Ứng dụng các tiến bộ sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh lý di truyền hồng cầu

Thalassemia là bệnh lý di truyền hồng cầu do bất thường về số lượng hoặc chất lượng của α hay β globin. Tuy nhiên, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong tầm soát, chẩn đoán các đột biến thalassemia chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học ỨNG DỤNG CÁC TIẾN BỘ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ DI TRUYỀN HỒNG CẦU Huỳnh Minh Tuấn*, Trần Cơng Toại* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Thalassemia bệnh lý di truyền hồng cầu bất thường số lượng chất lượng α hay β globin Tuy nhiên, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử tầm soát, chẩn đoán đột biến thalassemia chưa phổ biến rộng rãi Việt Nam Phương pháp: Chẩn đoán bệnh lý thalassemia bệnh nhân thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ sau loại trừ nguyên nhân gây thiếu máu thường gặp khác nhiều loại kỹ thuật sinh học phân tử Gap-PCR, Reverse-Dot Blot Assay, QMPSF, MLPA, Array-CGH, giải trình tự, PCR với enzyme giới hạn để xác định nhiều loại đột biến khác hemoglobin Kết quả: 80% bệnh nhân mang đột biến thalassemia chẩn đoán áp dụng bước sàng lọc sinh học phân tử kết hợp với điện di hemoglobin HbH, HbE/HbE, β-thalassemia/α-triplication, αCs/αCs Dựa kết điện di hemoglobin, tỷ lệ HbA2 hay HbF cao thông số giúp hướng chẩn đoán α/β thalassemia Kết luận: Chẩn đoán sinh học phân tử có vai trị thiết yếu việc tầm soát nhiều loại đột biến khác gen globin, giúp nâng cao hiệu sàng lọc bệnh lý phức tạp di truyền hồng cầu Từ khóa: Thalassemia, α β globin, sinh học phân tử, tương quan kiểu hình-kiểu gen ABSTRACT ADVANCES IN MOLECULAR BIOLOGY IN DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF INHERITED HEMOGLOBIN DISORDERS Huynh Minh Tuan, Tran Cong Toai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 425 - 435 Introduction: Thalassemia is a heterogeneous group of genetic disorders of hemoglobin characterized by quantitative and/or qualitative defects of α and/or β globin chain synthesis However, the use of molecular diagnostic tools for screening, diagnosis and clinical management of thalassemic hemoglobin variants has not been widely introduced in Viet Nam Methods: Diagnosis of hemoglobin disorders by molecular approaches in patients with hypochromic microcytic anemia after excluding other common causes of chronic anemia All patients were screened by various molecular techniques including Gap-PCR, Reverse-Dot Blot Assay, QMPSF, MLPA, Array-CGH, Sequencing techniques, Digestion-PCR in order to characterize hemoglobin variants at different molecular levels Results: Approximately 80% patients carrying various common hemoglobinopathies were diagnosed by applying the molecular diagnostic procedure in combination with hemoglobin electrophoresis such as HbH, HbE/HbE, β-thalassemia/α-triplication, αCs/αCs High HbA2 or HbF level is a good indicator of β thalassemia on hemoglobin electrophoresis but a normal level can not exclude the disease while α-thalassemia has frequently a variable level of HbA2 depending on the number of intact α-globin gene Conclusion: Molecular diagnostic approaches play a key role in diagnosis and screening of different types of hemoglobin variants, improving the diagnostic yield of complex hemoglobin disorders * Bộ Môn Mô, Phôi, Di Truyền.Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: PGS TS BS Trần Công Toại ĐT: 0838683007 Email: toaiphd@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 425 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Keywords: Thalassemia, α/β globin, molecular diagnostic approaches, genotype-phenotype correlation đột biến vi đoạn nhân đoạn GIỚI THIỆU TỔNG QUAN nhiên đột biến điểm xảy locus alpha Bệnh lý di truyền hồng cầu bao gồm thường gặp Hemoglobin Constant bệnh lý liên quan đến hình thành, Spring (HbCs hay αCs)(24,34) phát triển trì chức dòng tế Bệnh lý β-thalassemia đột biến gen β bào hồng cầu