NGHIÊN cứu, SO SÁNH KHẢ NĂNG gây BỆNH TÍCH tế bào và một số đặc điểm SINH học PHÂN tử của VIRUS PRRS QUA các đời cấy CHUYỂN TRÊN môi TRƯỜNG tế bào MARC 145

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU, SO SÁNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH TÍCH TẾ BÀO VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS PRRS QUA CÁC ĐỜI CẤY CHUYỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC- 145 Người hướng dẫn Người thực Lớp MSV : PGS.TS Nguyễn Thị Lan : Triệu Thị Ánh : K54 – TYD : 543558 HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập rèn luyện mái trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội giúp hòa thiện nhân cách trình độ chun môn Tôi nhận quan tâm, dạy dỗ tận tình Thầy, Cơ giáo đặc biệt Thầy, Cô giáo công tác Khoa Thú y Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Thú y cho phép bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc đến Thầy, Cô giáo – người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội suốt q trình tơi thực khóa luận Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, người tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận Đồng thời tơi xin bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô giáo môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, anh chị cơng tác phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi thực đề tài, tạo điều kiện để hồn thành đề tài tốt Cuối tơi xin cản ơn gia đình, bạn bè người động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2013 Sinh viên Triệu Thị Ánh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .viii MỞ ĐẦU .1 1.2 Mục tiêu đề tài TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn 2.2.1 Căn bệnh 10 a Hình thái cấu trúc virus PRRS 10 b Phân loại Virus PRRS 12 c Khả gây bệnh sức đề kháng virus PRRS .12 d Đặc tính ni cấy virus PRRS .13 2.2.2 Dịch tễ học 14 2.2.2.1 Loài vật mắc bệnh, lứa tuổi mắc bệnh .14 2.2.2.2.Chất chứa mầm bệnh trình truyền lây 15 2.2.2.3 Cơ chế sinh bệnh .15 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích 17 2.2.3.1 Triệu chứng PRRS 17 2.2.3.2 Bệnh tích bệnh PRRS 18 2.2.4 Chẩn đốn phòng trị .19 2.2.4.1 Chẩn đoán 19 2.2.4.2 Biện pháp phòng điều trị .20 2.3 Nuôi cấy virus môi trường tế bào Marc-145 22 2.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu phân tích gen hệ gen virus 22 2.4.1 Kĩ thuật PCR (Polymearase chain reaction) 22 Hình 2.6 Mơ hình nguyên lý phản ứng RT-PCR 23 * Các bước tiến hành phản ứng PCR 23 2.4.2 Kĩ thuật điện di .24 ii 2.4.3 Kĩ thuật giải trình tự Gen .25 Phần .27 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Đối tượng .27 3.2 Nội dung .28 3.3 Địa điểm thực tập 28 3.4 Nguyên liệu 28 3.4.1 Mẫu virus nghiên cứu 28 3.4.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị 28 3.4.3 Hóa chất mơi trường .29 3.5 Phương pháp nghiên cứu 29 3.5.1 Phương pháp cấy chuyển virus PRRS tế bào Marc- 145 .29 3.5.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 31 3.5.3 Phương pháp RT-PCR 32 3.5.4 Phương pháp giải trình tự Gen .35 3.5.5 Phương pháp đọc kết 36 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết lựa chọn chủng virus PRRS cho nghiên cứu 37 4.2 Kết cấy chuyển virus qua đời 45 4.3 Kết giải trình tự đoạn ORF5 PRRSV qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 46 4.3.1 Kết phản ứng RT – PCR 46 4.3.2 Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển 47 4.3.3 Kết so sánh trình tự nucleotide virus PRRS đời cấy chuyển .49 Phần .56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 iii DANH MỤC BẢNG LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .viii MỞ ĐẦU .1 1.2 Mục tiêu đề tài TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn 2.2.1 