Sưu tập và xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại đà lạt

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH LÂM ĐỒNG TRƯỜNG CAO ĐẲNG NGHỀ ĐÀ LẠT _oOo _ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NĂM 2015-2016 SƯU TẬP VÀ XÂY DỰNG QUỸ GEN INVITRO MỘT SỐ GIỐNG HOA CÚC PHỔ BIẾN TẠI ĐÀ LẠT CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Th S Nguyễn Đình Tiến Đà Lạt, tháng 02 năm 2017 TÓM TẮT Hiện Việt Nam, nguồn gen invitro hoa cúc khơng thể tìm mua bên ngồi thị trường Các nhà khoa học doanh nghiệp nuôi cấy mô phải tự thu thập, đánh giá, xây dựng lưu giữ nguồn gen invitro hoa cúc địa nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích bảo tồn, sử dụng khai thác bao gồm cơng tác nghiên cứu giảng dạy Nhằm góp phần phục vụ tốt cho cơng tác giảng dạy giáo viên trình học tập học sinh/sinh viên thuộc nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt, tiến hành Sưu tập xây dựng thành công 10 giống cúc invitro phổ biến Đà Lạt ABSTRACT Currently in Vietnam, asteraceae in vitro breed is unavailable to purchase Scientists or plant tissue culture laboratories themselves have to accumulate and evaluate, develop and reserve local and imported asteraceae genetic resources in order to conserve and put to use in research projects and academic training In the interest of improving the quality of teaching and learning of Biotechnology and Plant Protection concentrations at Dalat Vocational College, I have successfully collected and produced 10 prevalent asteraceae in vitro breeds in Dalat i MỤC LỤC TÓM TẮT i MỤC LỤC ii CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Khả ứng dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu Tính đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT .3 1.1 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô công tác nhân giống trồng 1.1.1 Tính tồn tế bào thực vật nuôi cấy mô 1.1.2 Công nghệ sinh học thực vật nhân giống trồng 1.1.3 Vai trị chất điều tiết sinh trưởng ni cấy mô 1.1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) 1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung phân loại họ cúc 13 1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cúc 13 1.2.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.2.2 Hóa chất nghiên cứu 19 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp vô trùng mô nuôi 20 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 ii 2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 21 2.3Nội dung nghiên cứu 21 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Thu thập lựa chọn mẫu giống cúc 23 3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho giống hoa cúc 25 3.2.1 Kết nghiên cứu khử trùng mẫu 25 3.2.2 Kết tạo callus 27 3.2.3 Kết nghiên cứu tái sinh từ callus 29 3.2.4 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc 31 3.2.5 Kết nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh 33 3.2.6 Kết nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹ gen invitro 35 3.3 Thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ, bảo quản sử dụng quỹ gen invitro giống hoa cúc 36 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 4.1.1 Về khối lượng công việc mục tiêu đề tài 38 4.1.2 Về nội dung khoa học đề tài 38 4.