Bệnh lý di truyền hồng cầu (HBB) nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11, phân phân loại thành nhóm bệnh lý vùng 11p15.4, HBB bao gồm exon, nằm trải thường gặp bao gồm: bất thường sinh dài 1,6 kb nhiễm sắc thể 11 mã hóa cho tổng hợp hemoglobin, bệnh lý men hồng chuỗi β-globin 147 acid amine với trọng lượng cầu bệnh lý màng hồng cầu Bệnh lý di phân tử 16 KDa Các đột biến gen HBB gây truyền hồng cầu bất thường nhiều dạng kiểu hình khác nhau, từ thiếu máu trình sản xuất hemoglobin hay bệnh thiếu nhược sắc hồng cầu nhỏ đến bệnh lý tán huyết máu vùng biển (thalassemia), phổ biến mạn tính ảnh hưởng đến phát triển, ứ đọng vùng Đông Nam Á, Ấn Độ Địa Trung sắt, gan lách to, bất thường hình thái học Hải(12) Việt Nam nước nằm vùng bệnh lý Cooley Các đột biến thường gặp dịch tễ sốt rét có tần suất cao tỷ lệ bệnh bệnh lý β -thalassemia βS, βC, βE nhân mang bệnh lý thiếu máu vùng biển βE phổ biến vùng Đông Nam Á bao gồm Bệnh thiếu máu vùng biển cân Việt Nam, Lào Campuchia(26,9) Các đột biến tổng hợp chuỗi α β thường gặp khác bao gồm β39, βTak, HBB:c.globin, đột biến gen α β globin 79A>G, HBB:c.92G>A, HBB:c.92+1G>A, βD-Punjab, Đột biến gen alpha gây bệnh lý alpha βO-arab Các loại đột biến β -thalassemia thường thalassemia (α-thalassemia) đột biến gen gặp Việt Nam codon 41/42 (-TCTT), codon 17 bêta gây bệnh lý bêta thalassemia (β(A→T), -28 (A→G), codon 71/72 (+A), IVSIIthalassemia) nt654 (C→T), IVSI-nt1 (G→T), codon 95 (+A) Alpha thalassemia đột biến gen HBA1 (Saovaros Svasti et al., 2002) Sự đa dạng kiểu HBA2 mã hóa cho tổng hợp α-globin HBA1 hình bệnh lý β-thalassemia tác HBA2 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể số động yếu tố sau như: đa dạng 16, vùng 16p13.3 Gen HBA1 HBA2 nhiều loại đột biến gen bêta khác (β+, β0 mang exon mã hóa cho protein chứa 142 hay MetHb ), tác động yếu tố biến acid amin, HBA1 HBA2 có kích thước lần đổi di truyền (genetic modifying factors) lượt 872, 864 pb có chung nguồn gốc yếu tố môi trường Sự tương tác yếu tố q trình tiến hóa HBA2 xem gây nhiều trở ngại cho việc phân tích mối HBA1 97% trình tự chuỗi nucleotide tương quan kiểu gen-kiểu hình cơng tác gen HBA2 tương đồng với gen HBA1 Các đột tham vấn di truyền lĩnh vực chẩn biến thường gặp bệnh lý α-thalassemia đốn tiền sản Chính lý nêu trên, bao gồm α-3.7, α-4.2 α-SEA (Southeast Asian type) phát triển nhiều loại kỹ thuật chẩn đoán tạo trình trao đổi đoạn chéo phân tử chuyên biệt kết hợp với kiện lâm không cân hay NAHR (Non Allelic sàng, xét nghiệm chuyên biệt bệnh lý Homologous Recombination) Các đột biến hồng cầu kỹ thuật điện di hemoglobin thường gặp khu vực Đơng Nam Á giúp đưa chẩn đoán xác định thiết lập đột biến α-SEA dạng đột biến vi đoạn tương quan kiểu gen-kiểu hình mà kỹ vùng 16p13.3 gây gen HBA1 thuật phân tử đơn thực HBA2 Đa số đột biến xảy locus alpha Hiện nay, nhiều phương pháp chẩn đoán 426 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 sinh học phân tử ứng dụng phòng xét nghiệm di truyền bao gồm: GapPCR, MLPA, PCR với enzyme giới hạn, ArrayCGH, giải trình tự QMPSF giúp chẩn đoán nhiều loại bệnh lý di truyền hồng cầu nhiên ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán chưa phổ biến Việt Nam Phương pháp tiêu chuẩn sàng lọc phân tử Bệnh nhân thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ tiến hành sàng lọc đột biến kỹ thuật phân tử khác dựa triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm thường quy chuyên biệt bao gồm công thức máu kết điện di hemoglobin 95% bệnh nhân có dấu hiệu thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ công thức máu thường quy không rõ nguyên nhân lâm sàng có định tiến hành xét nghiệm sàng lọc sinh học phân tử Các xét nghiệm sàng lọc phân tử phân làm hai loại chính: xét nghiệm sàng lọc đột biến α-thalassemia xét nghiệm sàng lọc phân tử β-thalassemia Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử bệnh lý thalassemia Kỹ thuật Gap-PCR Đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp phù hợp điều kiện