2), 23-6 40 Kapoor R.R., Flanagan S.E., Fulton P., et al (2009) Hyperinsulinismhyperammonaemia syndrome: novel mutations in the GLUD1 gene and genotypephenotype correlations Eur J Endocrinol, 161(5), 731-5 41 Kapoor R.R., James C., Flanagan S.E., et al (2009) 3-Hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency and hyperinsulinemic hypoglycemia: characterization of a novel mutation and severe dietary protein sensitivity J Clin Endocrinol Metab, 94(7), 2221-5 42 Kapoor R.R., James C., and Hussain K (2009) Hyperinsulinism in developmental syndromes Endocr Dev, 14(95-113 43 Marquard J., Palladino A.A., Stanley C.A., et al (2011) Rare forms of congenital hyperinsulinism Semin Pediatr Surg, 20(1), 38-44 44 Clayton P.T., Eaton S., Aynsley-Green A., et al (2001) Hyperinsulinism in shortchain L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency reveals the importance of beta-oxidation in insulin secretion J Clin Invest, 108(3), 457-65 45 Vredendaal P.J., van den Berg I.E., Malingre H.E., et al (1996) Human short-chain L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase: cloning and characterization of the coding sequence Biochem Biophys Res Commun, 223(3), 718-23 46 Hardy O.T., Hohmeier H.E., Becker T.C., et al (2007) Functional genomics of the beta-cell: short-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase regulates insulin secretion independent of K+ currents Mol Endocrinol, 21(3), 765-73 47 Li C., Chen P., Palladino A., et al (2010) Mechanism of hyperinsulinism in shortchain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency involves activation of glutamate dehydrogenase J Biol Chem, 285(41), 31806-18 48 Pansuriya T.C., Oosting J., Verdegaal S.H., et al (2011) Maffucci syndrome: a genome-wide analysis using high resolution single nucleotide polymorphism and expression arrays on four cases Genes Chromosomes Cancer, 50(9), 673-9 49 Martins E., Cardoso M.L., Rodrigues E., et al (2011) Short-chain 3-hydroxyacylCoA dehydrogenase deficiency: the clinical relevance of an early diagnosis and report of four new cases J Inherit Metab Dis, 34(3), 835-42 50 Molven A., Matre G.E., Duran M., et al (2004) Familial hyperinsulinemic hypoglycemia caused by a defect in the SCHAD enzyme of mitochondrial fatty acid oxidation Diabetes, 53(1), 221-7 51 Gupta R.K., Vatamaniuk M.Z., Lee C.S., et al (2005) The MODY1 gene HNF4alpha regulates selected genes involved in insulin secretion J Clin Invest, 115(4), 1006-15 52 Flanagan S.E., Kapoor R.R., Mali G., et al (2010) Diazoxide-responsive hyperinsulinemic hypoglycemia caused by HNF4A gene mutations Eur J Endocrinol, 162(5), 987-92 53 Yamagata K., Furuta H., Oda N., et al (1996) Mutations in the hepatocyte nuclear factor-4alpha gene in maturity-onset diabetes of the young (MODY1) Nature, 384(6608), 458-60 54 Pearson E.R., Boj S.F., Steele A.M., et al (2007) Macrosomia and hyperinsulinaemic hypoglycaemia in patients with heterozygous mutations in the HNF4A gene PLoS Med, 4(4), e118 55 Kapoor R.R., Locke J., Colclough K., et al (2008) Persistent hyperinsulinemic hypoglycemia and maturity-onset diabetes of the young due to heterozygous HNF4A mutations Diabetes, 57(6), 1659-63 56 Pingul M.M., Hughes N., Wu A., et al (2011) Hepatocyte nuclear factor 4alpha gene mutation associated with familial neonatal hyperinsulinism and maturity-onset diabetes of the young J Pediatr, 158(5), 852-4 57 Gremlich S., Nolan C., Roduit R., et al (2005) Pancreatic islet adaptation to fasting is dependent on peroxisome proliferator-activated receptor alpha transcriptional up-regulation of fatty acid oxidation Endocrinology, 146(1), 37582 58 Prentki M., Joly E., El-Assaad W., et al (2002) Malonyl-CoA signaling, lipid partitioning, and glucolipotoxicity: role in beta-cell adaptation and failure in the etiology of diabetes Diabetes, 51 Suppl 3(S405-13 59 Otonkoski T., Jiao H., Kaminen-Ahola N., et al (2007) Physical exercise-induced hypoglycemia caused by failed silencing of monocarboxylate transporter in pancreatic beta cells Am J Hum Genet, 81(3), 467-74 60 Meissner T., Otonkoski T., Feneberg R., et al (2001) Exercise induced hypoglycaemic hyperinsulinism Arch Dis Child, 84(3), 254-7 61 Otonkoski T., Kaminen N., Ustinov J., et al (2003) Physical exercise-induced hyperinsulinemic hypoglycemia is an autosomal-dominant trait characterized by abnormal pyruvate-induced insulin release Diabetes, 52(1), 199-204 62 Meissner T., Friedmann B., Okun J.G., et al (2005) Massive insulin secretion