Sinh học phân tử của Human papillomavirus và các ứng dụng

Vi rút HPV (Human papillomavirus) được nhắc đến như một tác nhân gây tổn thương biểu mô ở cả nam và nữ, nổi bật nhất trong số đó là nguyên nhân chính gây ung thư cổ tử cung (UTCTC).

THỜI SỰ Y HỌC, Chuyên đề SỨC KHỎE SINH SẢN, Tập 18, Số 2, Tháng 12 – 2018 SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ CÁC ỨNG DỤNG PHẠM HỒ THÚY ÁI *, BÙI CHÍ THƯƠNG** V i rút HPV (Human papillomavirus) nhắc đến tác nhân gây tổn thương biểu mô nam nữ, bật số ngun nhân gây ung thư cổ tử cung (UTCTC) Mặc dù phân lập từ năm 1933 Richarch Shope đến 1976 Harald Zur Hausen tìm thấy mối liên quan vi rút HPV UTCTC kỷ nguyên cho việc tầm soát, phát sớm theo dõi điều trị hiệu ung thư mở SINH HỌC PHÂN TỬ Theo Ủy ban quốc tế phân loại vi rút (ICTV), trước năm 2001, HPV xếp vào nhóm Papillomavirus thuộc họ Papovaviridae sau số lượng tuýp ngày tăng lên nên Papillomavirus tách làm phân nhóm riêng HPV vi rút thuộc họ Papillomavirus có từ 120 đến 150 tuýp HPV, số 69 HPV tìm thấy người, cịn lại tìm thấy chim lồi bị sát, số chưa xác định Song song với phát triển ngành sinh học phân tử dịch tễ học, số tuýp HPV phát ngày tăng lên Đến tháng năm 2015, Trung tâm tham khảo HPV quốc tế đưa 200 tuýp HPV khác chia làm 49 phân nhóm người 131 tuýp HPV từ 66 phân nhóm động vật Mặc dù HPV tìm thấy nhiều nơi khơng có diện lớp biểu mô máu, tinh trùng, bánh hàng loạt nghiên cứu thấy mối liên quan mạnh mẽ nhiễm HPV với tiền ung thư UTCTC 11 Hiện tuýp HPV phụ thuộc vào chi Papillomavirus là: alpha- papillomavirus (α-PV), beta-papillomavirus (β-PV), gama-papillomavirus (γ-PV), mu- papillomavirus (µ-PV), nu- papillomavirus (ʋPV) Trong số đó, α-PV chủ yếu gây bệnh niêm mạc, β-PV chủ yếu gây bệnh da, nhánh lại đơn độc kết hợp gây bệnh khắp vùng thể da, hậu môn-sinh dục, miệng Trong vài năm tới HPV khác giải trình tự cơng nhận, giúp nhà sinh học lâm sàng thêm nhiều công cụ để định danh phát HPV tương lai Cấu trúc HPV khơng có vỏ bao, đường kính khoảng 55nm bao quanh capsid Mỗi capsid chứa 72 đơn vị protein gọi capsomer, tạo nên protein L1 (trọng lượng phân tử 5458kDa) protein phụ L2 (trọng lượng phân tử 68-76kDa) Chính cấu trúc khác biệt mà vi rút HPV khó * BS Bệnh viện Từ Dũ DĐ: 0918093412 Email: phamhothuyai@gmail.com ** TS.BS Bộ môn Sản ĐHYD TPHCM DĐ: 0913124604 Email: buichithuong@yahoo.com 26 THÔNG TIN CẬP NHẬT phát triển điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm, chúng định danh vào diện Nucleic Acid Khả tồn HPV lâu nhiệt độ -200C mà không bị giảm hoạt tính Các tính chất vi rút lưu ý xét nghiệm trình bảo quản mẫu HPV Hình 1.1 Cấu tạo vỏ lõi vi rút HPV Nguồn: Gerardo SL, Luis MD, Julio RL (2015) General aspects of structure, classification and replication of human papillomavirus Research Gate, 53(2), pp 166-171 Vật liệu di truyền HPV gồm hai chuỗi xoắn kép DNA, gen biểu thị sớm (E1, E2, E4, E5, E6, E7) gen