thực tế Việt Nam Kỹ thuật cho phép phát đột biến α-thalassemia bao gồm: α-3.7, α-4.2, α-SEA αααanti-3.7 qua việc sử dụng cặp mồi cần thiết cho khuếch đại gen HBA1 HBA2 Sản phẩm khuếch đại gen HBA1 HBA2 2.1 kb 1.9 kb Đột biến α-3.7 cho kích thước gần giống α2 mix α1 1,9 kb, đột biến α-4.2 cho kích thước 1,6 kb, α-SEA cho kích thước 1,3 kb αααanti-3.7 có kích thước 2,1 kb mix α2 Nhược điểm kỹ thuật GapPCR độ đặc hiệu thấp dương tính giả, cần hỗ trợ kỹ thuật chẩn đoán phân tử khác Kỹ thuật không phát αααanti-4.2 Kỹ thuật RDBα (α Reverse Dot-Blot Assay) Nghiên cứu Y học Kỹ thuật dùng để phát 21 đột biến thường gặp gen HBA1 HBA2 bao gồm α-3.7, α-4.2, α-SEA, αααanti-3.7, α-MED, α-FIL, αTHAI, α-20,5 kb, α1 cd 14 (TGG>TAG), α1 cd 59 (GGC>GAC) (Hb Adana), α2 init cd (ATG>ACG), α2 cd 19 (-G), α2 IVS1 (-5nt), α2 cd 59 (GGC>GAC), α2 cd 125 (CTG>CCG) (Hb Quong Sze), α2 cd 142 (TAA>CAA) (Hb Constant Spring), α2 cd 142 (TAA>AAA) (Hb Icaria), α2 cd 142 (TAA>TAT) (Hb Paksé), α2 (TAA>TCA) (Hb Koya Dora), α2 poly A-1 (AATAAA-AATAAG), α2 polyA-2 (AATAAA-AATGAA) ADN bệnh nhân tiến hành khuếch đại theo mix PCR bao gồm A1, A2 B Mỗi mix bao gồm hỗn hợp đệm phản ứng, enzyme Taq polymerase 5µl ADN Sản phẩm khuếch đại PCR điện di gel agarose 2% để kiểm tra trước cho tiến hành lai teststrip Ưu điểm kỹ thuật alpha RDB Assay độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiên độ nhạy cao mà đơi cho kết dương tính giả Alpha RDB Assay xét nghiệm nhanh, hiệu cao giúp tầm soát nhanh chóng 21 đột biến thường gặp bệnh lý α-thalassemia Xét nghiệm thường sử dụng hỗ trợ cho kỹ thuật Gap-PCR MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) Kỹ thuật giúp phát đột biến vi nhân đoạn, phổ biến kit MLPA MRC-Holland ADN bệnh nhân tiến hành cho biến tính lai với đoạn dị đặc hiệu, vùng ADN lai tạo thông thường với hai đoạn dị hai đoạn dị có chứa đoạn Stuffer, đoạn ADN đặc hiệu khác cho đoạn dị Các đoạn ADN biến tính lai với dị sau gắn kết lại với nhờ enzyme ligase để tạo ADN chuỗi kép, sau ADN chuỗi kép khuếch đại phản ứng PCR Các sản phẩm PCR sau chạy máy phân tích tiến Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 427 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 hành tách biệt sản phẩm PCR có kích thước khác Ưu điểm kỹ thuật MLPA độ nhạy đặc hiệu cao nhược điểm chi phí cao, tốn nhiều thời gian để thực kỹ thuật Kỹ thuật MLPA dùng kết hợp với kỹ thuật Gap-PCR αRDB để hỗ trợ và/hoặc khẳng định chẩn đoán Kỹ thuật Array-CGH chuyên biệt cho locus alpha bêta ADN bệnh nhân chứng cho tiến hành lai tạo đánh dấu Cya5 Cya3 ADN đánh dấu tiến hành tinh lọc cho lai hệ thống vi lưới ADN đặc hiệu với 13.921 đoạn dò cho locus alpha bêta Đây kỹ thuật dùng để phát đột biến vi đoạn nhân đoạn khơng điển hình hai locus Nhược điểm kỹ thuật chi phí cao địi hỏi trang thiết bị thực Phương pháp giải trình tự HBA1 HBA2 Gen HBA1 HBA2 có trình tự chuỗi nucleotide tương tự 97% cần phải sử dụng đoạn mồi ngược đặc hiệu để khuếch đại gen HBA1 HBA2 Giải trình tự giúp phát đột biến mà kỹ thuật nêu bị giới hạn, ví dụ : HbCs, đột biến đuôi polyA, Hb Adana, Hb Agrinio Kỹ thuật QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments) Kỹ thuật QMPSF-β sử dụng nhiều cặp đoạn mồi khác phản ứng PCR hay PCR multiplex, đoạn mồi đánh dấu huỳnh quang đầu 5' đoạn mồi xuôi, phân tử huỳnh quang thường sử dụng 5-FAM, NED HEX cho màu xanh dương, vàng xanh Mỗi cặp đoạn mồi cho sản phẩm khuếch đại PCR có kích thước khác tách biệt tiến hành điện di mao quản máy giải trình tự ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Life Technology) Kỹ thuật QMPSF dùng để phát vi đột biến nhân đoạn gen HBB(28) 428 Kỹ thuật giải trình tự gen β Gen HBB chia thành đoạn khác khuếch đại phản ứng PCR với tên gọi A, B, C, D, E Mỗi đoạn khuếch đại cặp đoạn mồi chuyên biệt Cặp đoạn mồi A dùng để khuếch đại promotor (vùng gen khởi động), đoạn mồi B dùng để khuếch đại exon 1, đoạn mồi C dùng khuếch đại exon 2, đoạn mồi D dùng khuếch đại exon sau đoạn mồi E dùng để khuếch đại