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iii CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4 - diclophenoxyl axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng BAP/BA : 6-benzyl aminopurin - Chất điều hòa sinh trưởng NAA : Naphtyl axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng MS : Murahige & Skoog, 1962 với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose pH = 5.8 KIN/KI : Kinetin - Chất điều hòa sinh trưởng KH&CN : Khoa học Công nghệ IAA : Indol axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng IBA : Indol butyric acid - Chất điều hịa sinh trưởng THT : Than hoạt tính iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS .19 Bảng 3.1 Một số đặc điểm giống cúc thu thập 23 Bảng 3.2 Kết khử trùng mẫu giống cúc C01 sau tuần nuôi cấy 26 Bảng 3.3 Kết khử trùng mẫu giống cúc C03 sau tuần nuôi cấy .26 Bảng 3.4 Sự hình thành callus môi trường khác giống cúc C01 27 Bảng 3.5 Sự hình thành callus môi trường khác giống cúc C03 27 Bảng 3.6 Kết tái sinh chồi callus hoa cúc sau tuần nuôi cấy .29 Bảng 3.7 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc giống C01 31 Bảng 3.8 Kết tạo rễ chồi hoa cúc giống C01 .33 Bảng 3.9 Kết lưu trữ chồi hoa cúc giống C01 .35 Bảng 4.1 Kết đạt nội dung, công việc thực 38 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng hoa cúc 17 Hình 3.1 Các callus hình thành từ nụ hoa 29 Hình 3.2 Cây hoa cúc tái sinh từ callus 31 Hình 3.3 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc C01 33 Hình 3.4 Cây hoa cúc C01 môi trường tạo rễ 34 Hình 3.5 Quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen invitro 37 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống invitro để sản xuất hoa cúc nhiều nhà khoa học nghiên cứu thành công Nhưng Việt Nam, nguồn gen invitro hoa cúc tìm mua bên ngồi thị trường Các nhà khoa học doanh nghiệp nuôi cấy mô phải tự thu thập, đánh giá, xây dựng lưu giữ nguồn gen invitro hoa cúc địa nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích bảo tồn, sử dụng khai thác bao gồm công tác nghiên cứu giảng dạy Trong công tác giảng dạy số mô đun/môn học nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật thuộc trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt có liên quan đến quy trình nhân giống hoa cúc Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhân giống hoa, Nhân giống hoa cúc đa phần giáo viên giảng dạy sử dụng mẫu giả định để học sinh/sinh viên thực hành giai đoạn nhân giống hoa cúc phương pháp ni cấy mơ Vì học sinh/sinh viên không tiếp cận mẫu thực tế thực hành giai đoạn nhân giống hoa cúc phương pháp ni cấy mơ Do đó, việc nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt cần thiết để phục vụ tốt cho công tác giảng dạy giáo viên trình học tập học sinh/sinh viên Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt để phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành số mơ đun/mơn học có liên quan thuộc nghề Cơng nghệ sinh học Bảo vệ thực vật trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt Khả ứng dụng phương thức chuyển giao kết nghiên cứu Khả thị trường Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp có khả đáp ứng thị trường sản xuất giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mô Khả ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp có khả ứng dụng lĩnh vực sản xuất giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy mô Khả liên doanh liên kết với doanh nghiệp trình nghiên cứu Nếu đề tài thành cơng có khả triển khai áp dụng kết nghiên cứu sở sản xuất giống trồng phương pháp nuôi cấy mô Tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp góp phần đề xuất giải pháp lĩnh vực nghiên cứu sản xuất giống trồng phương pháp ni cấy mơ Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu Hướng nghiên cứu với mục đích tạo quy trình, sản phẩm phù hợp ứng dụng điều kiện giảng dạy số mơ đun/mơn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt, góp phần phục vụ tốt cho công tác giảng dạy