Căn bệnh 10 a Hình thái cấu trúc virus PRRS 10 b Phân loại Virus PRRS 12 c Khả gây bệnh sức đề kháng virus PRRS .12 d Đặc tính ni cấy virus PRRS .13 2.2.2 Dịch tễ học 14 2.2.2.1 Loài vật mắc bệnh, lứa tuổi mắc bệnh .14 2.2.2.2.Chất chứa mầm bệnh trình truyền lây 15 2.2.2.3 Cơ chế sinh bệnh .15 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích 17 2.2.3.1 Triệu chứng PRRS 17 2.2.3.2 Bệnh tích bệnh PRRS 18 2.2.4 Chẩn đốn phòng trị .19 2.2.4.1 Chẩn đoán 19 2.2.4.2 Biện pháp phòng điều trị .20 2.3 Nuôi cấy virus môi trường tế bào Marc-145 22 2.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu phân tích gen hệ gen virus 22 2.4.1 Kĩ thuật PCR (Polymearase chain reaction) 22 Hình 2.6 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 23 * Các bước tiến hành phản ứng PCR 23 2.4.2 Kĩ thuật điện di .24 2.4.3 Kĩ thuật giải trình tự Gen .25 iv Phần .27 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Đối tượng .27 3.2 Nội dung .28 3.3 Địa điểm thực tập 28 3.4 Nguyên liệu 28 3.4.1 Mẫu virus nghiên cứu 28 3.4.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị 28 3.4.3 Hóa chất mơi trường .29 3.5 Phương pháp nghiên cứu 29 3.5.1 Phương pháp cấy chuyển virus PRRS tế bào Marc- 145 .29 3.5.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 31 3.5.3 Phương pháp RT-PCR 32 3.5.4 Phương pháp giải trình tự Gen .35 3.5.5 Phương pháp đọc kết 36 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết lựa chọn chủng virus PRRS cho nghiên cứu 37 4.2 Kết cấy chuyển virus qua đời 45 4.3 Kết giải trình tự đoạn ORF5 PRRSV qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 46 4.3.1 Kết phản ứng RT – PCR 46 4.3.2 Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển 47 4.3.3 Kết so sánh trình tự nucleotide virus PRRS đời cấy chuyển .49 Phần .56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao châu Á từ năm 2006 đến năm 2010 Error: Reference source not found Hình 2.2 Dịch bệnh PRRS Việt Nam năm 2007 .Error: Reference source not found Hình 2.3 Hình thái virus PRRS Error: Reference source not found Hình 2.4 Cấu trúc gen PRRSV Error: Reference source not found Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào.Error: Reference source not found Hình 2.6 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR Error: Reference source not found Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus Error: Reference source not found Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm .Error: Reference source not found Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm .Error: Reference source not found Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 72 gây nhiễm .Error: Reference source not found Hình 4.5 So sánh trình tự gen chủng PRRSV nghiên cứu .Error: Reference source not found Hình 4.6 Cây sinh học phân tử chủng Virus PRRS nghiên cứu Error: Reference source not found Hình 4.7 Kết phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 chủng 182 –NA Error: Reference source not found Hình 4.8 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng 182 – NA đời cấy chuyển thứ Error: Reference source not found vi Hình 4.9a So sánh trình tự nucleotide chủng 182- NA đời cấy chuyền .Error: Reference source not found Hình 4.9b So sánh trình tự nucleotide chủng 227-HY đời cấy chuyền .Error: Reference source not found Hình 4.9c So sánh trình tự nucleotide chủng 383 - HN đời cấy chuyển .Error: Reference source not found vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay kDa : Kilodalton LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MA : Monkey kidney cell MSD : Mistery Swine Disease OIE : Tổ chức thú y giới ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA : Ribonucleic