vùng 3'UTR PCR-digestion Phương pháp sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR sau tiêu hóa enzyme giới hạn, tùy loại đột biến mà tạo vị trí cắt khác chuyên biệt cho enzyme, từ ta lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp βS đột biến thường gặp gây bệnh lý hồng cầu hình liềm hay Sickle cell disease, thường gặp chủng tộc da đen quốc gia Phi châu 123456789M 687 bp bp 435 235 bp202 bp 162 Hình 1: Ứng dụng kỹ thuật PCR-Digestion chẩn đoán tiền sản βS : (M) Marker, (1) Cha mang βS dị hợp tử (2) Mẹ mang βS dị hợp tử (3) (4) Thai nhi mang βS dị hợp tử (5) Chứng mang βS dị hợp tử (6) Chứng mang βS đồng hợp tử (7) Chứng bình thường (8) Chứng mang βS βC (9) Sản phẩm PCR không xử lý enzyme giới hạn Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Một ví dụ điển hình chẩn đốn đột biến β phương pháp enzyme giới hạn qua việc sử dụng cặp đoạn mồi khuếch đại chuỗi trùng hợp (PCR) với sản phẩm sau 687 bp, sau sản phẩm khuếch đại tiêu hóa enzyme giới hạn Bsu36I, enzyme cắt ADN vị trí 5' CC↓TNAGG 3' Sản phẩm allele đột biến βS cho kích thước 437 bp ngược lại, sản phẩm allele βA cho sản phẩm 235 bp, 202 bp Đây kỹ thuật tương đối đơn giản dùng để chẩn đoán nhanh đột biến thường gặp gen HBB βE, βC, βD-Punjab, βO-arab Ngồi ra, kỹ thuật cịn sử dụng góp phần hỗ trợ khẳng định chẩn đốn với kỹ thuật khác giải trình tự tầm soát tiền sản đột biến thường gặp βthalassemia S Điện di Hemoglobin Các phương pháp điện di hemoglobin thông thường bao gồm : Acide/Alkaline Electrophoresis, IsoElectric Focusing (IEF), HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (Urrechaga, 2012) CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Acid/Alkaline electrophoresis dựa khác biệt điện tích phân Nghiên cứu Y học tử hemoglobin, hemoglobin tích điện âm di chuyển cực dương (Anode) Kỹ thuật IEF dựa khác biệt điện tích phân tử hemoglobin tiến hành điện di, phân tử hemoglobin di chuyển thạch agarose môi trường PH từ đến ngừng lại vị trí đẳng điện Hai phương pháp điện di hemoglobin sử dụng rộng rãi HPLC CZE(14) Cả hai phương pháp HPLC CZE tiến hành điện di hemoglobin dựa tích điện phân tử, kết điện di hemoglobin bình thường cho kết với HbA2 khoảng từ 2,1% đến 3,1%, HbF thường 1% HbA khoảng 97% CZE có độ đặc hiệu cao HPLC độ nhạy thấp thường bỏ sót đột biến nhiên HPLC phân tách số dạng đột biến hemoglobin HbE HbA2, HbH Hb Bart's Do đó, tiến hành phân tích kiểu hình dạng đột biến khác điện di hemoglobin, theo khuyến cáo nên sử dụng kết hợp nhiều phương pháp tầm soát khác để hỗ trợ chẩn đoán Kết ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp điện di hemoglobin tầm soát đột biến thalassemia Hemoglobin Constant Spring (αCs) Hình 2: Kết xét nghiệm di truyền: (A) Gap-PCR α1α2 cho kết âm tính (B) RDBα cho kết HbCs đồng hợp tử (C) kiểm chứng lại giải trình tự α2 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 429 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Bệnh nhân nữ, 21/12/1978, đến khám thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ, xét nghiệm sắt với kết định lượng ferritine 595µg/L Phết máu ngoại biên cho thấy bất thường tế bào hồng cầu với nhiều chấm sẫm bắt màu kiềm (hématies ponctes), tế bào hồng cầu có nhiều kích thước khác (anisocytose), xuất tế bào đẳng sắc (normochromie) nhược sắc (anisochromie) Xét nghiệm điện di hemoglobin với HbA2: 1,7%, HbF: 2,9%, HbA: 91,6% HbX: 3,8% Số lượng tế bào hồng cầu: 4,22 x 106/µl, Hb: 10,3g/dl, Hct: 43%, VGM: 80,6fl, TCMH: 24,4pg, CCMH: 30,3g/dl, IDR: 15,2 Bệnh nhân tiến hành xét nghiệm di truyền với Gap-PCR âm tính, αRBD assay giải trình tự gen α1α2 cho kết Hb Constant spring (HbCs) đồng hợp tử(16) Đột biến điểm gen HBA1 (Hb Grady) Bệnh nhi nữ sinh ngày 05/04/2014, bệnh nhân đến làm xét nghiệm di truyền thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ Kết điện di hemoglobin với HbA: 87,2%, HbA2: 1%, HbF T dạng đột biến β+ nặng thường khơng cho kiểu hình dạng thể lâm sàng nặng với ứ đọng ferritine cao có khơng tương quan kiểu gen-kiểu