Một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus du và NT trong sản xuất các sinh phẩm
Bộ GIáO DụC V ĐO TạO Bộ Y Tế VIệN Vệ SINH DịCH Tễ TRUNG ƯƠNG H NộI LÊ THị LOAN MộT Số ĐặC TíNH SINH HOá, MIễN DịCH V SINH HọC PHÂN Tử CủA CáC CHủNG BACILLUS Du v NT TRONG SảN XUấT các SINH PHẩM Chuyên ngành: Vi Sinh học M số: 1. 05. 12 TóM TắT LUậN áN TIếN Sĩ sinh HọC H NộI - 2006 Công trình đợc hoàn thành tại : - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng. Ngời hớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. LÊ VĂN HIệP 2. TS. PHAN LÊ THANH Hơng Phản biện 1: PGS. TS. TRƯƠNG NAM HảI Phản biện 2: PGS. TS. LÊ VĂN PHủNG Phản biện 3: TS. PHạM HùNG VÂN Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng Hà Nội. vào hồi giờ ngày tháng năm 200. Có thể tìm hiểu luận án tại th viện Quốc gia và th viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng Hà Nội . DANH MụC CÔNG TRìNH Có LIÊN QUAN ĐếN LUậN áN 1. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Văn Phú( 2001), Bớc đầu tìm hiểu tác động của các loại Oligo-alginat đến qúa trình sinh trởng phát triển của Bacillus subtilis, tạp chí Y học dự phòng tập XI, số 4(50), trang 70-72. 2. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Thị Thanh Hà, Vũ Kim Quyên(2003) Nhận xét về sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis, tạp chí Y học dự phòng tập XIII, số 6(63), trang 97-99. 3. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Nguyễn Thị Kim Chi (2004)Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis dùng trong sản xuất sinh phẩm, tạp chí Y học thực hành, số 478, trg. 357-361. 4. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dơng Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh, Đinh Duy Kháng (2004) Cloning and sequencing of 16S ribosomal RNA genes from two Bacillus sp. Strains used as an oral probiotic product. (Kết qủa giải hai trình tự gen 16S ribosome của hai chủng Du và NT đăng ký vào Ngân hàng gen quốc tế ( EMBL/ GENEBANK) đã đợc công bố, EMBL Nucleotide Sequence Database, Số AJ842963. Bacillus sp. Du p[ gi: 52851158], AJ842964. Bacillus sp. NTp[ gi: 52851159], tháng 9 năm 2004). 5. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dơng Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh, Đinh Duy Kháng( 2005)Định loại các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dùng trong sản xuất Biosubtyl bằng trình tự gen 16S rRNA và đánh gía thành phần kháng nguyên giữa các chủng bằng Western Blot, tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 3, số 2, 2005, trang 201-206. Mở ĐầU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong một thời gian dài trớc đây, ngời ta quen dùng kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và cũng đã mang lại hiệu quả to lớn. Tuy nhiên, chúng cũng gây ra nhiều tác dụng phụ cho ngời sử dụng. Một trong những tác dụng phụ gây hậu qủa nghiêm trọng là gây rối loạn hệ vi sinh vật sẵn có trong đờng ruột dẫn đến rối loạn tiêu hóa. Theo thống kê của báo sức khỏe thì tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tử vong cho trẻ em ở các nớc đang phát triển và ớc tính hàng năm có tới 1.3 ngàn triệu lợt trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy và 4 triệu trẻ em chết vì bệnh này. Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, xu hớng ngày nay của thế giới là tập trung nghiên cứu những chế phẩm sinh học có gía trị trị liệu cao, không gây độc, hạn chế tác dụng phụ và không ảnh hởng đến cân bằng hệ vi sinh vật có ích trong đờng ruột. Phơng pháp dùng vi sinh vật sống đờng uống để điều trị các bệnh đờng ruột là một thành công lớn của nền y học thế giới. Đã có nhiều sản phẩm probiotic ra đời đợc làm từ Bacillus- là một loại vi sinh vật đợc sử dụng nhiều nhất trong các chế phấm sinh học dùng trong y học, nông nghiệp và thủy sản. Trên thị trờng Việt Nam cũng đã thấy xuất hiện nhiều chế phẩm sinh học có sử dụng Bacillus. Từ trên 20 năm nay, Viện Vắcxin và các chế phẩm sinh học đã sản xuất và lu hành trên thị trờng nhiều loại sản phẩm mang dấu ấn của Bacillus, một trong những sản phẩm quan trọng đợc nhiều ngời a chuộng và sử dụng nhất là Biosubtyl. Thành phần chính của Biosubtyl là chủng Bacillus subtilis. Tuy đã ra đời nhiều năm song Biosubtyl chỉ mới đợc chú trọng về mặt ứng dụng mà ch a có một nghiên cứu nào mang tính chất hệ thống về các tính chất sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus subtilis nhất là đối với những chủng phân lập đợc. Vì vậy đề tài đợc thực hiện với mong muốn khẳng định tính chất thuần chủng của các chủng Bacillus subtilis đang sử dụng trong sản xuất để góp phần nâng cao chất lợng sản phẩm và tiến tới tiêu chuẩn hóa Biosubtyl thành một mặt hàng có thể xuất khẩu đợc. 2. Mục đích nghiên cứu: 2.1. Xác định một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất. 2.2. Đề xuất các điều kiện nuôi cấy tối u để thu đợc hiệu suất sinh khối cao nhất. 3. Những đóng góp mới và giá trị thực tiễn của luận án Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu đầy đủ về các đặc tính sinh lý, sinh hóa, di truyền và miễn dịch của các chủng vi khuẩn dùng trong sản xuất chế phẩm Probiotic tại Việt Nam. 4. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 150 trang, 4 chơng, có 17 bảng, 42 hình, cấu trúc từng phần nh sau: Mở đầu 2 trang, chơng 1: Tổng quan tài liệu 43 trang, chơng 2: Đối tợng-vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 15 trang, chơng 3: Kết quả nghiên cứu 45 trang, chơng 4: bàn luận 10 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, danh mục các công trình có liên quan đến luận án 1 trang, phần tài liệu tham khảo 12 trang gồm 113 tài liệu trong đó tiếng Việt 24, tiếng Anh 89 và cuối cùng là phần phụ lục 21 trang. Chơng 1 : TổNG QUAN TI LIệU 1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus: 1.4.1. Hình thể và tính chất sinh vật hoá học: Bảng 1.2. So sánh các loài của Bacillus Đặc điểm B. subtilis B. pumilus B. cereus B. cereus var thuringiensis B. cereus var mycoides B. cereus var anthracis hình que đờng kính Chiều dài m Gram Bào tử Chuyển động Catalaza Phát triển kỵ khí Axit từ: glucoza arabinose xylose manitol Thủy phân tinh bột Sử dụng citrate KhửNO 3 ra NO 2 Phân hủy: cazein tyrozin 0.7- 0.8 2.0 3.0 + + + + + + + + + + + + + - 0.6 - 0.7 2.0 3.0 + + + + + + + + + - + - + - 1.0 - 1.2 3 5 + + - a + + - - - - + + + + 1.0 - 1.2 3 5 + + a a + + + - - - + + + + 1.0 - 1.2 3 5 + + - - + + + - - - + a + + 1.0 - 1.2 3 5 + + - - + + + - - - + b + + % giống với các đặc điểm: + : 85- 100%; a : 50- 84%; b : 15- 49%; - : 0- 14% [36 ], [38]. 