in response to anaerobic exercise in exercise-induced hyperinsulinism Horm Metab Res, 37(11), 690-4 63 Zhao C., Wilson M.C., Schuit F., et al (2001) Expression and distribution of lactate/monocarboxylate transporter isoforms in pancreatic islets and the exocrine pancreas Diabetes, 50(2), 361-6 64 Christesen H.B., Tribble N.D., Molven A., et al (2008) Activating glucokinase (GCK) mutations as a cause of medically responsive congenital hyperinsulinism: prevalence in children and characterisation of a novel GCK mutation Eur J Endocrinol, 159(1), 27-34 65 Glaser B., Kesavan P., Heyman M., et al (1998) Familial hyperinsulinism caused by an activating glucokinase mutation N Engl J Med, 338(4), 226-30 66 Wabitsch M., Lahr G., Van de Bunt M., et al (2007) Heterogeneity in disease severity in a family with a novel G68V GCK activating mutation causing persistent hyperinsulinaemic hypoglycaemia of infancy Diabet Med, 24(12), 1393-9 67 Froguel P., Zouali H., Vionnet N., et al (1993) Familial hyperglycemia due to mutations in glucokinase Definition of a subtype of diabetes mellitus N Engl J Med, 328(10), 697-702 68 Njolstad P.R., Sovik O., Cuesta-Munoz A., et al (2001) Neonatal diabetes mellitus due to complete glucokinase deficiency N Engl J Med, 344(21), 1588-92 69 Sayed S., Langdon D.R., Odili S., et al (2009) Extremes of clinical and enzymatic phenotypes in children with hyperinsulinism caused by glucokinase activating mutations Diabetes, 58(6), 1419-27 70 Cuesta-Munoz A.L., Huopio H., Otonkoski T., et al (2004) Severe persistent hyperinsulinemic hypoglycemia due to a de novo glucokinase mutation Diabetes, 53(8), 2164-8 71 Gonzalez-Barroso M.M., Giurgea I., Bouillaud F., et al (2008) Mutations in UCP2 in congenital hyperinsulinism reveal a role for regulation of insulin secretion PLoS One, 3(12), e3850 72 Chan C.B., De Leo D., Joseph J.W., et al (2001) Increased uncoupling protein-2 levels in beta-cells are associated with impaired glucose-stimulated insulin secretion: mechanism of action Diabetes, 50(6), 1302-10 73 de Lonlay P., Fournet J.C., Rahier J., et al (1997) Somatic deletion of the imprinted 11p15 region in sporadic persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy is specific of focal adenomatous hyperplasia and endorses partial pancreatectomy J Clin Invest, 100(4), 802-7 74 Verkarre V., Fournet J.C., de Lonlay P., et al (1998) Paternal mutation of the sulfonylurea receptor (SUR1) gene and maternal loss of 11p15 imprinted genes lead to persistent hyperinsulinism in focal adenomatous hyperplasia J Clin Invest, 102(7), 1286-91 75 Thomas P.M., Cote G.J., Wohllk N., et al (1995) Mutations in the sulfonylurea receptor gene in familial persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy Science, 268(5209), 426-9 76 Nestorowicz A., Inagaki N., Gonoi T., et al (1997) A nonsense mutation in the inward rectifier potassium channel gene, Kir6.2, is associated with familial hyperinsulinism Diabetes, 46(11), 1743-8 77 Thomas P., Ye Y., and Lightner E (1996) Mutation of the pancreatic islet inward rectifier Kir6.2 also leads to familial persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy Hum Mol Genet, 5(11), 1809-12 78 Nestorowicz A., Wilson B.A., Schoor K.P., et al (1996) Mutations in the sulonylurea receptor gene are associated with familial hyperinsulinism in Ashkenazi Jews Hum Mol Genet, 5(11), 1813-22 79 Stanley C.A., Lieu Y.K., Hsu B.Y., et al (1998) Hyperinsulinism and hyperammonemia in infants with regulatory mutations of the glutamate dehydrogenase gene N Engl J Med, 338(19), 1352-7 80 Hojlund K., Hansen T., Lajer M., et al (2004) A novel syndrome of autosomaldominant hyperinsulinemic hypoglycemia linked to a mutation in the human insulin receptor gene Diabetes, 53(6), 1592-8 81 Arnoux J.B., de Lonlay P., Ribeiro M.J., et al (2010) Congenital hyperinsulinism Early Hum Dev, 86(5), 287-94 ... thể bệnh nặng [22],[23] Sau 20 năm kể từ đột biến ABCC8 mơ tả đến có 200 đột biến phát Các đột biến phân bố suốt chiều dài gen Nguyên nhân cường insulin bẩm sinh Cường insulin bẩm sinh đột biến. .. biến gen bệnh cường insulin bẩm sinh trẻ em Chúng tơi sâu vào tìm hiểu vấn đề sau: MỤC TIÊU Phương pháp PCR và phương pháp giải trình tự gen Các loại đột biến gen bệnh cường insulin bẩm sinh. .. gia đình bệnh nhân số 20 cho thấy bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 7599-31C>T intron 31,mẹ bệnh nhân đột biến Như bệnh nhâncó đột biến 7599-31C>T dị hợp tử intron 31 nhận alen đột biến từ bố