hình Đột biến bất thường gen HBB hemoglobin có tính cao với oxygen Bệnh nhân nữ, sinh ngày 17/07/1968 đến khám định làm xét nghiệm di truyền bệnh lý đa hồng cầu với công thức máu sau hồng cầu: 5,1x106/µl, Hb: 17,0 g/dl, Hct: 49,3%, VGM: 96,9fl, TCMH: 33,3pg, CCMH: 34,5g/dl, điện di hemoglobin HbA2: 2,2%, HbA: 97,8%, HbF: A (codon 109 Val>Met)(13) β-thalassemia vi đoạn locus β kết hợp với đột biến α A Hình 5: (A) Kết Gap-PCR cho locus β với M marker kích thước: B) Kết Gap-PCR cho locus α với M marker kích thước (1) Con mang αααanti-3,7/αα (2) Mẹ mang αααanti-3,7/αα (1) Bệnh nhân với đột biến HPFH3 (2) Chứng (+) với đột biến HPFH3 (3) Người lành không mang đột biến HPFH3 (4) Chứng (-) (3)Cha bình thường (4) Chứng bình thường (5) Chứng (+) αααanti-3,7/αα Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 431 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 tuần/lần Ứ đọng sắt gan cần điều trị chelateur hexade 250mg/ngày (IRM sắt gan 220umol/g) Siêu âm không phát lách to Mẹ bệnh nhân có cơng thức máu với Hb : 10g/dl, VGM: 68fl Hình 6: Giải trình tự gen β cho kết HBB:c.92+5G>C trạng thái đồng hợp tử Bệnh nhi nữ, sinh ngày 19/03/2015, nhập viện làm xét nghiệm di truyền thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ Hb: 8,4g/dl, VGM: 64fl, hồng cầu non 141.000/mm3 Điện di hemoglobin với HbA2: 0,8%, HbF: 93,3% HbA: 0% Tiền thân cha mang bất thường bệnh lý di truyền hồng cầu IVS-I-5nt G>C trạng thái dị hợp tử Bệnh nhân mẹ tiến hành làm xét nghiệm thường quy di truyền Mẹ bệnh nhân có kết xét nghiệm công thức máu thường quy sau hồng cầu: 5,73 x106/µL, Hb: 14,2g/dl, Hct: 42,5%, VGM: 74,2fL, TCMH: 24,8pg, CCMH: 33,4g/dl, hồng cầu lưới: 1.6% Bilan sắt sau Fer: 8,6 µmol/L (9-30.4), Transferrine: 0.48mg/L (0.51.67), Ferritine: 35 µg/L (10-125 µg/L) Điện di hemoglobin HbA2: 1,8%, HbF: 31% HbA: 67,2% Phết máu ngoại vi cho thấy hồng cầu có kích thước nhỏ (microcytosis) Kết xét nghiệm di truyền cho thấy bệnh nhân mang loại đột biến khác với IVS-I5nt G>C hay HBB:c.92+5 G>C di truyền từ cha vi đoạn locus β từ gen ψβ vùng 3'β di truyền từ mẹ (HPFH3) Ngoài ra, xét nghiệm gen α phát bệnh nhân mang αααanti-3,7/αα di truyền từ mẹ Bệnh nhân vi đoạn khơng điển hình locus α Bệnh nhân nữ, sinh ngày 09/11/1975, đến khám mệt mỏi kéo dài bất thường điện di Hemoglobin với HbH 12%, công thức máu với Hb: 12.3g/dl, VGM: 67fl, TCMH: 21pg Bệnh nhân tiến hành truyền máu 432 Hình 7: Kết Array-CGH cho thấy vi đoạn 16p13.3, toàn locus α với kết arr(hg19)16p13.3(84,980-250,896)x1 mat, 431 đoạn mồi bị lệch, log2ratio =-038 Đột biến βE đồng hợp tử Bệnh nhân nữ sinh ngày 28/09/1982, nhập viện thiếu máu nhược sắc hồng cầu nhỏ bất thường điện di hemoglobin Công thức máu với hồng cầu: 4.42x106/µl, Hb: 9.6g/dl, Hct: 30,6%, VGM: 69.2fl, TCMH: 21.7pg, CCMH: 31,4g/dl, IDR: 15,6%, hồng cầu lưới: 3.03% Xét nghiệm G6PD với G6PD: 173mU/10.9 hồng cầu (120-240) điện di hemoglobin HbA: 0%, HbF: 2,6%, HbE: 80% Sinh hóa cho kết sau LDH: 341Ui/ml, bilirubin tồn phần: 8µmol/L, bilirubin kết hợp: 1µmol/l, bilibrubine gián tiếp: 7µmol/l, haptoglobine: 0.3g/l, Fer: 20µmol/l, Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 transferrine: 3.06g/l, độ bảo hịa transferrine: 26% ferritine: 37µg/l Hình 8: Giải trình tự gen HBB cho kết βE đồng hợp tử Hb E (β26(B8) Glu>Lys, GAG>AAG hay HBB:c.79G>A) HBB:p.Q26K (Edison ES et al., 2011; Fucharoen S et al., 2012) BÀN LUẬN Bệnh lý hemoglobin bệnh lý di truyền phức tạp liên quan đến gen α β, tương tác đột biến α β gây nhiều loại kiểu hình thalassemia khác nhau, kết cân chuỗi α β trình tổng hợp hemoglobin Sự kết hợp nhiều loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử cho phép tầm soát đột biến nhiều mức độ phân tử khác từ vi đoạn locus α β đến đột biến điểm mà việc ứng dụng kỹ thuật riêng lẻ bỏ sót việc tầm sốt đột biến Ngồi ra, kết hợp phân tích mối tương quan kiểu gen-kiểu hình bao gồm công thức máu, đặc biệt điện di hemoglobin, phân tích phả hệ, kiện lâm sàng giúp ích lớn định hướng chẩn