1.7. Di truyền học và sinh học phân tử 1.7.1. Vectụ taùo doứng Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thớc nhỏ và chứa gen chọn lọc đợc sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN. Chúng đợc phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn, sau đó không ngừng đợc cải tiến với nhiều đặc tính quý: (1) Plasmit thế hệ thứ nhất nh ColE1, pSC101 nguồn gốc tự nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2) Plasmit thế hệ thứ hai nh pBR322 đợc thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính trạng quý của plasmit tự nhiên và đợc sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E. coli nhằm tạo dòng và nhân lên với lợng lớn. Chúng thờng chứa vùng sao chép trong E. coli, chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và vùng MCS. Plasmit pBR322 và các thế hệ vectơ biểu hiện có nguồn gốc từ pBR322 khá bền, tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ nuôi cấy ngay trong điều kiện không có kháng sinh chọn lọc. Tuy nhiên, trong một vài trờng hợp, plasmit có thể không bền vững khi protein tái tổ hợp có hoạt tính độc ảnh hởng đến sinh trởng của tế bào chủ; (3) Plasmit thế hệ thứ ba: nh pUC, pSP, pBluescript có kích th- ớc nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn. Để tách dòng gen mã hoá 16S ribosome và gen mã hoá -amylase của các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, chúng tôi sử dụng plasmit pCR 2.1 của hãng Invitrogen làm vector tách dòng. Đây là một trong các plasmit có hiệu quả tạo dòng rất cao. 1.7.2. Gen 16S ARN ribosome và ứng dụng Gen 16S ARN ribosome lần đầu tiên đã đợc xác định ở E. coli với 1520 bp [48].Và ngay sau đó ngời ta đã sử dụng gen này để nghiên cứu nguồn gốc phát sinh chủng loại ở các vi sinh vật procaryot nh Euglena gracilis [116], nghiên cứu sự khác biệt giữa các giống tảo đỏ (Rhodophyta), tảo lam (Anacystis nidulans) và các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis [35]. Chơng 2. Vật liệu v phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị máy móc 2.1.1.Vật liệu 2.1.1.1. Chủng giống - Trực khuẩn B. subtilis Trần Văn Du do bác sĩ Trần Văn Du phân lập từ Pháp trao cho bác sĩ Phạm Ngọc Thạch nghiên cứu năm 1952, từ năm 1983 Viện Vacxin sử dụng sản xuất Biosubtyl đến nay, đợc phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 19/1/1999. - Trực khuẩn B.subtilis NT nhập từ Banladesh dới tên B. subtilis đợc phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 15/9/2000. -Trực khuẩn B.subtilis ATCC 6633 nhập từ Viện Americal Type Culture Collection, đợc phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 20/3/2001. - Escherichia coli tên DH5, mua từ hãng Invitrogen ( Mỹ). 2.1.1.2. Các nguyên liệu khác: (1) Cặp mồi để khuếch đại gen 16S ARN ribosome có trình tự theo công bố của Green D.H. và cs [56]. Cặp mồi có trình tự: B16Sp1: AGAGTTTGATCATGGCTCA B16Sp2: AAGGAGGTGATCCAGCC (2) Cặp mồi để khuếch đại gen mã hóa amylase và của vi khuẩn B.subtilis: BsAmyP10 5-AAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGG BsAmyM30 5-GGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG Cặp mồi để khuếch đại gen mã hóa amylase của vi khuẩn B. subtilis đợc chúng tôi thiết kế dựa trên các trình tự gen này đã đợc công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế số đăng ký K00563 [111]. Các cặp mồi đợc tổng hợp nhờ Hãng Invitrogen (Mỹ). 