giáo viên trình học tập học sinh/sinh viên Tính đề tài Có khả tự thu thập, đánh giá, xây dựng lưu giữ nguồn gen invitro hoa cúc địa nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích giảng dạy nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô cơng tác nhân giống trồng 1.1.1 Tính tồn tế bào thực vật nuôi cấy mô Ni cấy mơ thực vật (hay cịn gọi ni cấy thực vật in vitro) trình nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm Ni cấy mơ thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất kỹ thuật nuôi cấy phận khác (tế bào, mô, quan) thực vật môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa sở lý luận khoa học tính tồn khả phân hóa, phản phân hóa tế bào thực vật Cuối kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ơng, tế bào thể sinh vật mang tồn lượng thơng tin di truyền sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai lịch sử nuôi cấy mô thực vật, White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose nước chiết nấm men Sau White chứng minh thay nước chiết nấm men hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) Nicotinic axit Từ việc nuôi cấy đầu rễ tiến hành nhiều loại khác Năm 1958, tính tồn tế bào khẳng định cơng trình nghiên cứu Stewart cs (1958) mô rễ cà rốt Các tác giả nuôi cấy mơ rễ cà rốt mơi trường đặc có nước dừa thu nhận khối mô sẹo gồm tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo sang mơi trường lỏng có thành phần ni lắc nhận huyền phù gồm tế bào riêng lẽ nhóm tế bào Tiếp tục ni cấy mơi trường lỏng, khơng cấy chuyển thấy hình thành rễ Hình 3.1 Các callus hình thành từ nụ hoa 3.2.3 Kết nghiên cứu tái sinh từ callus Các callus hình thành mơi trường NT7 sử dụng để nuôi cấy môi trường khác để thăm dò khả tái sinh Sau tuần nuôi cấy callus thu kết sau: Bảng 3.6 Kết tái sinh chồi callus hoa cúc sau tuần nuôi cấy Môi trường Tỉ lệ callus không tái sinh (%) NT10 85,7 NT11 17,3 NT12 86,1 NT13 11,7 NT14 98,7 NT15 96,4 NT16 98,3 NT17 96,4 NT18 88,4 NT19 57,6 NT20 55,6 NT21 53,7 Ghi chú: NT10: MS + 1mg/l BAP NT11: MS + 2mg/l BAP NT12: MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l NAA NT13: MS + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA NT14: MS + 1mg/l Kinetin NT15: MS + 2mg/l Kinetin NT16: MS + 1mg/l Kinetin + 0,2mg/l NAA NT17: MS+ 2mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA NT18: MS + 1mg/l Kinetin + 0,5BAP NT19: MS + 2mg/l Kinetin + 0,5bAp NT20: MS + 1mg/l BAP + 0,5mg/l Kinetin 29 Tỉ lệ callus tái sinh (%) 14,3 82,7 13,9 88,3 1,3 3,6 1,7 3,6 11,6 42,4 44,4 46,3 NT21: MS + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin Các callus hai giống cúc có phản ứng khác ni cấy mơi trường MS có chứa chất điều khiển khác với nồng độ khác Các callus hai giống hoa cúc phản ứng tương tự loại môi trường ni cấy Trên mơi trường có chứa BAP (1mg/l) thấp callus có khả tái sinh thấp Khi tăng nồng độ BAP lên 2mg/l môi trường tỉ lệ callus tái sinh tăng lên rõ rệt đạt 80% Trên mơi trường có chứa tổ hợp BAP NAA cho thấy với nồng độ BAP thấp 1ml tỉ lệ tái sinh callus không khác biệt so với môi trường chứa 1mg/l BAP Trên môi trường có 2mg/l BAP bổ sung lương nhỏ a-NAA thấy khả tái sinh callus lớn tương tự môi trường NT11 nhiên tỉ lệ chồi tái sinh môi trường cao mơi trường có BAP Khi thay BAP hợp chất cytokinin khác Kinetin với nồng độ tương đương thấy số lượng callus có khả tái sinh thấp Trên tất môi trường có chứa Kinetin tổ hợp kinetin NAA số lượng callus tái sinh thấp số chồi tái sinh callus nhỏ Trên môi trường kết hợp hai hợp chất BAP Kinetin cho thấy khả tái sinh callus hoa cúc tăng nhiều so với mơi trường có BAP nồng độ thấp môi trường sử dụng riêng rẽ Kinetin kết hợp Kinetin NAA Như nói callus hoa cúc có phản ứng tái sinh tốt mơi trường có chứa 2mg BAP/l Khi kết hợp BAP lượng nhỏ (0,2mg/l) NAA làm tăng thêm số chồi tái sinh/ callus Kết áp dụng để tái sinh từ callus giống lại Kết thu tương tự mẫu C01 C03 Tóm lại: mơi trường tái sinh tốt từ callus hoa cúc MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 30 Hình 3.2 Cây hoa cúc tái sinh từ callus 3.2.4 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc Các chồi tái sinh callus cần nhân nhanh để tạo số lượng lớn cần thiết để đánh giá giai đoạn Vì cần phải khảo sát môi trường nhân nhanh tốt với chồi hoa cúc Theo quan sát thí nghiệm tái sinh cho thấy BAP chất có khả cảm ứng tạo sinh chồi tốt hoa cúc, BAP tiếp tục sử dụng thí nghiệm để đánh giá khả nhân nhanh chồi cúc tái sinh Giống thí nghiệm trước hai giống hoa cúc quan sát thấy phản ứng loại môi trường tương tự Sau tuần nuôi cấy khả nhân nhanh chồi hoa cúc thể bảng sau Bảng 3.7 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc giống C01(sau tuần nuôi cấy) Môi trường Hệ số nhân chồi Chiều cao trung bình chồi (lần) (cm) NT22 2,1 2,5 NT23 5,6 1,5 NT24 6,4 1,3 NT25 2,3 2,4 NT26 5,3 2,2 NT27 6,2 1,8 Ghi chú: NT22: MS + 0,5mg/l BAP NT23: MS + 1mg/l BAP NT24: MS + 2mg/l BAP NT25: MS + 0,1mg/l NAA + 0,5mg/l BAP NT26: MS + 0,1mg/l NAA + 1mg/l BAP NT27: MS + 0,1mg/l NAA + 2mg/l BAP 31 Chất lượng chồi Chồi xanh, mập, to Chồi xanh, mập, to Chồi xanh, mập, nhỏ Chồi xanh mập, to, có rễ Chồi xanh, mập, to, có rễ Chồi xanh, mập, nhỏ, có rễ Khi sử dụng BAP nồng độ thấp 0,5mg/l có hình thành chồi nách với hệ số nhân chồi thấp đạt 2,1 chiều dài chồi 2,5 cm chưa thấy hình thành rễ Khi tăng nồng độ BAP lên 1mg/l hệ số nhân chồi tăng khoảng 2,5 lần so với mơi trường có 0,5mg/l BAP Và nồng độ BAP tăng lên 2mg/l hệ số nhân chồi đạt cao 6,4 lần, chồi lại ngắn nhỏ so với chồi môi trường chứa BAP với nồng độ thấp Kết nghiên cứu cho thấy BAP có tác dụng nhân chồi tốt, chất lượng chồi không tốt tăng hàm lượng BAP Kết hợp BAP NAA với nồng độ BAP thay đổi từ 0,5 - mg/l với nồng độ NAA giữ nguyên 0,1 mg/l hệ số nhân chồi mơi trường có thêm NAA tương đương với mơi trường có nồng độ BAP, hệ số nhân chồi thu không cao Nhưng chất lượng chồi có thay đổi, chiều cao chồi mơi trường cao có hình thành rễ gốc cụm chồi khơng tốt cho Như nói môi trường nhân chồi cho hệ số cao môi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 2mg/l BAP Nhưng để tạo nhiều có chất lượng tốt với số lượng lớn đồng mơi trường thích hợp để nhân chồi mơi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 1mg/l BAP Kết áp dụng để nhân nhanh chồi giống lại Kết thu tương tự mẫu C01 Tóm lại: mơi trường thích hợp để nhân chồi môi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 1mg/l BAP 32 Hình 3.3 Kết nhân nhanh chồi hoa cúc C01 3.2.5 Kết nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh Khi chồi môi trường nhân nhanh đạt số lượng đủ lớn đồng có kích thước từ 1-2 cm, đưa vào nuôi cấy môi trường tạo rễ để tạo hồn chỉnh trước cho vườn ươm Các chồi cúc môi trường nhân nhanh cắt thành đoạn có chiều dài 1cm cấy môi trường tạo rễ Sau 10 ngày nuôi cấy thu kết bảng sau: Bảng 3.8 Kết tạo rễ chồi hoa cúc giống C01(sau tuần) Môi trường Số rễ TB/ chồi Chiều dài TB rễ (cm) Chiều cao TB/ (cm) NT28 NT29 NT30 NT31 NT32 Ghi chú: 4,5 6,4 10,8 6,8 9,6 NT28: MS + g/l than hoạt tính NT29: MS + 0,5mg/l NAA NT30: MS + 1mg/l NAA NT31: MS + 0,5mg/l IAA NT32: MS + 1mg/l IAA 4,7 1,2 0,7 0,8 0,6 3,2 4,2 4,8 4,3 4,7 Kết thu cho thấy môi trường chất điều khiển sinh trưởng chồi hoa cúc có khả tạo rễ kéo dài tạo thành hoàn chỉnh số lượng rễ thu chiều cao ngắn Khi bổ sung thêm than hoạt 33 tính vào mơi trường số lượng rễ, chiều dài rễ chiều cao tăng lên mức độ tăng không đáng kể rễ hình thành dài mảnh nên dễ bị đứt q trình Trên mơi trường có bổ sung 0,5mg/l NAA số lượng rễ tạo tăng lên đến 6,4 rễ/ chồi chiều cao tăng lên đến 4,2 cm Khi hàm lượng NAA mơi trường tăng lên 1mg/l số rễ tạo thành tăng đến 10,8 rễ/ chồi chiều dài rễ lại ngắn Chiều cao môi trường tăng so với môi trường chứa 0,4 mg/l NAA Chiều cao đặc điểm quan trọng trình Nếu cao gây khó khăn q trình yếu dễ bị gãy Khi thay NAA IAA chồi hoa cúc có phản ứng tạo rễ tương tự với số lượng rễ, chiều dài rễ chiều cao chồi khơng có nhiều khác biệt so với mơi trường có NAA nồng độ Tuy nhiên, giá thành IAA cao so với NAA nên sử dụng IAA để tạo rễ cho hoa cúc làm cho chi phí tốn Cây đạt tiêu chuẩn cho q trình có từ 4-6 rễ, chiều dài rễ từ 0,6-1,2 cm chiều cao từ 3-4 cm Từ kết nghiên cứu lựa chọn môi trường MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 0,5mg/l NAA để tạo rễ cho hoa cúc C01 thích hợp Các chồi tái sinh từ mơ sẹo giống cúc cịn lại nhân nhanh tạo rễ môi trường lựa chọn cho kết tương tự với giống cúc C01 Hình 3.4 Cây hoa cúc C01 môi trường tạo rễ 34 3.2.6 Kết nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹ gen invitro Khi chồi môi trường nhân nhanh đạt số lượng đủ lớn đồng có kích thước từ 3-4 cm, đưa vào ni cấy mơi trường lưu giữ để lưu trữ mẫu giống invitro dạng môi trường dinh dưỡng nhân tạo Các chồi cúc môi trường nhân nhanh cắt thành đoạn có chiều dài 1cm cấy môi trường lưu giữ Số liệu chiều cao ghi nhận liên tục tháng nuôi cấy thu kết bảng sau: Bảng 3.9 Kết lưu trữ chồi hoa cúc giống C01 Thời gian Chiều cao trung bình/cây (cm) (tháng) Mơi trường NT33 NT34 NT35 1,2 1,1 0,9 1,5 2,3 2,1 1,2 5,1 3,2 2,1 2,5 (*) 4,1 3,2 (*) 5,2 4,5 3,5 (*) (*) 5,1 (*) (*) (*) Ghi chú: NT33: ½MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar NT34: ½MS + 30g/l sucrose + 12g/l agar NT35: ½MS + 15g/l sucrose + 6.5g/l agar NT36: ½MS + 15g/l sucrose + 12g/l agar (*): Chiều cao trung bình chạm miệng bình NT36 0,8 1,2 1,9 2,7 3,4 4,3 4,9 Kết thu cho thấy mơi trường ½MS chồi hoa cúc có khả tạo rễ kéo dài tạo thành hoàn chỉnh số lượng rễ thu ít, chiều cao ngắn chậm sinh trưởng Khi giảm lượng đường sucrose sử dụng môi trường nuôi cấy từ 30 g/l xuống 15 g/l chồi cúc sinh trưởng chậm chiều cao, đạt chiều cao trung bình từ 4,3-5,1 cm sau 3,5 tháng nuôi cấy Đồng thời tăng nồng độ agar mơi trường ni cấy chồi cúc có tượng sinh trưởng chậm chiều cao, đạt chiều cao trung bình 4,9 cm sau tháng ni cấy NT36: ½MS + 15g/l sucrose + 12g/l agar Các chồi môi trường nhân nhanh giống cúc lại lưu giữ 35 môi trường lựa chọn cho kết tương tự với giống cúc C01 Tóm lại: mơi trường thích hợp để lưu giữ quỹ gen invitro giống hoa cúc môi trường ½MS + 15g/l sucrose + 12g/l agar, cho thời gian lưu giữ từ 3,5 - tháng, chiều cao trung bình chồi tương ứng từ 4,3 - 4,9 cm 3.3 Thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ, bảo quản sử dụng quỹ gen invitro giống hoa cúc Dựa vào kết thu được, tiến hành thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu Kết trình bày hình bên 36 Mơ tả - Phương pháp: Nụ non hoa cúc cắt thành đoạn có cuống dài 1cm Rửa nụ xà phòng tráng vòi nước chảy nhiều lần Tráng mẫu cồn 700 30 giây tráng lại nước cất vơ trùng Tiếp cho mẫu vào bình đựng HgCl2 0,1% lắc 10 phút Sau gạn bỏ hóa chất khử trùng tráng lại mẫu nước cất vô trùng nhiều lần (Hoặc sử dụng lá, thân, rễ cúc invitro quỹ gen) - Môi trường: MS+30g/l sucrose+6,5g/l agar+ 2mg/l BAP VÀO MẪU BAN ĐẦU / TẠO CALLUS Mô tả TÁI SINH CHỒI - Phương pháp: Các callus hình thành môi trường vào mẫu ban đầu sử dụng để tái sinh chồi (Hoặc sử dụng lá, thân, rễ cúc invitro quỹ gen) - Môi trường: MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA Mô tả Mô tả - Phương pháp: Các chồi cúc môi trường nhân nhanh (hoặc chồi quỹ gen) cắt thành đoạn có chiều dài 1cm cấy môi trường lưu giữ - Môi trường: ½MS + 15g/l sucrose + 12g/l agar NHÂN NHANH - Phương pháp: Các chồi tái sinh callus (hoặc chồi quỹ gen) dùng để nhân nhanh tạo số lượng lớn - Môi trường: MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 1mg/l BAP TẠO CÂY HOÀN CHỈNH - Phương pháp: Các chồi môi trường nhân nhanh (hoặc chồi quỹ gen) cắt thành đoạn có chiều dài 1cm cấy mơi trường tạo rễ - Môi trường: MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 0,5mg/l NAA QUỸ GEN Mô tả Ghi chú: Mô tả - Phương pháp: Khi chồi môi trường rễ (hoặc chồi quỹ gen) có kích thước từ 1-2 cm, rễ dài 0,5-1 cm cho vườn ươm Cấy chuyền Mô tả giai đoạn thực VƯỜN ƯƠM Hình 3.5 Quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống hoa cúc 37 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1.1 Về khối lượng công việc mục tiêu đề tài Đề tài thực đầy đủ nội dung nghiên cứu thu kết tốt, đáp ứng mục tiêu thuyết minh, bảo đảm chủng loại sản phẩm đề tài đầy đủ số lượng chất lượng 4.1.2 Về nội dung khoa học đề tài - Đề tài nghiên cứu thành cơng quy trình vào mẫu ban đầu, cấy chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu Những kết đạt được trình bày bảng sau: Bảng 4.1 Kết đạt nội dung, công việc thực Stt Các nội dung, công việc thực Kết đạt Nội dung 1: Điều tra, thu thập lựa chọn mẫu giống nghiên cứu - Thu thập mẫu giống nghiên cứu Thu thập 10 mẫu giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt - Điều tra đặc tính hình thái, tính chống chịu mẫu giống thu thập Nêu đặc tính hình thái, tính chống chịu mẫu giống thu thập - Lựa chọn mẫu giống nghiên cứu Đưa 10 mẫu giống thu thập vào phục vụ nghiên cứu Nội dung 2: Nghiên cứu tạo nguồn mẫu vô trùng cho nuôi cấy invitro - Đánh giá lựa chọn hóa chất khử trùng mẫu nghiên cứu Lựa chọn loại hóa chất khử trùng thích hợp: HgCl2, NaOCl - Khảo sát trình khử trùng mẫu để tạo nguồn mẫu vơ trùng hóa chất khử trùng Đưa quy trình khử trùng mẫu thích hợp Chất khử trùng thích hợp mẫu nụ non hoa cúc HgCl2 0,1% Thời gian khử trùng thích hợp 10 phút 38 Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy, tái sinh invitro mẫu giống nghiên cứu Đưa môi trường tái sinh mẫu cấy thích hợp Mơi trường tạo callus thích hợp là: MS + - Nghiên cứu môi trường tái sinh mẫu 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 2mg/l BAP Môi trường tái sinh thích hợp là: MS + 30g/l cấy sucrose +6,5g/l agar + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA - Nghiên cứu môi trường nhân nhanh mẫu cấy Đưa môi trường nhân nhanh mẫu cấy thích hợp Mơi trường nhân chồi thích hợp là: MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 1mg/l BAP - Nghiên cứu mơi trường tạo hồn chỉnh mẫu cấy Đưa mơi trường tạo hồn chỉnh mẫu cấy thích hợp Mơi trường tạo rễ thích hợp là: MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 0,5mg/l NAA Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu Đưa môi trường lưu giữ quỹ gen invitro thích hợp Mơi trường thích hợp để lưu giữ quỹ gen invitro giống hoa cúc ½MS + 15g/l sucrose + 12g/l agar Nội dung 5: Thiết lập quy trình cấy Đưa quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen giữ sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống invitro mẫu giống nghiên cứu xây hoa cúc dựng - Xây dựng quỹ gen invitro giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt: tạo 500 hoa cúc invitro cho giống, có tổng cộng 10 giống xây dựng - Sản phẩm đề tài nhanh chóng ứng dụng vào thực tiễn: sử dụng quỹ gen xây dựng để giảng dạy môn Nhân giống hoa cúc – lớp CNSH K8 môn Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật – lớp BVTV K8A/B 39 4.2 Đề nghị - Tiếp tục kiểm tra xây dựng quy trình cho giống cúc khác - Cần có hỗ trợ kinh phí hàng năm để trì bảo quản quỹ gen xây dựng - Mở rộng hướng nghiên cứu đối tượng trồng khác 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Sanh Mân, 2010, Giáo trình Kỹ thuật nhân giống Invitro Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1988, Phân loại thực vật, Nxb Đại học trung học chuyên nghiệp: tr.424-436 Phạm Văn Duệ (2005), Giáo trình di truyền chọn giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông, 2002, Cây hoa cúc kĩ thuật trồng, Nxb kĩ thuật : tr1-24 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004), Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Tiếng Anh Bhojwani, S.S and M.K Razdan, 1996 Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition Elsevier Science B.V The Netherlands Boase MR, Miller R, Deroles SC 1997 Chrysanthemum systematics, genetics, and breeding In : Jamick J, editor Plant breeding reviews, vol 14 New York: Wiley; p 321-61 Plants through Tissue Culture Hughes, K.W., Henker, R and Constantin, M (Eds.) Conf 7804111 Technical Inf Center, U.S Dep Energy, Springfield, VA p 44-58 Gamborg, O.L., T Murashige, T.A Thorpe, and I K Vasil, 1976 Plant tissue culture media In Vitro 12:473-8 George, E.F and P.D Sherrington, 1984 In: Plant Propagation by Tissue Culture Exegetics Ltd., Eversley, England, pp 324-366 10 Gisler0d, H.R., L.M Mortensen, and A.R Selmer-Olsen, 1986 The effect of air humidity on growth and nutrient content of some greenhouse plants Acta Hort 178:181-184 41 PHỤ LỤC Thành phần môi trường lưu trữ quỹ gen Nồng độ Stt Thành phần (Số mg cần có lít mơi trường lưu trữ) (mg/l) NH4NO3 825 KNO3 950 KH2PO4 85 MgSO4.7H2O 185 CaCl2.2H2O 220 MnSO4.4H2O H3BO3 3.1 ZnSO4.7H2O 4.3 10 KI Na2MoO4.2H2O 0.415 0.125 11 CuSO4.5H2O 0.0125 12 CoCl2.6H2O 0.0125 13 Na2EDTA 18.65 14 FeSO4.7H2O 13.9 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Meso - inositol Pirydoxine (B6) Biotin (H) Nicotinic acid (P.P) Thiamin – HCl (B1) Pantotate – Ca Glycine Agar Đường sucrose 11.15 50 0.25 0.005 0.25 0.05 0.5 12000 15000 42 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG - Họ tên:Nguyễn Đình Tiến - Ngày sinh: 11/11/1988 - Nơi sinh:Đà Lạt – Lâm Đồng - Địa liên lạc: Số Hoàng Văn Thụ, P.4, Đà Lạt - Điện thoại: 0979.7700.67 - Quá trình đào tạo: Từ 2006-2011: Học đại học Trường Đại Học Bách Khoa - Đại Học Quốc Gia Tp.HCM 2012 – 2014: Học cao học Viện Môi Trường Tài Nguyên - Đại Học Quốc Gia Tp.HCM - Q trình cơng tác: Từ 2011 đến 2014: Cơng tác Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Từ 2014 đến nay: Công tác Trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt 43 ... xây dựng, cấy chuyền lưu chuyền lưu giữ sử dụng quỹ gen giữ sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống invitro mẫu giống nghiên cứu xây hoa cúc dựng - Xây dựng quỹ gen invitro giống hoa cúc phổ biến Đà. .. PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Đặc thù đề tài nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt. .. nhân giống hoa cúc phương pháp ni cấy mơ Do đó, việc nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro số giống hoa cúc phổ biến Đà Lạt cần thiết để phục vụ tốt cho công tác giảng dạy giáo viên trình học tập