đoán, thiết lập mối tương quan dạng đột biến với dạng biểu kiểu hình để từ góp phần hỗ trợ tham vấn di truyền, chẩn đoán tiền sản định hướng điều trị bệnh lý thalassemia thể nặng HbH đặc trưng tán huyết mạn tính, kết tụ chuỗi β globin, ứ đọng sắt thứ phát, rối loạn sản sinh hồng cầu, gan lách to (7) Người mang βE thường biểu có biểu lâm sàng với thiếu máu nhẹ kích thước hồng cầu nhỏ, nhiên đột biến βE kết hợp với đột biến β thalassemia cho bệnh cảnh lâm sàng β thlassemia điển hình từ thể trung bình đến thể nặng Đột biến αCs trạng thái dị đồng hợp tử thường cho kiểu hình lâm sàng với thiếu máu, ứ Nghiên cứu Y học đọng sắt đến truyền máu phụ thuộc Hơn nữa, phát triển sinh học phân tử ngày mở chiến lược việc hỗ trợ chẩn đoán điều trị phát yếu tố biến đổi di truyền liên quan đến yếu tố nguy cơ, tiên lượng liên quan đến tỷ lệ HbF bệnh lý thalassemia locus BCL11A, XmnI, dạng haplotype khác nhau, bệnh lý Gilbert kết hợp, G6PD (27,37,2) góp phần lớn tiên lượng, điều trị bệnh lý thalassemia Qua trường hợp lâm sàng cụ thể nêu trên, bệnh lý thalassemia chẩn đoán đơn kỹ thuật Gap-PCR trường hợp 4.4 với HbH đột biến thường gặp α-3,7 αSEA, đa dạng loại đột biến khác (đột biến hiếm) đột biến α kết hợp β đa số trường hợp cần kết hợp hai kỹ thuật chuyên biệt khác để có kết chẩn đốn phân tử (33,11) Các kỹ thuật RDBα, MLPA, Array-CGH có vai trị định hỗ trợ chẩn đoán cho kỹ thuật Gap-PCR, cho phép tầm soát đột biến nhiều mức độ phân tử khác bao gồm đột biến thường gặp locus α Các kỹ thuật giúp tầm soát đột biến locus β bao gồm QMPSF-β, giải trình tự Gap-PCR β Tuy nhiên, phân tích kiện lâm sàng, biểu kiểu hình có vai trị quan trọng hỗ trợ chẩn đốn (ví dụ trường hợp 4.5 phần kết quả) Sau cùng, muốn nhấn mạnh vấn đề dịch tể học bệnh lý thalassemia việc tầm soát đột biến thường gặp dân số nguy Việt Nam bao gồm βE, αCs, αSEA giúp tầm soát người mang dị hợp tử nhằm mục đích ngăn ngừa xuất thể nặng bệnh lý thalassemia Hydrops fetalis, HbH, HbE/β thalassemia, β0 thể dị hợp tử (11,6) việc phân tích tương quan kiểu gen-kiểu hình nhờ vào ứng dụng chặt chẽ xét nghiệm thường quy theo mơ hình "cơng thức máu-điện di hemoglobin-sinh học phân tử" KẾTLUẬN Kết hợp nhiều loại kỹ thuật phân tử khác tầm soát dạng đột biến α β có Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 433 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 tầm quan trọng chiến lược giúp nâng cao hiệu khẳng định chẩn đoán lâm sàng, thiết lập tương quan kiểu gen-kiểu hình, tham vấn, tiên lượng, điều trị bệnh lý thalassemia phức tạp Việt Nam 16 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 434 Alauddin H, Jaapar NA, Azma RZ, Ithnin A, Razak NF, Loh CK, Alias H, Abdul-Latiff Z, Othman A (2014) A case series of α-thalassemia intermedia due to compound heterozygosity for Hb Adana (HBA2: c179G>A (or HBA1); p.Gly60Asp) with other αthalassemias in Malay families Hemoglobin ;38(4):277-81 Ali N, Ayyub M, Khan SA, Ahmed S, Abbas K, Malik HS, Tashfeen S (2015) Frequency of Gγ-globin promoter -158 (C>T) XmnI polymorphism in patients with homozygous/compound heterozygous beta thalassaemia Hematol Oncol Stem Cell Ther Mar;8(1):10-5 Cao A, Kan YW (2013) The prevention of thalassemia Cold Spring Harb Perspect Med Feb 1;3(2):a011775 Charoenkwan P,Teerachaimahit P, Sanguansermsri T (2014) The correlation of α-globin gene mutations and the XmnI polymorphism with clinical severity of Hb E/β-thalassemia Hemoglobin ;38(5):335-8 Delacour H, Konopacki J, Plantamura J, Lacan P, Joly P (2016) Hb Hope (β136Gly→Asp) and Hb Grady (α119_120insGluPheThr) compound heterozygosity in a Mauritanian patient Clin Chem Lab Med Feb 1;54(2):e35-6 Edison ES, Shaji RV, Chandy M, Srivastava A (2011).Interaction of hemoglobin E with other abnormal hemoglobins Acta Haematol.;126(4):246-8 Farashi S, Najmabadi H (2015) Diagnostic pitfalls of less well recognized HbH disease.Blood Cells Mol Dis ;55(4):387-95 Farashi S, Faramarzi Garous N, Ashki M, Vakili S, Zeinali F, Imanian H, Azarkeivan