Phương pháp phân tích số liệu - Tính mới của đề tà- 123docz.net

5. Tính mới của đề tài

2.2.3.Phương pháp phân tích số liệu

Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê trên phần mềm Microsoft Excel.

2.3 Nội dung nghiên cứu



Nội dung 1: Điều tra, thu thập mẫu giống nghiên cứu.

10 mẫu giống cúc được trồng phổ biến tại Đà Lạt sẽ được thu thập để phục vụ cho việc nghiên cứu. Đồng thời điều tra đặc tính hình thái, tính chống chịu của mẫu giống thu thập.



Nội dung 2: Nghiên cứu tạo nguồn mẫu vô trùng cho nuôi cấy invitro.

Vô trùng là một trong những điều kiện bắt buộc của quá trình nuôi cấy in vitro, là yếu tố quyết định tới thành công của thí nghiệm. Vì vậy, trước khi nuôi cấy in vitro thì mẫu cấy phải được khử trùng sạch nấm và vi khuẩn bằng hóa chất. Các hóa chất sát trùng thường được sử dụng là HgCl2 0,1%; NaOCl 10%.



Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy, tái sinh invitro mẫu giống nghiên cứu.

Các mẫu đã khử trùng có khả năng sống được chuyển sang môi trường tạo callus. Môi trường tạo callus là môi trường MS có bổ sung các chất sinh trưởng khác nhau như 2,4D; BAP, NAA. Sau 4 tuần nuôi cấy đánh giá kết quả thu được.

Các callus hình thành được sử dụng để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để thăm dò khả năng tái sinh.

Các chồi tái sinh trên callus cần được nhân nhanh để tạo số lượng lớn cần thiết để có thể đánh giá được ở các giai đoạn tiếp theo. Vì vậy cần phải khảo sát môi trường nhân nhanh tốt nhất với chồi hoa cúc. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy BAP là chất có khả năng cảm ứng tạo sinh chồi rất tốt đối với cây hoa cúc, chính vì vậy BAP được sử dụng trong thí nghiệm này để đánh giá khả năng nhân nhanh của các chồi cúc tái sinh.

Các chồi trên môi trường nhân nhanh được đưa vào nuôi cấy trên môi trường tạo rễ để có thể tạo được cây hoàn chỉnh trước khi cho ra vườn ươm.



Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹgen invitro mẫu giống nghiên cứu.

Nguồn gen invitro mẫu giống hoa cúc có thể được lưu giữ invitro bằng phương thức sinh trưởng chậm để kéo dài khoản thời gian cấy chuyền giữ mẫu. Ở giai đoạn này, việc nghiên cứu môi trường lưu giữ invitro bằng phương thức sinh trưởng chậm là cần thiết.



Nội dung 5: Thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ và sửdụng quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu đã xây dựng.

Dựa vào kết quả thu được của những nội dung nghiên cứu trên, ta tiến hành thiết lập một quy trình xây dựng, lưu giữ và sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống đã nghiên cứu.

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thu thập và lựa chọn mẫu giống cúc

10 mẫu giống cúc được trồng phổ biến ở Đà Lạt đã được thu thập để phục vụ cho nghiên cứu. Đặc điểm chính của các giống cúc đã thu thập được trình bày ở bảng dưới đây.

Bảng 3.1 Một số đặc điểm của các giống cúc được thu thập

Stt Giống Mã hóa Đặc điểm hình thái Nguồn Thời gian Chiều Chống gốc giống từ trồng cao chịu

tới ra hoa TB bệnh (ngày) (cm)

Thân cao, cong, mảnh; thân màu

1 Đại đóa Vàng C01 xanh; lá mỏng to; Hà Nội 85 - 135 75-80 +++ hoa màu vàng cam,

cánh dài xếp lỏng. Thân cao, cong, mảnh; thân màu

2 Đại đóa Trắng C02 xanh; lá mỏng, màu Hà Nội 93 - 136 72-80 +++ tím nhạt, cánh dài

cong xếp lỏng. to; hoa.

Hoa màu đỏ tím, Cánh kép, cánh

3 Thạch bích C03 phiến, đầu cánh tưa, Đài Loan 90 - 135 75-80 ++ thuộc nhóm cúc

đông; lá xẻ thùy nhiều.

Thân cao, mập

4 Art C04 thẳng; lá dày to; hoa Đài Loan 105 - 157 77- 85 +++ màu vàng nghệ,

cánh dày xếp chặt. Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to

5 Farm tím C05 trung bình; bông Hà Lan 95 - 112 65-75 ++

chùm, màu tím, cánh dày xếp chặt. Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to

6 Farm vàng C06 trung bình; bông Hà Lan 101 - 147 75-80 +++

chùm, màu vàng, cánh dày xếp chặt. Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to

7 Farm trắng C07 trung bình; bông Hà Lan 92 - 120 62-70 +

chùm, màu trắng, cánh dày xếp chặt. Thân thấp, mập trung bình, cứng cây, xanh; lá dày, to

8 Pha lê vàng C08 vừa, xẻ thùy sâu, Đài Loan 90 - 135 60-65 +++ xanh đậm; bông

chùm, vàng pha lê, cánh đều, xếp chặt.

9 Cây cao trung bình, Singapore 90 - 111 62-68 + Mai đỏ C09 thân màu xanh; lá

to; bông chùm, màu trắng đỏ.

10 Thân thấp, mập Singapore 82 - 105 50-55 +++

trung bình, cứng cây, xanh; lá dày, to Pha lê trắng C10 vừa, xẻ thùy sâu,

xanh đậm; bông chùm, trắng pha lê, cánh đều, xếp chặt.

Ghi chú: + ++: chống chịu bênh tốt ++: chống chịu bệnh khá tốt +: chống chịu bệnh trung bình

3.2. Xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho các giống hoa cúc

3.2.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu

Các mẫu nụ non của hoa cúc được cắt thành từng đoạn có cuống dài 1cm. Rửa sạch nụ bằng xà phòng rồi tráng dưới vòi nước chảy nhiều lần. Tráng mẫu bằng cồn 700 trong khoảng 30 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng. Tiếp đó cho mẫu vào bình đựng HgCl2 0,1% lắc trong khoảng thời gian từ 10 hoặc NaOCl 10% lắc trong vòng 20 phút. Sau đó gạn bỏ các hóa chất khử trùng và tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng nhiều lần.

Kết quả khử trùng thu được sau một tuần nuôi cấy trên môi trường khởi động như ở bảng sau:

Bảng 3.2 Kết quả khử trùng mẫu đối với giống cúcC01sau 1 tuần nuôi cấy

Hoá chất Thời gian khử trùng Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu sống

khử trùng (phút) (%) (%) (%) HgCl2 0,1% 8 74,3 5,0 20,7 10 32,3 7,7 60 12 12,6 54,1 33,3 NaOCl 10% 15 100 0 0 20 75 5 10 25 63,4 10,3 26,3

Bảng 3.3 Kết quả khử trùng mẫu của giống cúc C03sau 1 tuần nuôi cấy

Hoá chất Thời gian Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu sống

khử trùng khử trùng (phút) (%) (%) (%) 8 71,4 9,6 19 HgCl2 0,1% 10 34,3 12,3 55,6 12 12,7 54,3 33 15 95 0 5 NaOCl 10% 20 73,3 5,4 11,3 25 64,2 10,6 25,2

Kết quả đã cho thấy khử trùng bằng NaOCl 10% hiệu quả khử trùng rất thấp. Tỉ lệ mẫu sạch và có khả năng sống đạt cao nhất là 25,2-26,3% ở cả hai giống hoa cúc. Khi thời gian khử trùng ngắn 20 phút các mẫu đều bị nhiễm nấm và khuẩn 100%, khi tăng thời gian khử trùng lên thì số lượng mẫu nhiễm giảm nhưng xuất hiện các mẫu chết và thời gian khử trùng càng tăng số lượng mẫu chết càng lớn. Do vậy sử dụng NaOCl 10% để khử trùng mẫu có hiệu quả không cao và thời gian khử trùng là khá lâu.

Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian ngắn hơn so với khử trùng bằng NaOCl 10% thì tỉ lệ mẫu nhiễm giảm hơn và tỉ lệ mẫu sống đạt được nhiều hơn. Tỉ lệ mẫu sống đạt được cao nhất là 60%. Tuy nhiên khi tăng thời gian khử trùng lên 12 phút thì tỉ lệ mẫu chết lại tăng lên và tỉ lệ mẫu sống lại giảm xuống.

Như vậy hóa chất khử trùng thích hợp để khử trùng nụ hoa cúc C01 và C03 là HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng thích hợp là 10 phút.

lệ mẫu sống đạt được đều trên 60%. Do đó, hóa chất khử trùng thích hợp để khử trùng nụ hoa cúc các loại là HgCl2 0,1% và thời gian khử trùng thích hợp là 10 phút.

3.2.2. Kết quả tạo callus

Các mẫu đã khử trùng có khả năng sống được chuyển sang môi trường tạo callus. Môi trường tạp callus là môi trường MS có bổ sung các chất sinh trưởng khác nhau như 2,4-D; BAP, NAA. Sau 4 tuần theo dõi thu được kết quả như bảng sau:

Bảng 3.4 Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúcC01 sau 4 tuần nuôi cấy.

Môi trường Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) Chất lượng callus (%)

NT1 20,6 79,4 + NT2 10,5 89,5 ++ NT3 5,6 94,4 + NT4 2,7 97,3 ++ NT5 3,3 96,7 ++ NT6 2,4 97,6 ++ NT7 2,5 97,5 +++ NT8 1,7 98,3 +++ NT9 1,5 98,5 +++

Ghi chú: +: Callus vàng nâu, mọng nước;

++: Callus trắng, xốp, khả năng tái sinh kém;

+++: Callus xốp có dạng phôi, có khả năng tái sinh.

Bảng 3.5 Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúcC03 sau 4 tuần nuôi cấy.

Môi trường Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) Chất lượng callus (%)

NT1 17,8 82,2 + NT2 12,7 87,3 ++ NT3 7,6 92,4 + NT4 3,6 96,4 ++ NT5 2,3 97,7 ++ NT6 2,4 97,6 ++ NT7 1,5 98,5 +++ NT8 1,2 98,8 +++ NT9 1,3 98,7 +++ Ghi chú: NT1: MS + 1mg/l 2,4D NT2: MS + 2mg/l 2,4D NT3: MS + 3mg/l 2,4D NT4: MS + 1mg/l 2,4D+ 0,5mg/l BAP NT5: MS + 2mg/l 2,4D+ 0,5mg/l BAP NT6: MS + 1mg/l BAP

NT7: MS + 2mg/l BAP

NT8: MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l NAA NT9: MS + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA

Qua các kết quả thu được thấy rằng các mẫu hoa cúc của cả hai giống C01 và C03 có phản ứng tương tự như trên các môi trường có chứa các chất điều khiển sinh trưởng khác nhau. Trên cùng một loại môi trường thì tỉ lệ tạo callus của các mẫu ở cả hai giống là tương đương nhau. Như vậy có thể nói rằng sự khác biệt về giống không liên quan đến cảm ứng tạo callus và cảm ứng tạo callus hoàn toàn được điều khiển bởi các chất điều khiển sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy. Trên môi trường có chứa 2,4-D với nồng độ từ 1- 3 mg/l mẫu cũng có cảm ứng tạo callus tuy nhiên chất lượng callus không tốt. Trên môi trường vừa bổ sung kết hợp 2,4-D và BAP các mẫu cũng có cảm ứng tạo callus nhưng chất lượng callus có cải thiện hơn so với môi trường chỉ chứa 2,4-D nhưng chất lượng callus chưa cao, khả năng tái sinh kém. Trên môi trường chỉ có BAP hoặc kết hợp giữa BAP và NAA thì các mẫu có cảm ứng tạo callus rất tốt, các callus có màu xanh nhạt, có dạng phôi sinh, một số mẫu có phản ứng có cụm chồi tái sinh trên bề mặt callus sau 1 tháng nuôi cấy, tuy nhiên trên môi trường có mặt NAA thì các mẫu còn có phản ứng phân hóa tạo rễ.

Như vậy môi trường được cho là tạo callus tốt nhất của hai giống C01 và C03 là NT7: MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 2mg/l BAP.

Kết quả này được áp dụng để tạo callus các giống còn lại. Kết quả thu được tương tự như mẫu C01 và C03.

Tóm lại: môi trường được cho là tạo callus tốt nhất của mẫu giống là NT7: MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 2mg/l BAP.

Hình 3.1 Các callus hình thành từ nụ hoa

3.2.3. Kết quả nghiên cứu tái sinh cây từ callus

Các callus hình thành trên môi trường NT7 được sử dụng để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để thăm dò khả năng tái sinh.

Sau 6 tuần nuôi cấy callus đã thu được các kết quả như sau:

Bảng 3.6 Kết quả tái sinh chồi của callus cây hoa cúc sau 6 tuần nuôi cấy

Môi trường Tỉ lệ callus không tái sinh (%) Tỉ lệ callus tái sinh (%)

NT10 85,7 14,3 NT11 17,3 82,7 NT12 86,1 13,9 NT13 11,7 88,3 NT14 98,7 1,3 NT15 96,4 3,6 NT16 98,3 1,7 NT17 96,4 3,6 NT18 88,4 11,6 NT19 57,6 42,4 NT20 55,6 44,4 NT21 53,7 46,3 Ghi chú: NT10: MS + 1mg/l BAP NT11: MS + 2mg/l BAP NT12: MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l NAA NT13: MS + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA NT14: MS + 1mg/l Kinetin NT15: MS + 2mg/l Kinetin NT16: MS + 1mg/l Kinetin + 0,2mg/l NAA NT17: MS+ 2mg/l Kinetin + 0,2 mg/l NAA NT18: MS + 1mg/l Kinetin + 0,5BAP NT19: MS + 2mg/l Kinetin + 0,5bAp NT20: MS + 1mg/l BAP + 0,5mg/l Kinetin

NT21: MS + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin

Các callus của hai giống cúc có phản ứng khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường MS có chứa các chất điều khiển khác nhau với nồng độ khác nhau. Các callus của cả hai giống hoa cúc phản ứng tương tự như nhau trên cùng một loại môi trường nuôi cấy. Trên môi trường chỉ có chứa BAP (1mg/l) thấp các callus có khả năng tái sinh thấp. Khi tăng nồng độ BAP lên 2mg/l trong môi trường tỉ lệ callus tái sinh tăng lên rõ rệt đạt hơn 80%.

Trên môi trường có chứa tổ hợp BAP và NAA cho thấy với nồng độ BAP thấp 1ml tỉ lệ tái sinh của các callus không khác biệt so với trên môi trường chứa 1mg/l BAP. Trên môi trường có 2mg/l BAP và bổ sung một lương nhỏ a-NAA đã thấy khả năng tái sinh của các callus rất lớn tương tự như trên môi trường NT11 tuy nhiên tỉ lệ chồi tái sinh trên môi trường này cao hơn trên môi trường chỉ có BAP.

Khi thay BAP bằng một hợp chất cytokinin khác là Kinetin với nồng độ tương đương thì thấy số lượng callus có khả năng tái sinh thấp. Trên tất cả các môi trường có chứa Kinetin và tổ hợp của kinetin và NAA số lượng các callus tái sinh rất thấp và số chồi tái sinh ở các callus rất nhỏ.

Trên môi trường kết hợp cả hai hợp chất BAP và Kinetin cho thấy khả năng tái sinh của callus hoa cúc đã tăng nhiều hơn so với môi trường có BAP ở nồng độ thấp và môi trường chỉ sử dụng riêng rẽ Kinetin hoặc kết hợp Kinetin và NAA.

Như vậy có thể nói rằng các callus của hoa cúc có phản ứng tái sinh tốt trên môi trường có chứa 2mg BAP/l. Khi kết hợp BAP và một lượng nhỏ (0,2mg/l) NAA thì có thể làm tăng thêm số chồi tái sinh/ callus.

Kết quả này được áp dụng để tái sinh cây từ callus các giống còn lại. Kết quả thu được tương tự như mẫu C01 và C03.

Tóm lại: môi trường tái sinh cây tốt nhất từ callus hoa cúc là MS + 30g/l sucrose +6,5g/l agar + 2mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA.

Hình 3.2 Cây hoa cúc tái sinh từ callus

3.2.4. Kết quả nhân nhanh đối với chồi hoa cúc

Các chồi tái sinh trên callus cần được nhân nhanh để tạo số lượng lớn cần thiết để có thể đánh giá được ở các giai đoạn tiếp theo. Vì vậy cần phải khảo sát môi trường nhân nhanh tốt nhất với chồi hoa cúc. Theo quan sát ở thí nghiệm tái sinh cho thấy BAP là chất có khả năng cảm ứng tạo sinh chồi rất tốt đối với cây hoa cúc, chính vì vậy BAP được tiếp tục sử dụng trong thí nghiệm này để đánh giá khả năng nhân nhanh của các chồi cúc tái sinh.

Giống như các thí nghiệm trước ở cả hai giống hoa cúc đều quan sát thấy phản ứng trên cùng một loại môi trường là tương tự như nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy khả năng nhân nhanh của chồi hoa cúc được thể hiện như bảng sau.

Bảng 3.7 Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúc giốngC01(sau 4 tuần nuôi cấy)

Môi trường Hệ số nhân chồi Chiều cao trung bình chồi Chất lượng chồi

(lần) (cm)

NT22 2,1 2,5 Chồi xanh, mập, lá to

NT23 5,6 1,5 Chồi xanh, mập, lá to

NT24 6,4 1,3 Chồi xanh, mập, lá nhỏ

NT25 2,3 2,4 Chồi xanh mập, lá to, có rễ

NT26 5,3 2,2 Chồi xanh, mập, lá to, có rễ

NT27 6,2 1,8 Chồi xanh, mập, lá nhỏ, có rễ Ghi chú: NT22: MS + 0,5mg/l BAP NT23: MS + 1mg/l BAP NT24: MS + 2mg/l BAP NT25: MS + 0,1mg/l NAA + 0,5mg/l BAP NT26: MS + 0,1mg/l NAA + 1mg/l BAP