Đề tài nghiên cứu này nhằm cung cấp thêm các thông tin về đặc điểm hình thái, sự đa dạng di truyền của nấm C. lutana phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật cũng như chọn tạo giống kháng bệnh.
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NẤM Curvularia lunata GÂY BỆNH LEM LÉP HẠT LÖA Isolation and Genetic Diversity Evaluation of Curvularia lunata Causing Black Kernel Disease in Rice Nguyễn Quốc Trung, Bùi Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa Khoa Cơng Nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Ngày nhận bài: 20.3.2019 Ngày chấp nhận: 15.5.2019 Abstract Discolouration or black kernel disease is one of the most common diseases affecting seed quality and yield in rice production Black kernel is caused by several pathogens, among them Curvularia lunata (C lunata) is the most usual and most dangerous one This study aimed to isolate C lunata from samples collected from provinces: Lao Cai, Thai Nguyen and Soc Trang Seventeen isolates of C lunata were isolated based on mophorlogy of colony and structure of spore under microscope Genetic diversity was analyzed using 19 RAPD markers inwhich markers showed high polymorphic with PIC value ranged from 0.71 (OPA11) to 0.89 (OPA3) Phylogenetic tree was constructed by NTSYS pc2.1 software Five groups were devided with genetic homologous value 0.74 Group 1, and were geographical origin from Lao Cai, Thai Nguyen-Lao Cai and Soc Trang, responsibly Group and were from both Thai Nguyen and Lao Cai Keywords: Curvularia lunata, black kernel, genetic diversity, RAPD marker ĐẶT VẤN ĐỀ Trong ngành sản xuất lúa gạo, bệnh lem lép hạt loại bệnh phổ biến gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng hạt giống suất Bệnh số loại vi khuẩn nấm gây như: Pseudomonas glumae, Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Fusarium sp, Curvularia lunata, … Trong đó, Curvularia lunata (C lunata) tác nhân quan trọng nhất, gây tổn thất đáng kể đến chất lượng suất lúa (Sumanagala cs 2008) Bệnh thường gây hại vào giai đoạn lúa trỗ bơng đến chín sữa Nếu gặp điều kiện thuận lợi với mưa kéo dài độ ẩm cao, bệnh gây tỷ lệ lép, lửng cao Ở lúa bị bệnh lem lép hạt vỏ trấu có đốm nhỏ màu sậm biến đổi từ màu nâu đến màu đen, bị bệnh nặng tạo thành mảng nâu đen trùm lên vỏ trấu Hậu chất lượng hạt gạo bị biến màu bị lép Theo Kamaluddeen cs 2013, triệu chứng bệnh C lunata gây xuất trước tiên Các đốm màu nâu hình elip xuất to dần Sau đó, đốm xuất bẹ Dần dần, bệnh lan đến hạt Vỏ trấu chuyển màu bị nhiễm nặng, hạt thóc chuyển màu đen Một số công bố bước đầu phân lập thành công nghiên cứu đa dạng di truyền như: Goh cs 1998 sử dụng trình tự bảo thủ gen tổng hợp 28S rRNA, 5.8S rRNA vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) để đánh giá đa dạng di truyền Bipolaris, Cercospora, Corynespora, Curvularia, Drechslera, Exserohilum Helminthosporium Ahmad cs 2006 sử dụng RAPD (random amplified polymorphic DNA) để đánh giá đa dạng di truyền quần thể C lunata phân lập từ lúa mì lúa… Hiện nay, Việt Nam đề tài nghiên cứu phân lập, đánh giá đa dạng di truyền tác nhân gây bệnh lem lép hạt chưa quan tâm Đề tài nghiên cứu nhằm cung cấp thêm