A, Najmabadi H (2015) Hb Dartmouth (HBA2: c.200T>C): An α2-Globin Gene Associated with Hb H disease in One Homozygous Patient Hemoglobin.; 39(3):152-5 Filon D, Oppenheim A, Rachmilewitz EA, Kot R, Truc DB Molecular analysis of beta-thalassemia in Vietnam Hemoglobin 2000 May;24(2):99-104 Fucharoen S, Fucharoen G (2012) Hb H disease with various β hemoglobinopathies: molecular, hematological and diagnosticaspects Hemoglobin.;36(1):18-24 Fucharoen S, Weatherall DJ The Hemoglobin E Thalassemias (2012) Cold Spring Harb Perspect Med.;2:a011734 Fucharoen S, Winichagoon P Haemoglobinopathies in southeast Asia Indian J Med Res 2011 Oct;134:498-506 González Fernández FA, Villegas A, Ropero P, Carreño MD, Anguita E, Polo M, Pascual A, Henández A (2009).Haemoglobinopathies with high oxygen affinity Experience of Erythropathology Cooperative Spanish Group Ann Hematol Mar;88(3):235-8 Greene DN, Vaughn CP, Crews BO, Agarwal AM (2015) Advances in detection of hemoglobinopathies Clin Chim Acta Jan 15;439:50-7 He S, Zheng C, Meng D, Chen R, Zhang Q, Tian X, Chen S (2015) Hb H Hydrops Fetalis Syndrome caused by 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Association of the (SEA) Deletion and Hb Constant Spring (HBA2: c.427T>C) Mutation in a Chinese Family Hemoglobin ;39(3):216-9 He Y, Zhao Y, Lou JW, Liu YH, Li DZ (2016) Fetal Anemia and Hydrops Fetalis with Homozygous Hb Constant Spring (HBA2: c.427T>C) Hemoglobin Jan 13:1-5 Huisman TH, Miller A Hb Grady and alpha thalassemia: a contribution to the problem of the number of Hb alpha structural loci in man Am J Hum Genet 1976 Jul;28(4):363-9 Huisman TH, Wilson JB, Gravely M, Hubbard M (1974) Hemoglobin Grady The First Example of Variant with Elongated Chains Due to an Insertion of Residues Proc Natl Acad Sci U S A Aug;71(8):3270-3 Jamuar SS, Lai AH, Tan AM, Chan MY, Tan ES, Ng IS (2011) Use of deferiprone for iron chelation in patients with transfusion-dependent thalassaemia J Paediatr Child Health Nov;47(11):812-7 Javid B, Said-Al-Naief N Craniofacial manifestations of βthalassemia major (2015) Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Jan;119(1): e33-40 Jomoui W, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Nguyen VH, Fucharoen S (2015) Hemoglobin Constant Spring among Southeast Asian Populations: Haplotypic Heterogeneities and Phyloge netic Analysis PLoS One Dec 18;10(12):e0145230 Li YQ, Li R, Li DZ (2013) Detection of Hb Constant Spring (α142, Term→Gln, TAA>CAA (α2)) in heterozygotes combined with β-thalassemia Hemoglobin ;37(2):197-200 Megawati D, Nainggolan IM, Swastika M, Susanah S, Mose JC, Harahap AR, Setianingsih I (2014) Severe α-thalassemia intermedia due to a compound heterozygosity for the highly unstable Hb Adana (HBA2:c.179G>A) and a novel codon 24 (HBA2: c.75T>A) mutation Hemoglobin ;38(2):149-51 Nguyen HV, Sanchaisuriya K, Nguyen D, Phan HT, Siridamrongvattana S, Sanchaisuriya P, Fucharoen S, Fucharoen G, Schelp FP (2013) Thalassemia and hemoglobinopathies in Thua Thien Hue Province, Central Vietnam Hemoglobin.; 37(4): 333-42 Nguyen VH, Sanchaisuriya K, Wongprachum K, Nguyen MD, Phan TT, Vo VT, Sanchaisuriya P, Fucharoen S, Schelp FP (2014) Hemoglobin Constant Spring is markedly high in women of an ethnic minority group in Vietnam: a communitybased survey and hematologic features Blood Cells Mol Dis Apr;52(4):161-5 O'Riordan S, Hien TT, Miles K, Allen A, Quyen NN, Hung NQ, Anh Q, Tuyen LN, Khoa DB, Thai CQ, Triet DM, Phu NH, Dunstan S, Peto T, Clegg J, Farrar J,Weatherall D (2010) Large scale screening for haemoglobin disorders in southern Vietnam: implications for avoidance and management Br J Haematol Aug;150(3):359-64 Pakdee N, Yamsri S, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Pissard S, Fucharoen S (2014).Variability of hemoglobin F expression in hemoglobin EE disease : hematological and molecular analysis Blood Cells Mol Dis Jun-Aug;53(1-2):11-5 Pissard S, Raclin V, Lacan P, Garcia C, Aguilar-Martinez