MK (+) (-) HI01 HI02 (+) (-) HI01 H
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
BÀN LUẬN 4.1. Kỹ thuật tách chiết DNA
Ngày nay kỹ thuật y sinh học phân tử có vai trò to lớn trong việc chẩn đoán bệnh ở mức độ phân tử giúp chẩn đoán sớm và chính xác các bệnh lý di truyền. Trong bất kỳ nghiên cứu và ứng dụng nào về lĩnh vực này thì giai đoạn tách chiết DNA (hoặc RNA) là khâu đầu tiên, cơ bản và rất quan trọng. Phân tử DNA được tách chiết phải đảm bảo đủ nồng độ, có độ tinh sạch cao, không đứt gãy, không bị tạp nhiễm thì mới đủ điều kiện cho các phản ứng tiếp theo đạt được hiệu suất và độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol để tách chiết phân tử DNA của các bệnh nhân cường insulin.
Tất cả các mẫu DNA của bệnh nhân sau khi tách chiết được xác định nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang trên máy Nanodrop 1000 tại các bước sóng 260nm (A260) và 280nm (A280). Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ ánh sáng đặc trưng của mỗi chất tại một bước sóng xác định. DNA hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 260nm do sự có mặt của nhân base purin và pyrimidine trong cấu trúc- 2 loại đơn phân cấu tạo nên DNA. Trong khi đó, protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 280nm do sự có mặt của các acid amin nhân thơm và dị vòng (tyrosin, tryptophan, phần nhỏ nhờ phenylalanine). Giá trị mật độ quang cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu nghiên cứu và tỷ lệ A 260nm/A280nm cho phép đánh giá độ tinh sạch DNA. Sản phẩm DNA tách chiết đạt yêu cầu là những mẫu có nồng độ ≥50ng/µl và độ tinh sạch (A260/A280) đạt từ 1,8-2,0, các mẫu này sẽ được sử dụng để tiến hành các bước tiếp theo của nghiên cứu. Những mẫu không đạt được các điều kiện trên thì cần phải tiến hành tách chiết lại.
Bảng 3.1 cho thấy tất cả DNA sau tách chiết của các đối tượng nghiên cứu đều đạt yêu cầu để tiến hành kỹ thuật PCR và giải trình tự gen tiếp theo.
Để khẳng định kết quả tách chiết một lần nữa, chúng tôi đã tiến hành chạy điện di mẫu DNA trên gel agarose 0,8%. Hình ảnh điện di cho thấy DNA không bị đứt gãy, đảm bảo độ nguyên vẹn và đạt đủ nồng độ như mong muốn, tất cả các mẫu DNA đem điện di đều hiện lên một băng sáng duy nhất sau khi được nhuộm Ethidium bromide và chụp hình (Hình 3.2).