thơng tin đặc điểm hình thái, đa dạng di truyền nấm C lutana phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật chọn tạo giống kháng bệnh 45 Kết nghiên cứu Khoa học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các isolate nấm C lunata phân lập từ mẫu nhiễm bệnh Mẫu bệnh thu thập giai đoạn lúa đẻ nhánh Dựa triệu chứng bệnh mô tả theo Kamaluddeen cs 2013: nhiễm bệnh thu thập ghi đầy đủ thông tin (thời gian, địa điểm thu thập, mẫu giống lúa) túi thu thập Địa điểm thu thập gồm tỉnh Bắc Bộ Lào Cai Thái Nguyên; tỉnh miền Đông Nam Bộ Sóc Trăng 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Các isolate nấm phân lập theo phương pháp IRRI, 1997 (Không thấy tài liệu tham khảo) Mẫu bệnh cắt mảnh nhỏ khoảng 2-3 mm Sau khử trùng bề mặt 0.5% dung dịch Natri hypoclorit phút rửa lại lần nước cất khử trùng Nấm bệnh nuôi BVTV - Số 5/2019 cấy môi trường PDA (1 lít mơi trường: 4g potato extract, 20g D-glucose, 15g agar, pH 6,5-7) 28ºC ngày Sau dùng que cấy vô trùng quệt nhẹ lên bề mặt mô bệnh chuyển sang bề mặt môi trường PDA Để nấm phát triển sau khoảng 4-5 ngày tiến hành lấy bào tử nấm đưa lên kính hiển vi quan sát xác định bào tử Cấy chuyển nhiều lần để làm Các isolate nấm lưu giữ môi trường thạch nghiêng cho việc sử dụng ngắn hạn giữ giống lâu dài glycerol 30% -30ºC 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Tách chiết DNA: theo qui trình Dellaporta cs 1983 DNA tách chiết kiểm tra chất lượng điện di gel agarose 0,8% Đánh giá đa hình thị RAPD: 19 mồi RAPD sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền C lunata (bảng 1) Bảng 19 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Tên mồi OPA-01 OPA-03 OPA-07 OPA-11 OPA-13 OPG-06 OPG-14 OPE-14 PAP2 PAP3 OPE-14 OPG-05 OPQ-04 OPD-08 OPA-17 OPB-10 OPB17 OPB-04 OPB-06 Trình tự 5’- 3’ CAGGCCCTTC AGTCAGCCAC GGTGACGCAG CAATCGCCGT CAGCACCCAC GTGCCTAACC GGATGAGACC TGCGGCTGAG TACAACGAGG TGGATTGGTC TGCGGCTGAG CTGAGACGGA GACGGCTATC GGCAGGCAAG GACCGCTTGC CTGCTGGGAC AGGGAACGAG GGACTGGAGT TGCTCTGCCC Điều kiện PCR: biến tính 94ºC phút, 40 chu kì 94ºC phút, 31ºC phút, 72ºC phút 72ºC 15 phút 46 Tài liệu tham khảo Weikert-oliveira Resende, 2002 Caligiorne cs 1999 Séré cs 2007 Reza cs 2010 chu kì cuối, bảo quản 15ºC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 4% quan sát máy đọc gel Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 Dựa kết điện di sản phẩm PCR, băng gel xác định quy ước (0) khơng có băng (1) có băng Hệ số tương đồng di truyền Jaccard NTSYSpc phiên 2.1 sử dụng để phân tích đánh giá mối liên hệ mặt di truyền isolate C lunata (Rohlf, 2000) Các băng sản phẩm PCR dùng để phân tích độ tương đồng vẽ sơ đồ hình mức độ tương đồng di truyền KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập isolate nấm Từ mẫu bệnh thu thập Lào Cai, Thái Nguyên, Sóc Trăng, 17 isolate nấm phân lập tuyển chọn dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình dạng bào tử theo mơ tả Kamaluddeen cs 2013 (bảng 2) để tiến hành thí nghiệm Khuẩn lạc tất isolate có màu xám đen đặc trưng, khác màu sắc xuất sợi nấm bề mặt Bảng Danh sách 17 isolate phân lập từ địa điểm thu thập (2013) STT Kí hiệu KU 1-1 KU 1-2 KU 4-2 KU 9-1 KU 9-4 KU 10-2 KU 