acid SHFV : Simian hemorrhaghic fever virus viii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài: Đất nước ta trình hội nhập phát triển, với chiến lược tăng cường phát triển cơng nghiệp dịch vụ ngành nơng nghiệp đặc biệt lĩnh vực chăn nuôi Nhà nước toàn xã hội trọng đầu tư Trong ngành chăn ni lợn ngày chiếm vị trí quan trọng cấu kinh tế đất nước hiệu kinh tế mà mang lại Tuy nhiên, ngành chăn ni lợn nước ta nói riêng giới nói chung ln chịu đe dọa dịch bệnh khác Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn hay gọi bệnh “Tai xanh” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn với nòi giống, lứa tuổi có diễn biến phức tạp, xảy nghiêm trọng gây nhiều thiệt hại nặng nề PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại biểu triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao Bệnh gây sảy thai thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết lợn sơ sinh yếu, lợn chết trước sinh, còi cọc, chậm lớn Hiện có vacxin, nhiên chưa có nhiều nghiên cứu khả bảo hộ cho đàn lợn sản phẩm vacxin PRRS thương mại Bên cạnh có nhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có đột biến cao, tạo nhiều chủng có độc lực khác nhau, khó để kiểm sốt dịch bệnh Trong năm gần đây, nước ta có nhiều loại vacin nhập ngoại nhiên dịch bệnh sảy ra.Vì vây, để chủ động đạt hiệu cao công tác phòng chống dịch PRRS, Việt Nam cần có vacin chể từ chủng phân lập Do đó, để hiểu rõ chủng virus PRRS, để tìm chủng virus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin việc nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS qua đời cấy chuyển tế bào Marc-145, xác Dựa vào hình 4.6 chúng tơi vào phân tích nguồn gốc phát sinh chủng virus nghiên cứu thấy rằng: Chủng 383 - HN nằm nhánh phát sinh với nhánh phát sinh chủng PRRSV phân lập phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y Ba chủng virus nghiên cứu nằm nhánh phát sinh với chủng virus PRRS khác phân lập Trung Quốc (chủng JQ804986 CHINA) Các chủng 182 - NA chủng 227 - HY nằm nhánh phát sinh, chủng lại nằm nhánh lớn với chủng 383 – HN chủng virus JXA1 Trung Quốc Như vậy, qua việc lập sơ đồ phả hệ phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRSV nghiên cứu so sánh với số chủng khu vực giới dựa trình tự chuỗi gen ORF5 cho thấy Các chủng PRRSV mà chúng tơi nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với gần với số chủng Trung Quốc có chủng vacxin JXA1 4.2 Kết cấy chuyển virus qua các đời Thông qua việc đánh giá khả gây bệnh tích tế bào xác định tương đồng chủng virus phân lập tiến hành cấy chuyển chủng virus liên tục qua 20 đời môi trường tế bào Marc-145, để đánh giá khả gây bệnh tích tế bào tương đồng gen hệ sau với hệ trước Do điều kiện thời gian thực tập hạn chế, số lượng đời cấy chuyển tương đối nhiều tiến hành với chủng virus nên lựa chọn đại diện đời cấy chuyển: Đời 1, đời 5, đời 10, đời 15 đời 20 để tiến hành nghiên cứu khả nhân lên hệ virus nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus 45 Kết theo dõi nhân lên chủng virus PRRS môi trường tế bào Marc-145 đời thể khả gây bệnh tích tế bào thời điểm khác trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Khả gây bệnh tích tế bào các chủng virus qua các đời Chủng virus 182 - NA 227 - HY 383 - HN Giờ CPE (%) Đời 10 Đời 15 Đời Đời Đời 20 24h 0 0 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 40 100 50 100 40 100 45 100 50 100 40 100 45 100 50 100 40 100 45 100 50 100 40 100 45 100 50 100 40 100 Qua bảng 4.3 thấy rằng: khả nhân lên phá hủy tế bào theo dõi thời điểm định khơng có thay đổi nhiều đời, khả gây bệnh tích tế bào chủng virus đời cấy chuyển tương đối ổn định 4.3 Kết giải trình tự đoạn ORF5 PRRSV qua các đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 4.3.1 Kết phản ứng RT – PCR Sản phẩm RNA tổng số chủng virus PRRS đời nghiên cứu thu tách chiết khuếch đại kỹ thuật RT-PCR với tham gia enzyme chép ngược (Reverse Transcriptase) sử dụng cặp mồi ORF5 (đã trình bày phần phương pháp nghiên cứu) có khả phát virus PRRS thuộc chủng Bắc Mỹ chủng châu Âu (cặp mồi cho phép xác định đoạn gen virus PRRS có kích thước 603bp) để tạo đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA) Sản phẩm cDNA sau khuếch đại máy PCR điện di chụp ảnh 46 Kết phản ứng RT – PCR xác định PRRSV trình bày hình 4.7 603 bp Hình 4.7 Kết phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 chủng 182 –NA [Virus PRRS phát phản ứng RT – PCR với độ dài gen 603 bp, thang chuẩn M 100bp, giếng – mẫu đời Virus PRRS nghiên cứu (Lần lượt từ trái qua phải P1,P5, P10, P15, P20), giếng đối chứng âm, giếng đối chứng dương (VirusPRRS)] Chú thích: (P1, P5, P10, P15, P20: Là virus cấy chuyển đời 1, đời 5, đời 10, đời 15, đời 20) Sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng 603bp theo thiết kế mồi Kết tạo DNA chủng 182 - NA qua đời cấy chuyển thành công Sản phẩm điện di chủng 227 – HY chủng 383 – HN qua đời cấy chuyển cho kết tương tự Như chúng tơi khẳng định xác có mặt virus PRRS mẫu nuôi cấy chuyển đời môi trường tế bào Marc-145 4.3.2 Kết giải trình tự gen đời cấy chuyển Sau tiến hành kỹ thuật RT-PCR thu sản phẩm tiến hành tinh sản phẩm phản ứng RT-PCR Kit để loại bỏ hết thành phần dư thừa sau phản ứng Sản phẩm sau tinh DNA virus cloning với loại mồi đơn (mồi xuôi mồi ngược) để nhân nhanh số lượng theo chiều đoạn gene 47 Tinh sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự Kit cung cấp nhà sản xuất, sau tiến hành giải trình tự gene Quá trình giải trình tự thực nhờ vào máy giải trình tự Beckman coulter CEQ 8000 Mỹ phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y – Khoa Thú Y Kết biểu thị chương trình Geneetyx trình bày minh họa hình 4.8 Hình 4.8 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng 182 – NA đời cấy chuyển thứ Qua hình 4.8 cho thấy chất lượng giải trình tự tương đối tốt, đỉnh màu giản đồ thể loại nucleotide, loại nucleotide khác tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác đọc tia laser cho hiển thị màu tương ứng Adenine cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh cây, Cytosine cho màu đen Sau giải trình tự, chuỗi nucleotide thu xử lý phần mền phân tích máy tính Qua phân tích chúng tơi thu toàn đoạn gen ORF5 chủng virus số đời cấy chuyển nghiên cứu có độ dài 596bp 48 Như việc tách chiết RNA tổng số, trình thực RT-PCR giải trình tự thưc thành cơng Trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng qua đời nghiên cứu xác định 4.3.3 Kết so sánh trình tự nucleotide virus PRRS đời cấy chuyển Để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus PRRS phân lập số tỉnh Việt Nam Chúng tiến hành giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng virus nghiên cứu số đời cấy chuyển Để xác định tương đồng nucleotide đời cấy chuyển, qua thấy cụ thể mức độ biến đổi thành phần, trật tự nucleotide biến đổi cấu trúc gen chủng virus PRRS qua đời cấy chuyển Kết so sánh trình tự nucleotide chủng qua đời nghiên cứu xử lý phần mềm Genetyx thể hình 4.9 49 Hình 4.9a So sánh trình tự nucleotide chủng 182- NA các đời cấy chuyền 50 Hình 4.9b So sánh trình tự nucleotide chủng 227-HY các đời cấy chuyền 51 Hình 4.9c So sánh trình tự nucleotide chủng 383 - HN các đời cấy chuyển 52 Qua hình 4.9a, hình 4.9b, hình 4.9c chúng tơi thấy trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng PRRSV đời nghiên cứu có độ dài 596bp Kết so sánh cho thấy thành phần nucleotide đời cấy chuyển chủng virus khơng