2.2. Phơng pháp nghiên cứu A. Phần nghiên cứu sinh hóa 2.2.1. Phơng pháp nuôi cấy vi khuẩn để quan sát hình thái tế bào: 2.2.2. Tính chất sinh hóa: Tính lên men các loại đờng, tính nhạy cảm với kháng sinh. 2.2.3. Hoạt tính men của vi khuẩn 2.2.3.1. Khảo sát thời gian sinh hoạt tính men amylase và protease của các chủng nghiên cứu 2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính men amylase và protease trong sinh phẩm Biosubtyl (Biosubtyl DL loạt 16,17,18,19; Biosubtyl NT loạt 19,20,22,25). 2.2.5. ảnh hởng nồng độ oligo- alginat lên qúa trình sinh trởng- phát triển của Bacillus: Xử lý thống kê bằng phơng pháp so sánh số liệu từng cặp ( T test). 2.2.6. Khảo sát ảnh hởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử các chủng Du và NT trên môi trờng thạch dinh dỡng pH = 7,2, và trên môi trờng thạch Edwards. B. Phần nghiên cứu sinh học phân tử 2.2.7. Nuôi cấy và lu giữ các chủng vi khuẩn 2.2.8. Tách chiết và tinh sạch ADN plasmit, ADN genom 2.2.8.1. Tách chiết ADN plasmit của vi khuẩn E. coli 2.2.8.2. Quy trình tách chiết ADN plasmit của E. coli: 2.2.8.3. Tách chiết ADN Genom từ vi khuẩn thuộc chi Bacillus 2.2.9. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymeraza 2.2.10. Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế 2.2.11. Điện di :Điện di ADN trên gel agaroza; điện di protein trên gel polyacrylamit 2.2.12. Ghép nối các đoạn ADN 2.2.13. Chuẩn bị tế bào khả biến: Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli để biến nạp bằng sốc nhiệt. 2.2.14. Biến nạp ADN plasmit vào tế bào vi khuẩn: Biến nạp ADN plasmit vào tế bào E. coli bằng sốc nhiệt 2.2.15. Xác định trình tự nucleotit của gen Xử lý số liệu bằng phần mềm vi tính chuyên dụng C. Phần nghiên cứu miễn dịch 2.2.16. Kỹ thuật Western blot 2.2.17. Kỹ thuật gây miễn dịch sản xuất kháng thể Chơng 3. Kết quả 3.1. Hình thái tế bào và tính chất nuôi cấy Bảng 3.1. Một số đặc tính nuôi cấy của 3 chủng Bacillus Chủng VK Hình thái tế bào Kích thớc (àm) Hình thái khuẩn lạc Tính chất nuôi cấy Du Trực khuẩn Gram+, hai đầu vuông, xếp chuỗi dài 0.8-1 x 3.5- 4.5 dạng R, lồi ở giữa, bám chặt trên mặt thạch tạo váng dày, môi trờng trong NT Trực khuẩn Gram+, hai đầu vuông, không 0.6-1 x 1.5 - 3.1 dạng R, lồi ở giữa, bò lan tạo váng mỏng môi trờng hơi [...]... học phân tử của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất Biosubtyl có so sánh với chủng Bacillus subtilis chuẩn quốc tế ATCC6633, có thể rút ra một số kết luận sau đây: 1 Đặc tính sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất các sinh phẩm cho thấy: 1.1 Kích thớc chủng Du > ATCC6633 > NT Cả ba chủng đều nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh 1.2 Chủng Du. .. dinh dỡng pH = 7,2 Bảng 3.10 Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời gian và nhiệt độ nuôi cấy khác nhau trên môi trờng thạch dinh dỡng pH = 7,2 TGNC (giờ) LTN 24 48 Số lợng NĐNC bào tử x 8 ( 0C) 10 / ml hỗn dịch 72 96 Số lợng bào tử x 108/ ml hỗn dịch Số lợng bào tử x 108/ ml hỗn dịch Số lợng bào tử x 108/ ml hỗn dịch Du NT Du NT Du NT Du NT - - 25 34 32 27 35 36 51 63 60 55 64 58 23... ứng của các kháng thể kháng các chủng Bacillus NT, Du và ATCC6633 Protein toàn phần của tế bào vi khuẩn sau khi điện di biến tính trên gel polyacrylamid đợc chuyển qua màng PVDF Màng sau đó đợc nhuộm với các kháng thể có trong huyết thanh thỏ đợc gây miễn dịch với tế bào toàn phần của các chủng vi khuẩn khác nhau (NT, Du, ATCC6633) Kết luận Kết qủa nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, miễn dịch và sinh học. .. 