2.2.5.1.Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự
Mẫu sau khi chạy phản ứng PCR được sử dụng để giải trình tự gen. Thành phần của 1 phản ứng:
STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
1 Sản phẩm PCR 0,5
2 Big dye Buffer 2
3 Big dye Sequencing 1 4 Mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược) 0,5
5 Nước cất 2 lần 6
Tổng thể tích 10
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: Biến tính: 96ºC trong 1 phút
Biến tính: 96ºC trong 10 giây
Gắn mồi: 50ºC trong 5 giây 25 chu kỳ Kéo dài: 60ºC trong 4 phút
Bảo quản ở 15ºC
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
Sản phẩm PCR giải trình tự được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol: - Thêm vào ống hỗn hợp phản ứng:
+ 60µl Ethanol lạnh 100% + 5µl EDTA 0,0125M
- Lắc nhẹ để trong buồng tối 15 phút - Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút/4ºC - Hút bỏ dung dịch giữ lại tủa DNA ở đáy ống
- Thêm 200µl Ethanol 70%. Trộn đều rồi để ở nhiệt độ phòng - Ly tâm 15000 vòng/phút x 10 phút /4ºC
- Loại bỏ dịch nổi. Để khô hoàn toàn - Thêm 20µl Hi-Di.Trộn đều (voltex nhẹ) - Để ở 95ºC trong 2 phút
- Làm lạnh trong 5 phút, voltex rồi chuyển sang giải trình tự bằng máy ABI 3100
2.2.5.2. Giải trình tự trực tiếp
Các đột biến trên gen ABCC8 được phát hiện bằng giải trình tự trực tiếp trên máy giải trình tự gen tự động tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein Trường Đại học Y Hà Nội và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Các kết quả trình tự gen ABCC8 của mẫu đối chứng vàmẫu bệnh nhân sẽ được so sánh với trình tự chuẩn của gen ABCC8 trên GeneBank.