P, Francina A, Joly P.Characterization of three new deletions in the β-globin gene cluster during a screening survey in two French urban areas.Clin Chim Acta 2013 Jan 16;415:35-40 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Pornprasert S, Panyasai S, Treesuwan K (2012) Unmasking Hb Paksé (codon 142, TAA>TAT, α2) and its combinations in patients also carrying Hb Constant Spring (codon 142, TAA>CAA, α2) in northern Thailand Hemoglobin.; 36(5):491-6 Roberts WL, Frank EL, Moulton L, Papadea C, Noffsinger JK, Ou CN (2000) Effects of nine hemoglobin variants on five glycohemoglobin methods Clin Chem Apr;46(4):569-72 Scott AF, Phillips JA 3rd, Young KE, Kazazian HH Jr, Smith KD, Charache S, Clegg JB (1981) The molecular basis of hemoglobin Grady Am J Hum Genet Jan;33(1):129-33 Sheeran C, Weekes K, Shaw J, Pasricha SR (2014) Complications of HbH disease in adulthood Br J Haematol Oct;167(1):136-9 Singha K, Fucharoen G, Fucharoen S (2014).Five hemoglobin variants in a double heterozygote for α- and β-globin chain defects Acta Haematol.;131(2):71-5 Singsanan S, Fucharoen G, Savongsy O, Sanchaisuriya K, Fucharoen S (2007) Molecular characterization and origins of Hb Constant Spring and Hb Paksé in Southeast Asian populations Ann Hematol Sep;86(9):665-9 Sriiam S, Leecharoenkiat A, Lithanatudom P, Wannatung T, Svasti S, Fucharoen S, Svasti J, Chokchaichamnankit D, Srisomsap C, Smith DR (2012) Proteomic analysis of hemoglobin H-constant Spring (HbH-CS) eythroblasts Blood Cells Mol Dis Feb 15;48(2):77-85 Srivorakun H, Singha K, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Fucharoen S (2014) A large cohort of hemoglobin variants in Thailand: molecular epidemiological study and diagnostic co nsideration PLoS One Sep 22;9(9): e108365 Tatu T, Sritong W, Sa-Nguansermsri T (2014) The associations of SEA-alpha thalassemia 1, XmnI-Ggamma polymorphism and beta-globin gene mutations with the 38 39 40 41 42 Nghiên cứu Y học clinical severity of beta-thalassemia syndrome in northern Thailand J Med Assoc Thai Mar;97(3):300-7 Tritipsombut J, Phylipsen M, Viprakasit V, Chalaow N, Sanchaisuriya K, Giordano PC, Fucharoen S, Harteveld CL (2012) A single-tube multiplex gappolymerase chain reaction for the detection of eight β-globin gene cluster deletions common in Southeast Asia Hemoglobin ;36(6):571-80 Urrechaga E (2012) High-Resolution HbA1c Separation and Hemoglobinopathy Detection With Capillary Electrophoresis Am J Clin Pathol.;138:448-456 Wisedpanichkij R, Jindadamrongwech S, Butthep P (2015) Identification of Hb Constant Spring (HBA2: c.427T > C) by an Automated High Performance Liquid Chromatography Method Hemoglobin ;39(3):190-5 Yamsri S, Singha K, Prajantasen T, Taweenan W, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Fucharoen S (2015) A large cohort of β(+) - thalassemia in Thailand : molecular, hematological and diagnostic considerations Blood Cells Mol Dis 54(2):164-9 Yin XL, Zhang XH, Zhou TH, Zhang TL, Luo RG, Wang L, Zhou YL, Chen YS, Kong XJ, Liang B, He YY, Peng L, Lu LB, Fang SP, Wu ZK (2010) Hemoglobin H disease in Guangxi province, Southern China: clinical review of 357 patients Acta Haematol.;124(2):86-91 Ngày nhận báo: 05/03/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/03/2016 Ngày báo đăng: 15/04/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 435 ... tổng hợp hemoglobin, bệnh lý men hồng chuỗi β-globin 147 acid amine với trọng lượng cầu bệnh lý màng hồng cầu Bệnh lý di phân tử 16 KDa Các đột biến gen HBB gây truyền hồng cầu bất thường nhiều... 2016 sinh học phân tử ứng dụng phòng xét nghiệm di truyền bao gồm: GapPCR, MLPA, PCR với enzyme giới hạn, ArrayCGH, giải trình tự QMPSF giúp chẩn đốn nhiều loại bệnh lý di truyền hồng cầu nhiên ứng. .. gen β bào hồng cầu Bệnh lý di truyền hồng cầu (HBB) nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11, phân phân loại thành nhóm bệnh lý vùng 11p15.4, HBB bao gồm exon, nằm trải thường gặp bao gồm: bất thường sinh dài