có thay đổi có thay đổi khơng đáng kể Cụ thể sau: - Chủng 182 – NA khơng có sai khác trình tự nucleotide đời cấy chuyển - Chủng 227- HN có sai khác trình tự nucleotide đời P5 so với đời cấy chuyển khác Sai khác vị trí nucleotide sau: 49 (CG) - Chủng 383- HY có sai khác trình tự nucleotide vị trí ncleotide là: 32(CG) 88 (AT) Sự sai khác diễn đời cấy chuyển là: + Đời P5 có sai sai khác với đời P1, P10, P15, P20 vị trí nucleotide sau: 32 (CG) + Đời P10 có sai sai khác với đời P1, P5, P15, P20 vị trí nucleotide sau: 88(A T) Như đời cấy chuyển chủng PRRSV khác từ nuclotide đến nucleotide Có thể thấy thành phần nucleotide chủng tương đối giống (sự sai khác không 0,33% tổng số nucleotide đoạn gen) Từ kết phân tích thành phần nucleotide so sánh đời cấy chuyển chủng virus nghiên cứu chúng tơi nhận thấy trình tự nucleotide đời cấy chuyển chủng virus khơng có sai khác có sai khác không đáng kể 4.3.4 Sự tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng PRRSV đời nghiên cứu 53 Từ kết giải trình tự đoạn gen ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đời cấy chuyển tiến hành thu thập xử lý chương trình MEGA5 để so sánh mức độ tương đồng nucleotide axitamin đời cấy chuyển Chúng thu kết quả: Chủng 182 -NA có tương đồng đời cấy chuyển với mức độ tương đồng đạt 100% Kết thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Mức độ tương đồng nucleotide các đời nghiên cứu chủng 182 – NA (%) P1 P5 P10 P1 100,00 P5 100,00 100,00 P10 100,00 100,00 100,00 P15 100,00 100,00 100,00 P15 P20 100,00 P20 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Chủng 227 – HY có mức độ tương đồng nucleotide thể bảng 4.6 Bảng 4.6 Mức độ tương đồng nucleotide các đời nghiên cứu chủng 227 – HY (%) P1 P5 P10 P15 P20 P1 100,00 P5 99,99 100,00 P10 100,00 99,99 100,00 P15 100,00 99,99 100,00 100,00 P20 100,00 99,99 100,00 100,00 100,00 Chủng 383 – HN có mức độ tương đồng nucleotide axitamin thể bảng 4.6 Bảng 4.7 Mức độ tương đồng nucleotide các đời nghiên cứu chủng 383 – HN (%) 54 P1 P5 P10 P15 P1 100,00 P5 99,99 100,00 P10 99,99 99,98 100,00 P15 100,00 99,99 99,99 100,00 P20 100,00 99,99 99,99 100,00 P20 100,00 Qua bảng 4.5, bảng 4.6, bảng 4.7 cho thấy sau cấy chuyển qua 20 đời virus PRRS tương đồng nucleotide đạt tỷ lệ cao Hầu hết chủng mức độ tương đồng nucleotide qua đời cấy chuyển đạt xấp xỉ 100% , chủng 182 - NA mức độ tương đồng đến 100%, chủng 227 HY chủng 383 - HN đạt từ 99,98% đến 100% Như thành phần nucleotide đời cấy chuyển chủng virus PRRS tương đối giống có sai khác khơng đáng kể Kết cho thấy chủng virus nghiên cứu có ổn định đặc tính di truyền đời cấy chuyển, nên đưa vào sinh học phân tử chúng nằm nhóm phân loại sinh học phân tử chủng virus phân lập 55 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y dựa kết nghiên cứu, thu số kết luận sau: Các chủng virus PRRS 182 – NA, 227 – HY 383 - HN phân lập tỉnh thành khác Việt Nam đủ điều kiện để tiến hành nghiên cứu Các chủng virus PRRS có mối quan hệ gần gũi với với chủng virus sử dụng làm vacin Trung Quốc Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus PRRS nghiên cứu có tính ổn định tương đối cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Trình tự nucleotide chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 không thay đổi có thay đổi khơng đáng kể 5.2 Kiến Nghị Để góp phần hồn thiện đề tài nghiên cứu mong muốn: Triển kai thực đề tài phạm vi rộng nghiên cứu với nhiều chủng PRRSV nhằm thu kết toàn diện hơn, đánh giá chủng virus gây bệnh chủ yếu nước ta Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gen đoạn gen lại virus PRRS tiến tới giải trình tự tồn hệ gen virus phát biến chủng để chế tạo vacin có hiệu phòng bệnh cao Việc