biểu thị trễ (L1 L2) Các gen E mã hóa cho protein tham gia vào trình chép siêu vi Bên cạnh đó, gen L mã hóa tổng hợp protein vỏ siêu vi có độ bảo tồn cao chủng siêu vi khác nhau, vùng có vùng L2 phosphoryl hóa cao có khả gắn với DNA ký chủ Hình 1.2 Cấu trúc gen vịng đời vi rút HPV Nguồn: Alison A, McBride Karl Müngern (2018) Expert Views on HPV Infection Viruses, 10(2), 94 Trong số gen sớm gen E2 nhân tố quan trọng trình phiên mã tế bào cách ức chế biểu protein E6, E7 Trong tuýp HPV nguy cao sinh ung thư gen E6 đặc biệt lưu ý protein mã hóa từ gen E6 gồm 151 acid amin với cấu trúc CysX-X-Cys có khả gắn với bảng điều hòa dịch mã gây nhiều tác hại cho tế bào ký chủ Chủ yếu protein E6 gắn kết với protein p53, protein ức chế sinh ung, làm bất hoạt protein làm giảm khả ức chế khối u p53 Đồng thời kết hợp với protein E7 tăng kích thích tế bào chủ phân bào mạnh mẽ liên tục tạo nên tăng sinh khơng có điểm dừng đặc tính dẫn đến tử vong bệnh ung thư Gen E7 có cấu trúc tương tự gen E6 gồm 98 acid amin, liên kết chặt chẽ với gen E6, tương tác hỗ trợ lẫn q trình hóa tế bào ký chủ Gen liên kết với tế bào ký chủ thông qua liên kết protein-ribosome (pRB) khác với gen E6 liên kết thông qua protein p53 chung tác động ức chế khối u Đối với tuýp nguy cao lực liên kết pRB mạnh gấp 10 lần so với tuýp nguy thấp Ngoài gen E1 giúp cho hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP cần thiết cho chép vi rút Gen E4 trợ giúp cho trưởng thành phóng thích HPV khỏi tế bào mà khơng làm tiêu hủy tế bào ký chủ Bên cạnh gen E5 ngăn chặn chết theo chương trình có sai sót DNA vi rút gây Sau nhiễm trùng tiên phát, gen HPV trì Trong UTCTC, HPV DNA thường gắn kết vào DNA ký chủ hai vị trí E1 E2 Sự chèn DNA vi rút vào gen vật chủ thường làm gián đoạn gen E2 ảnh hưởng đến ức chế biểu protein hai gen sinh ung E6, E7 27 THỜI SỰ Y HỌC, Chuyên đề SỨC KHỎE SINH SẢN, Tập 18, Số 2, Tháng 12 – 2018 định kỳ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV chung 14,7%; tỷ lệ nhiễm riêng tuýp 16,18 tuýp nguy cao lại 2,7%, 0,8% 11,2% 14 Hình 1.3 Cấu trúc gen vi rút HPV tuýp 16 (A Chuỗi DNA đơi B Giải trình tự gen) Nguồn: Il-Seok Park et al (2011) Characterization of the Methylation Patterns in Human Papillomavirus Type 16 Viral DNA in Head and Neck Cancers American association for cancer research, 4(2), pp 207-217 Tất dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử để phân định tuýp, chủ yếu khác biệt vùng gen E6, E7, L1, khác biệt 10% so với tuýp biết trước định tuýp Theo nghiên cứu tháng năm 2018 tác giả Nedjai đưa giả thuyết mơ hình “chuyển đổi phân tử” methyl hóa gen EPB41L3 vùng cụ thể HPV16-L1/L2, HPV18-L2, HPV31-L1 HPV33-L2 trường hợp CIN3, methyl hóa khác biệt so với CIN1 từ biểu mơ bình thường tiến triển thành CIN1 đến CIN3 bị tác động týp HPV 10 HPV chia thành hai nhóm: nguy cao nguy thấp dựa vào khả gây ung thư chúng Nhóm nguy cao có