99,81 % - Chủng Du có độ tơng đồng với các chủng thuộc các loài Bacillus cereus, Bacillus anthracis và Bacillus thuringiensis dao động từ 99,3 đến 99,6% 1.2.2 Trình tự gen mã hóa -amylase của các chủng Du, NT không tơng đồng với trình tự gen mã hóa -amylase của các chủng B subtilis 1.2.3 Khi gây miễn dịch với các chủng Du, NT và ATCC6633, các kháng thể đợc tạo ra không phản ứng giống nhau với các thành... hởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự hình thành bào tử Bacillus trên môi trờng thạch Edwards Bảng 3.11 Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời gian và nhiệt độ nuôi cấy trên môi trờng thạch Edwards LTN TGNC (giờ) 24 48 72 96 NĐNC Số lợng Số lợng Số lợng lợng Số 8 8 bào tử x bào tử x 10 / bào tử x 10 / bào tử x ( 0C) 108/ ml hỗn ml hỗn dịch ml hỗn dịch 108/ ml hỗn dịch dịch Du. .. tra sản phẩm cắt các plasmid với EcoRI để chọn các plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gen 16S ARN ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633 Sản phẩm cắt đợc điện di gel agarose 1% M: Chỉ thị phân tử (ADN lamda cắt bằng EcoRI và HindIII) 1, 8, 12: Sản phẩm PCR trớc khi gắn vào vector tách dòng 2, 7, 11: Sản phẩm PCR sau khi xử lý với EcoRI 3, 4: Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của chủng Du. .. Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S ribosome của chủng Du 7-11: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S ribosome của chủng NT 12-16: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S ribosome của chủng ATCC6633... Trình tự gen 16S ARN ribosome của chủng ATCC6633 Gen 16S ARN ribosome của chủng ATCC6633 do chúng tôi giải m có chiều dài 1542 cặp bazơ (bp) với 383 A, 362 C, 488 G và 309 T Một số thông tin về các trình tự gen 16S ARN ribosome của các chủng Du, NT, và ATCC6633 đã giải đợc nêu ở bảng 3.12 Bảng 3.12 Chủng Độ dài Số A Số C Số G Số T Tỷ lệ gen G+C Du 1544 394 349 477 324 53,5% NT 1540 382 361 486 311 55,0%... Chủng Du và chủng NT đều có khác biệt về mặt di truyền và miễn dịch so với chủng Bacillus subtilis chuẩn quốc tế ATCC6633 ở những điểm sau đây: 1.2.1 Trình tự nucleotide gen 16S ribosome của chủng Du có độ tơng đồng so với chủng ATCC6633 là 94% và chủng NT là 97% - Khi so với chủng thuộc loài Bacillus pumilus, chủng Du có độ tơng đồng về trình tự nucleotide gen 16S ribosome là 93,91 %, chủng NT là 99,81... dài 1544 cặp bazơ M: Chỉ thị phân tử (ADN cắt bằng Hind III và EcoR I) 1: Sản phẩm PCR từ chủng Du; 2: Sản phẩm PCR từ chủng NT; 3: Sản phẩm PCR từ chủng ATCC6633 1 2 3 4 5 6 K 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3.21 Điện di gel agarose 1% để chọn lọc các plasmid có kích thớc lớn hơn plasmid gốc (có khả năng là plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633) K: Đối chứng (plasmid . VIệN Vệ SINH DịCH Tễ TRUNG ƯƠNG H NộI LÊ THị LOAN MộT Số ĐặC TíNH SINH HOá, MIễN DịCH V SINH HọC PHÂN Tử CủA CáC CHủNG BACILLUS Du v NT TRONG SảN XUấT các SINH PHẩM Chuyên. Xác định một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất. 2.2. Đề xuất các điều kiện nuôi cấy tối u để thu đợc hiệu suất sinh khối. 0 C) Số lợng bào tử x 10 8 / ml hỗn dịch Số lợng bào tử x 10 8 / ml hỗn dịch Số lợng bào tử x 10 8 / ml hỗn dịch Số lợng bào tử x 10 8 / ml hỗn dịch Du NT Du NT Du NT Du NT 1 32 0 C