sản xuất vacxin phòng bệnh virus PRRS gây Việt Nam giới vấn đề cấp bách Kết nghiên cứu gen ORF5 virus PRRS qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc145 mà thu nhận sở liệu sinh học phân tử cho nghiên cứu vacxin phòng bệnh PRRSV gây 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn (2007), Hướng dẫn phòng chống hội chứng Rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) Cục Thú Y (2007), Báo cáo Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), ’Một số hiểu biết virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn’, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp- sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007), ’Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản’, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Lê Văn Năm (2007), ’Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc đồng Bắc Bộ Việt Nam’, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Thanh (2007), ’Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS)’, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội William T.Christianson Han Soo Joo (2001), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS), Tạp chí KHKT Thú y, tập VIII - số – 2001, tr 74 - 86 Kết nghiên cứu chủng PRRSV cường độc Trung Quốc (Tian Kegong, Trung tâm kiểm soát dịch bệnh động vật Trung Quốc Bản dịch TS Nguyễn Hữu Nam cộng sự) II Tài liệu tiếng anh 57 Done SH, Paton DJ, White ME (1996), ‘Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS’: a revew, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects Br Vet J 152, pp 153 – 174 Forsberg, R., Storgaard, T., Nielsen, H.S., Oleksiewicz, M.B., Cordioli, P., Sala, G., Hein, J., Botner, A., 2002 The genetic diversity of European type PRRSV is similar to that of the North American type but is geographically skewed within Europe Virology 299, 38–47 Kim, H.S., Kwang, J., Joo, H.S and Frey, M.L 1993 Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Arch Virol., 133:477-483 Gao, Z.Q, Guo, X., Yang, H.C., 2004 Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Archives of Virology 149, 1341-1351 OIE, Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), chapter 2.6.5, www.oie.int Frederick A.Murphy, E.Paul J.Gibbs, Marian C.Horzinek, Michael J.Studdert, ‘Veterinary virology’(Third edition), chapter 34 Arteriviridae Nelsen CJ, GenBank, (1998), ‘Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RespPRRS MLV’, complete genome, May 15 Suazez P (2000), ‘Utrastructure pathogenesis of PRRS virus’, Vet Res 31, pp 47 – 55 Key, K.F., Haqshenas, G.Guenette, D.K., Swenson, S.L., Toth, T.E., Meng, X.J., 2001 Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates Veterinary Microbiology 83, 249–263 10 Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Lum MA (1995), ‘Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe’, Arch Virol 140:745-755 58 11 Tian K, Yu, Zhao, (2007), ‘Emergence of fatal PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark’, PLoS ONE (6), e526.doi: 10.137l/jouARNl Pone.0000526 59 ... Nghiên cứu, so sánh khả gây bệnh tích tế bào số đặc điểm sinh học phân tử virus PRRS qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-1 45” 1.2 Mục tiêu đề tài Xác định mức độ ổn định đặc tính sinh học phân. .. xác mắc bệnh PRRS gây sử dụng để phân lập virus ni cấy dòng tế bào Marc-1 45 Tế bào Marc-1 45 tế bào thích hợp để phân lập virus PRRS, virus nhân lên nhanh tế bào gây bệnh tích điển hình tế bào co... enzym thảm tế bào lớp Phân lập virus số loại tế bào tế bào đại thực bào phế nang lợn (PAM), tế bào MA-104, tế bào Marc-1 45, tế bào CL-2621 tế bào CRL-11171 - Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián