Bệnh nhân được tiến hành lấy 2-3ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần).
Yêu cầu:
- Quy trình phải đảm bảo vô tùng tuyệt đối. Mẫu được dùng để tách DNA càng sớm càng tốt, khi chưa tách được ngay thì bảo quản ở tủ lạnh âm sâu cho đến khi phân tích mẫu.
- Máu phải đảm bảo không được đông dây, không vỡ hồng cầu - Bảo quản ở 4ºC-8ºC trong tối đa 4h
- Tiến hành tách chiết DNA trong vòng 24-72h
2.3.2.2. Tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp Phenol/ Chloroform/Isoamylalcohol.
Các bước gồm: Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào Phá vỡ màng nhân Loại protein Tủa DNA Rửa tủa Hòa tan DNA.
Quy trình cụ thể:
Bước 1: Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào
- Cho vào ống eppendorf 1,5ml: 0,5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer) + 0,5 ml máu toàn phần chống đông EDTA
- Votex mạnh
- Ly tâm 4000v/phút x5 phút/4ºC - Loại dịch nổi, thu cặn
Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi tủa (nhân và xác tế bào) thấy cặn trắng ở đáy ống.
Bước 2: Phá vỡ màng nhân
- Ống eppendorf 1,5 ml chứa cặn + 0,5 ml dung dịch PBS (dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào bạch cầu và cố định nhân)
- Votex mạnh
- Ly tâm 4000v/phút x 5 phút/4ºC - Loại dịch nổi, thu cặn
- Cặn + 0,6 ml dung dịch Lysis buffer 5µl proteinase K
- Sau đó ủ ở 56ºC/2h-3h kèm theo lắc nhẹ để phân hủy protein thu được dung dịch đồng nhất.
Bước 3: Tủa DNA
- Dung dịch + 0,5 ml dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1) - Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
- Hỗn hợp phân thành 3 lớp: lớp trên cùng có chứa DNA, lớp giữa là cặn tế bào và protein, lớp dưới cùng là dịch chiết
- Thu lớp dịch trên cùng
- Thêm dung dịch Chloroform: Isoamyl
- Dung dịch + 0,5 ml Chloroform: Isoamyl (24:1) - Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC - Hỗn hợp phân thành 2 lớp: thu lớp dịch trên cùng - Lặp lại bước này một lần nữa thu dung dịch - Tủa DNA
- Trộn 1V dung dịch + 2,5V Ethanol 100% - Lắc đều, ủ -20ºC/2h để tủa DNA
- Ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC thu tủa
- Tủa rửa bằng 1ml Ethanol 70%, trộn đều và ly tâm15000v/phút x 20 phút/4ºC thu được tủa DNA.
- Tủa DNA để khô tự nhiên (56ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE hoặc nước cất 2 lần
- DNA tách chiết được sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng đo mật độ quang trên máy Nano Drop ở bước sóng 260nm và 280nm
- Pha DNA thành nồng độ 50ng/µl
Sản phẩm đạt yêu cầu khi tỷ số A260/A280 từ 1,8-2,0.
2.3.2.3. Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA
Hai phương pháp được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch DNA và đo nồng độ DNA từ mẫu vừa tách là điện di DNA tổng số và đo mật độ quang (OD) trên máy Nano Drop.
2.3.2.3.1. Đo mật độ quang (OD)
Lấy 1,5-2µl DNA tổng số tách được đo trên máy Nano Drop 1000. Trước khi đo tiến hành trừ trắng với dung dịch pha DNA (TE hoặc nước cất).
2.3.2.3.2. Điện di DNA tổng số
DNA vừa được tách là những DNA tổng số của bộ gen người, hình ảnh điện di trên gel agarose cho phép đánh giá sự xuất hiện của DNA trong mẫu thu được cũng như nồng độ, tính nguyên vẹn và độ tinh sạch của sản phẩm.
- Quy trình điện di DNA tổng số
Chuẩn bị gel 0,8%
+ Cân 0,2g bột agarose cho vào bình thủy tinh với 25ml dung dịch đệm TBE 1X (Tris-Boric acid-EDTA)
+ Đun trong lò vi sóng, lắc đều cho tới khi tan hoàn toàn + Đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược để tạo các giếng + Để khoảng 30 phút bản gel sẽ đông cứng lại
Chuẩn bị mẫu điện di
+ Trộn đều mỗi mẫu 5µl DNA với 2µl dung dịch loading dye
+ Đổ đệm TBE vào buồng điện di, đặt bản gel vào buồng điện di sao cho ngập trong đệm
+ Tra 5µl các mẫu vào các giếng của bản gel
Chạy điện di
+ Cài đặt thông số máy điện di, tiến hành điện di ở 90V trong 40 phút
Chụp hình bản gel
+ Lấy bản gel vừa chạy điện di ngâm vào dung dịch Ethidium brommide (5mg/ml) trong 5 phút
+ Rửa nước để loại bỏ phần Ethidium thừa + Chụp hình bằng máy chụp tia UV tự động + Đọc và nhận định hình ảnh điện di
Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4ºC trong thời gian ngắn hoặc lưu giữ ở -20ºC trong thời gian dài.