mặt 90% trường hợp UTCTC bao gồm tuýp: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 82 Trái lại, nhóm nguy thấp bao gồm tuýp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 57, 61, 62, 72, 81, 83 lại gặp trường hợp ung thư 13 Nhóm nguy cao có khả sinh học đặc biệt xâm nhập vào tế bào chúng kết hợp cách ổn định với gen tế bào để tồn phát triển Trong tuýt 16 18 chiếm tỷ lệ sinh ung cao nhất, 70% lại chia cho týp khác, có khoảng 4.4% chưa xác định nguyên nhân Ghi nhận nghiên cứu công bố Hoa Kỳ vào tháng năm 2018, khảo sát 33.858 phụ nữ tầm soát 28 ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM TÌM HPV Hiện giới có nhiều loại xét nghiệm HPV dựa cấu trúc sinh học phân tử Human Papillomavirus: HPV DNA, HPV RNA, HPV protein, Cellular protein, FISH Mỗi xét nghiệm có ưu khuyết điểm khác thông dụng xét nghiệm HPV DNA Như đề cập đến phần 1.1, dựa vào cấu trúc DNA vỏ HPV bao gồm gen L1 E1 toàn gen để xác định có mặt DNA vi rút mẫu thử Đi tiên phong lĩnh vực xét nghiệm Amplicor (Roche), xét nghiệm định tính 13hr nguy cao dựa phát gen L1 tổng hợp protein vỏ vi rút Phát triển xét nghiệm HPV Cobas4800 (Roche) dựa sở phát gen L1 định danh phân nhóm tuýp 16, 18 nhóm gồm 12 tuýp nguy cao lại bao gồm 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 Xét nghiệm sử dụng nghiên cứu lớn Mỹ nghiên cứu ATHENA với cỡ mẫu 42.208 phụ nữ làm tế bào học HPV DNA 180.811 mẫu xét nghiệm phân tích năm 15 Từ nghiên cứu quy mô lớn này, tháng 4/2014 FDA phê duyệt xét nghiệm Cobas® HPV xét nghiệm tầm soát UTCTC đầu tay Mỹ xét nghiệm FDA công nhận xét nghiệm tầm soát UTCTC đầu tay Hướng dẫn soạn thảo Hiệp hội soi cổ tử cung bệnh lý cổ tử cung Hoa Kỳ (ASCCP) Hiệp hội Ung bướu phụ khoa (SGO) đại diện Hiệp hội Y khoa khác Hoa Kỳ Tháng 8/2015, Hiệp hội đưa hướng dẫn: Xét nghiệm Cobas® HPV xét nghiệm đầu tay tầm soát UTCTC cho phụ nữ 25 tuổi THÔNG TIN CẬP NHẬT xem thay phương pháp Hoa Kỳ dựa tế bào học Xét nghiệm Cobas® HPV bao gồm máy cobasx480 máy phân tích cobas z480 Nó có tính khai thác acid nucleic hồn tồn tự động kết hợp với công nghệ Real-time PCR Khác biệt xét nghiệm HPV DNA khác có chứng beta-globulin người không phát Globulin miễn dịch xét nghiệm phân loại khơng hợp lệ, việc xử lý DNA beta-globulin cịn có chức kiểm sốt mẫu vật âm tính thiếu tế bào hay có mặt chất ức chế PCR mẫu xét nghiệm Các kỹ thuật xét nghiệm HPV DNA bao gồm: PCR (polymerase chain reaction), phương pháp lai tạo (Hybrid Capture), Real-Time PCR (là kỹ thuật PCR khuếch đại DNA đích hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng) Nguyên tắc Real-time PCR DNA định lượng thời điểm sau chu kỳ phản ứng, nhờ có chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye) gắn vào DNA mạch kép dùng mẫu dò DNA oligonucleotide biến đổi để phát huỳnh quang lai với DNA bổ trợ Chu trình chạy PCR thiết kế bao gồm 18 primer 13 probe có gắn huỳnh quang tối ưu cho màu FAM, HEX, JA270, CY5.5 hệ thống Z480 Trong đó, FAM dùng để thị cho nhóm 12 tuýp 31; 33; 35; 39; 45; 51; 52; 56; 58; 59; 66; 68, HEX cho tuýp 16, JA270 cho tuýp 18, CY5.5 thị cho mẫu âm tính với 14 tuýp HPV nguy cao nêu Dựa vào biểu đồ khuếch đại màu sắc cài đặt cho nhóm tuýp HPV mà người xét nghiệm phân tích kết mẫu âm tính hay dương tính Trong trường hợp dương tính, hệ thống Cobas® 4800 rõ dương từ đến nhóm tuýp HPV nguy cao: 16, 18, hay nhiều tuýp nhóm 12 tuýp (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) Phương pháp PCR có ưu điểm độ nhạy cao, lượng mẫu nhỏ cần có đoạn DNA khuếch chẩn đốn, có nhược điểm xảy dương tính giả Để hạn chế vấn đề này, xét nghiệm có thêm chứng nội (Cobas), dụng cụ (kit) riêng biệt cho xét nghiệm cần tuân thủ quy trình kỹ thuật lấy mẫu bảo quản vận chuyển mẫu để tránh lây nhiễm chéo Kỹ thuật PCR dựa kết hợp hai đoạn oligonucleotic mồi vào chuỗi DNA bổ sung tín hiệu khuếch đại lên chu kỳ nhiệt Mỗi chu kỳ có giai đoạn nhiệt độ: 940C làm biến tính DNA thành sợi đơn, sau nhiệt độ giảm xuống 55-650C để đoạn mồi bắt cặp vào hai đầu sợi đơn, cuối men polymerase tác động nhiệt độ 720C kéo dài nucleotic lại với tổng hợp sợi bổ sung Mỗi chu kỳ thành công làm tăng gấp đôi sợi DNA Nhờ lai dắt với đầu dò oligonucleotic đánh dấu định danh DNA tuýp HPV Dưới thời đại sinh học phân tử, kỹ thuật ngày sâu vào cấu trúc nhân vi rút để tăng độ đặc hiệu cho xét nghiệm, từ xét nghiệm tìm mRNA đời dựa vào phát gen E6-E7 mRNA mã hóa cho protein tham gia vào trình chép siêu vi Sản phẩm gen E6-E7 giữ vai trò làm thay đổi hình dạng tế bào, protein E6 kết hợp bất hoạt động ngăn chặn ung thư gen p53 Do vậy, phát gen E6-E7 có nghĩa có tượng chép gen vi rút cơng vào tế bào ký chủ, có khả gây biến đổi tế bào không nhiễm đơn Đại diện cho phương pháp xét nghiệm Aptima HPV theo nghiên cứu Castle (2015) Aptima Cobas nhạy với chẩn đoán CIN2+ phân tầng nguy nhiễm HPV nhau, hệ số Kappa 90,9% Aptima có độ đặc hiệu tăng nhẹ 63,1% so với 59,3%, P≤0,001 Trong nghiên cứu có xét nghiệm HPV chấp nhận lâm sàng HC2, Abbott RealTime HR-HPV (Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA), Cobas 4800HPV 29 THỜI SỰ Y HỌC, Chuyên đề SỨC KHỎE SINH SẢN, Tập 18, Số 2, Tháng 12 – 2018 (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, USA), Aptima HPV (Hologic Inc., Bedford, MA, USA) Cervista HPV HR (Hologic Bedford, MA, USA) có xét nghiệm HPV (+) sau điều trị dao động từ 18% đến dụng rộng rãi lĩnh vực tầm soát theo dõi bệnh lý CTC hướng đến tuýp nguy cao có khả gây ung thư, số xét nghiệm HPV không phổ biến khác định tuýp nguy thấp gây mụn Bảng 2.1 So sánh phương pháp xét nghiệm HPV 12 Cobas HPV Digene HC2 HP Cervista HPV APTIMA HPV Phát HPV DNA + + + Chứng nội + + Khơng có phản ứng chéo + 0 Lượng mẫu nhỏ 1ml + 0 + 14 tuýp nguy cao + + + kết xét nghiệm + 0 27% tùy xét nghiệm Trong số xét nghiệm HC2 HPV Aptima có tỷ lệ dương tính thấp (P