MK (+) (-) HI01 HI02 (+) (-) HI01 H
4.2. Kỹ thuật khuếch đại gen(PCR)
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại 4 exon: 5, 6, 27, 28 trên gen ABCC8 ở bệnh nhân cường insulin. Sau khi được khuếch đại, sản phẩm PCR được kiểm tra độ nguyên vẹn, độ tinh sạch và độ đặc hiệu bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và soi bằng tia tử ngoại. Tỉ lệ agarose có trong bản gel được quyết định bởi kích thước của đoạn gen đích. Trong trường hợp này dựa trên kích thước của đoạn gen đích lần lượt là: 418bp, 370bp, 304bp, 324bp tương ứng với các exon: 5, 6, 27, 28 chúng tôi thấy tỉ lệ agarose 1,5% là thích hợp nhất để cho kết quả điện di tốt. Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 3.3) cho thấy chỉ có duy nhất một băng điện di sáng, phân tách rõ ràng, gọn, rõ nét, xuất hiện ở các mẫu đúng vị trí của đoạn gen đặc hiệu, không có vạch mồi thừa và các băng phụ. Vị trí DNA trên mẫu bệnh nhân được so sánh với Marker để đánh giá độ đặc hiệu. Điều này chứng tỏ trong nghiên cứu này cặp mồi được thiết kế tốt, hoạt động hiệu quả, chu trình nhiệt và các điều kiện khác đã được tối ưu, phản ứng PCR được thực hiện thành công.
Trong phản ứng PCR có một vấn đề đáng chú ý nữa đó là việc tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Nếu những sản phẩm phụ này xuất hiện nhiều trong sản phẩm PCR ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR. Bên cạnh đó, hình ảnh điện di của chúng cũng ảnh hưởng ít nhiều đến việc chúng ta quan sát hình ảnh điện di của gen mà ta cần khuếch đại. Do đó, việc giảm
sự tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn cũng là một điều cần thiết trong phản ứng PCR.
Kết quả PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chất lượng và nồng độ DNA mẫu, nồng độ và thiết kề mồi, nồng độ ion Mg2+, nồng độ các dNTP,
Taq DNA polymerase, hệ thống đệm, chu trình nhiệt. Các yếu tố trước tiên có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR là nồng độ và độ tinh sạch của DNA mẫu, chu trình nhiệt và thiết kế mồi.
Nhiệt độ biến tính DNA khuôn có thể dao động từ 90-98ºC. Nếu nhiệt độ này cao quá và kéo dài sẽ làm giảm số lượng cũng như chất lượng của Taq
polymerase vì thời gian bán hủy của Taq polymerase không dài: 2giờ/92,5ºC, 40 phút/95ºC, 5 phút/97,5ºC. Nhiệt độ và thời gian gắn mồi là đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của sản phẩm PCR. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base- trình tự nucleotid, kích thước và nồng độ mồi. Sau thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy với nhiệt độ gắn mồi là 55ºC cho kết quả tốt nhất. Tất cả các mẫu đều được khuếch đại trên máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính ở 95ºC trong 5 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ nhiệt: biến tính ở 95ºC trong 30 giây, gắn mồi ở 55ºC trong 30 giây, kéo dài ở 72ºC trong 30 giâyvà tiếp tục kéo dài ở 72ºC trong 5 phút nữa, cuối cùng giữ ở 15ºC. Chu trình nhiệt này đã được chứng minh hiệu quả cao ở tất cả các mẫu khuếch đại.
Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung các phần khác nhau của một mồi, Tm của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau, thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC, các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, trình tự nằm giữa 2 mồi xuôi và ngược không quá lớn. Kích thước mồi từ
16-30bp là phù hợp, độ dài này là đủ dài để đặc trưng đầy đủ cho đoạn bắt cặp và đủ ngắn để cho mồi gắn một cách dễ dàng vào đoạn gen.
Đối với DNA mẫu, phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch, không tạp nhiễm, không đứt gãy.
Enzym DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR. Hiện nay, mỗi enzym Taq polymerase thường được sản xuất kèm theo một hệ thống đệm với pH thích hợp, chứa Mg2+ và các dNTP với nồng độ phù hợp. Trong quá trình tổng hợp DNA, enzym DNA polymerase lựa chọn các nucleotid phù hợp để kéo dài các mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn. DNA polymerase luôn xúc tác phản ứng tổng hợp chuỗi DNA theo chiều 5’-3’. Ngoài ra, một số DNA polymerase cũng có hoạt tính của enzym exonuclease xúc tác theo chiều 3’- 5’ và được gọi là hoạt tính enzym sửa chữa. Enzym này có khả năng kiểm tra lại độ chính xác của tất cả các nucleotid đã được gắn vào trong quá trình kéo dài đoạn DNA mồi. Nếu có nucleotid nào được gắn không đúng theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn, enzym này sẽ xúc tác cắt bỏ nucleotid sai sót và thay thế vào đó một nucleotid khác đúng theo nguyên tắc đối mã. Độ chính xác và hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào việc chọn enzym DNA polymerase cho phản ứng.
Bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 20- 200µM/ mỗi nucleotid. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của Taq polymerase.
MgCl2 trong dung dịch đệm là một trong những thành phần quan trọng nhất của PCR do nồng độ của chất này có thể ảnh hưởng đến sự đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng. Taq DNA polymerase phụ thuộc vào nồng độ Mg2+ và thường có hoạt độ tối ưu ở nồng độ 1,2-1,3 mM Mg2+ tự do. Dung dịch đệm chuẩn chứa 1.5mM MgCl2. Tuy nhiên, nồng độ Mg2+ tự do bị ảnh hưởng bởi nồng độ dNTP vì có quá trình liên kết cân bằng về phân tử lượng giữ dNTP và Mg2+. Không nên giảm nồng độ các dNTP dưới 200µM khi sử dụng các
enzym polymerase có khả năng sửa chữa vì hoạt tính exonuclease 3’-5’ có thể thúc đẩy quá trình thoái hóa các chuỗi DNA đơn như đoạn DNA mồi.
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAse, enzym hạn chế… tức là không chứa các thành phần tạp nhiễm. Các yếu tố ngoại nhiễm nói trên có thể gây ức chế phản ứng, làm giảm hoặc ức chế hoàn toàn phản ứng PCR.
Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và hết các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. Ở đây chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với 35 chu kỳ và đã đạt được kết quả tốt.
4.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
Nghiên cứu sử dụng máy giải trình tự gen tự động. Trình tự gen của mẫu bệnh được đối chiếu với trình tự gen bình thường trên ngân hàng gen thế giới và được phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến. Nếu sản phẩm đọc giải trình tự tinh khiết và có hiệu suất cao, các đỉnh tín hiệu sẽ sắc nhọn, cao và phân tách nhau rõ ràng, tín hiệu nền thấp, dễ dàng phân biệt từng nucleotid và nhận biết trạng thái đồng hợp tử/ dị hợp tử. Tuy nhiên, nếu dung dịch đem giải trình tự không tinh sạch sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ hoặc ức chế hoàn toàn, việc xuất hiện các tín hiệu nền nhiễu gây cản trở quá trình đọc trình tự gen và rất khó phân biệt đột biến và tín hiệu nhiễu cũng như xác định vị trí đột biến và loại đột biến. Các kết quả giải trình tự trong nghiên cứu này cho thấy hình ảnh các tín hiệu rõ ràng, gần như không có tín hiệu nhiễu chứng minh cho sự tối ưu các giai đoạn của quy trình kỹ thuật đã xây dựng trước đó.
Tuy kỹ thuật giải trình tự gen rất có giá trị nhưng có một số hạn chế. Kỹ thuật cần phải được tiến hành qua nhiều bước (tách chiết DNA, phản ứng PCR, giải trình tự chuỗi và phân tích trình tự); các đột biến điểm thường khó
phát hiện hơn các đột biến mất đoạn nên phải giải trình tự gen cả hai chiều. Bên cạnh đó các tín hiệu nhiễu có thể gây ra trường hợp sai sót trong kết quả, đòi hỏi người làm kỹ thuật phải có kinh nghiệm để đem lại kết quả chính xác nhất.
Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự gen đã được cải tiến rất nhiều, nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật huỳnh quang, PCR, điện di cùng sự trợ giúp của công nghệ hiện đại giúp cho việc giải trình tự gen trở nên đơn giản hơn và thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho việc phân tích bộ gen người cũng như nhiều loài vi sinh vật.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu này đã hoàn thiện quy trình xác định đột biến trên các exon: 5, 6, 27, 28 của gen ABCC8 ở bệnh nhân cường insulin. Trong 3 bệnh nhân, phát hiện được một bệnh nhân có đột biến g.83201 C>G tại vùng intron 27.
Med Genet, 46 (5), 289-299.
2. Đặng Ánh Dương, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Phú Đạt và cộng sự (2012). Cường insulin bẩm sinh nặng ở trẻ sơ sinh. Tạp chí Thông tin y dược, (7).
3. Vũ Chí Dũng (2014). “Hạ đường máu nặng do cường insulin bẩm sinh”. 4. Lê Thị Hồng Huệ (2001). “Nghiên cứu tình trạng giảm glucose máu ở trẻ
sơ sinh cân nặng thấp”. Luận văn Thạc sĩ.
5. Lê Thị Hồng (2003). “Hạ đường huyết sơ sinh”. Tạp chí y học thực hành
số 438, Bộ Y tế 44±83.
6. Phạm Nhật An (2012). Bài giảng Nhi khoa, Nhà xuất bản Y học.
7. Trần Bá Thoại, Trương Nguyễn Thoại Nhân. Hạ đường huyết kéo dài cường insulin ở nhũ nhi?.
8. Stanley C. A., (1997), ʺHyperinssulinism in infants and childrenʺ.
Pediatr Clin North Am. 44(2): 363-374.
9. Dekelbab BH, Sperling MA (2006). ʺRecent advances in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ. Acta Paediar 2006 Oct:
95(10): 1157-64.
10.Nguyễn Vượng (2000). ʺU tụy nội tiết – nghiên cứu miễn dịch –mô bệnh họcʺ. Kỷ yếu CTNCKH Nội tiết và các rối loạn chuyển hóa, Nxb Y học 526- ±8.
11.Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội (2009). Hạ đường máu, Bài giảng nhi khoa, Tập 1, Nhà xuất bản Y học, 197-203.
12.Flanagan S. E., Kapoor R. R., et al., (2010). ʺGenetics of congenital hyperinsulinemic hypoglycemiaʺ. Semin Pediatr Surg. 20(1): 13-17.
13.Senniappan S., Shanti B., et al., (2012). ʺHyperinsulinaemic hypoglycaemia: genetic mechanisms, diagnosis and managementʺ. J Inherit Metab Dis. 35(4): 589-601.
14.Arnosix J. B, Verkarre V, et al, (2010), “Congenitalhyperinsulinism curent trends in diagnosis and therapy”. Orphanet J Rare Dis. 663.
hyperinsulinism. Semin Pediatr Surg, 20(1) pp.32-37.
16.Modan-Moses D., Koren I., et al., (2011). ʺTreatment of congenital hyperinsulinism with lanreotide acetate (Somatuline Autogel)ʺ. J Clin Endocrinol Metab. 96(8): 2312-2317.
17.Sperling MA,Menon RK (2004). ʺDifferetial diagnosis and management of neonatal hypoglycemiaʺ. Pediatr Clin North Am 2004 Jun;51(3): 703-23 18.Hussain K., (2008). “Diagnosis and management of hyperinsulinaemic
hypoglycaemia of infancy”. Horm Res. 69(1): 2-13.
19.Aslamm, Safdar CA, Khailid A, A wans, Ahmed I, Ahmed Z (2004)
“Persistent hyperinsulinemic”.
20.Hardy OT, Hernandez-Pampaloni M and coll (2007). ʺDiagnosis and localization of focal congenital hyperinsulinism by 18F-fluorodopa PET scanʺ, J Pediatr. 2007 Feb; 150(2): 140-5.
21.Nguyễn Đắc Nhật (2001). “Nồng độ insulin máu của người Việt Nam bình thường”. Kỷ yếu CTNCKH Hội Nội tiết ± Đái tháo đường Việt Nam, Nxb Y học 370 ± 5.
22.Sempoux CH (2003). ʺPersistent neonatal hyperinsulinism: new pathological findings which clarify the physiopathology of the syndrome and direct therapeutic approachʺ. Bull Mem Acad R Med Belg: 158(5-6): 291-7.
23.Sawathiparnich P, Likitmaskul S, Angsusingha K, Nimkarn S and coll (2002). ʺPersistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy: experiences at Sirijai Hospitalʺ, J Med Assoc Thai 2002 Aug: 85 Suppl 2: 506-12.
24.Insulin: http://vi.m.wikipedia.org
25.Shah JH, Maguire DJ, Brown D, Cotterill A (2007). ʺThe role of ATP sensitive channels in insulin secretion and the implcations in persistent hyperinsulinemic hypoglycenima of infancyʺ. Avd Exp Med Biol 2007, 599: 133-8.
27.Phan Văn Duyệt, Nguyễn Đắc Nhật, Mai Thế Trạch (1987). “Định lượng phóng xạ miễn dịch học insulin ở người Việt Nam bình thường và mắc bệnh đái tháo đường”. Kỷ yếu chương trình y học hạt nhân 1981-1985, Nxb Y học 104±8.
28.Daredeliler F. Fournet JC, Bas F, Junien C, Gross MS, Bundak R, Saka N, Gunoz H (2002). ʺABCC8 (SUR1) and KCNJ11 (KIR6.2) mutations in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy and evaluation of different therapeutic measuresʺ. J Pediatr Endocrinol Metab, 2002 Jul- Aug; 15(7): 993-1000.
29.Mc Andrew HF. Smith V. Spitz L (2003). ʺSurgical complications of pancreatectomy for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ.
Pediatr Surg 2003 Jan: 38(1):13-6.
30.Tạ Thành Văn, (2010). “PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử”, Nhà xuất bản Y học.
31.Nguyễn Quỳnh Ngọc (2013). Phát hiện vi khuẩn actinobacillus actinomycetemcomitans gây viêm nha chu bằng kỹ thuật realtime PCR,