10-3 KU 12-1 KU 12-2 Địa điểm thu thập Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Bào tử mang đặc điểm đặc trưng chi Curvularia, bào tử cong tế bào thứ ba tính từ cuống bào tử, thường ba vách ngăn, bào tử màu nâu đậm, vách ngăn quan sát rõ ràng kính hiển vi Qua so sánh hình thái bào tử Kí hiệu ADBL 10-16-1 ADBL 10-18-1 ADBL 10-28-1 ADBL 10-28-2 573 574 LC 25 Pi-1 (séng cù) Địa điểm thu thập Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Lào Cai Lào Cai isolate với mô tả công bố Kamaluddeen cs 2013 website http://www.mycobank.org/, kết luận sơ 17 isolate phân lập thuộc chi Curvularia loài Curvularia lunata Hình Hình ảnh bào tử isolate nấm phân lập Curvularia spp Hình a: 10-18-1, b: KU 9-4, c: ADBL 10-18-1, d: ADBL 10-28-2 mô tả bào tử theo www.mycobank.org 3.2 Đánh giá đa dạng di truyền Với 19 mồi RAPD sử dụng cho nghiên cứu, kết cho thấy có 19 mồi cho đa hình isolate nghiên cứu Các băng điện di có kích thước từ 150 – 1600bp Trong phân tích đa dạng di truyền, coi băng DNA sản phẩm điện di với kích thước định alen 47 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 Bảng Số lƣợng băng đa hình hệ số PIC mồi STT Tên mồi OPA03 OPB 06 OPA 07 OPA 11 OPA 13 OPB 10 Tổng Trung bình Tổng số alen 12 10 53 8.8 Số alen đa hình 11 43 7.2 Hệ số PIC 0.89 0.75 0.80 0.71 0.85 0.75 0.79 Chú thích: số PIC (Polymorphism Information Content) hệ số đa dạng locus gene tính theo cơng thức PIC = 1-∑Pi , P tần xuất xuất alen thứ (i) Qua kết tính tốn cho thấy mồi OPA 03 có hệ số PIC cao với 11/12 alen đa hình, hệ số PIC thấp 0,71 thuộc mồi OPA 11 với 6/7 alen đa hình Hệ số PIC trung bình mồi RAPD đạt 0,79 Nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền 17 isolate, sơ đồ hình mức độ tương đồng di truyền mồi RAPD xây dựng dựa theo hệ số tương đồng di truyền Jaccard Thơng qua hình ảnh điện di số liệu phân tích tổng hợp cho việc lập đa dạng phần mềm NTSYSpc2.1 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi RAPD + Hình a, b, c, d, e, f tương ứng với mồi OPA03, OPA11, OPA13, OPA07, OPB06, OPB10 + Các mẫu từ M đến 17 DNA ladder 100bp, pi1, LC25, 573, 574, ADBL10-16, ADBL10-18, ADBL 10-28-1, ADBL 10-28-2, KU 1-1, KU 1-2, KU 4-2, KU 9-1, KU 9-4, KU 10-2, KU 10-3, KU 12-1 KU 12-2 48 Kết nghiên cứu Khoa học Dựa kết phân tích đa dạng di truyền, phân chia 17 isolate chia thành năm nhóm mức độ tương đồng 0,74 Trong nhóm (gồm pi1), nhóm (gồm lc25, 574, ADBL 10-18, 573) nhóm (KU 10-3) đặc trưng cho vùng địa lý thu thập mẫu từ Lào Cai, Thái Nguyên-Lào Cai Sóc Trăng Hai nhóm (ADBL10-16, KU91) (ADBL10-28-1, ADBL10-28-2, KU1-1, KU1-2, KU4-2, KU9-4, KU10-2, KU12-1 KU12-2) có nguồn gốc Thái Nguyên Sóc Trăng, tương đồng di truyền isolate thu thập từ địa điểm cách xa nhóm cần phân tích thêm mức phân tử để giải thích nguồn gốc isolate Hình Cây đa dạng di truyền dựa kết phân tích thị RAPD KẾT LUẬN Tiến hành thu thập mẫu vụ Mùa 2013, phân lập thành công 17 isolate nấm Curvularia lutana gây bệnh lem lép hạt từ Lào Cai, Thái Nguyên Sóc Trăng, đồng thời phân isolate thành nhóm dựa theo đa dạng di truyền phân tích thị RAPD Bệnh lem lép hạt phổ biến, phân bố miền Bắc miền Nam Nguồn bệnh sở hữu ích cho cơng tác bảo vệ thực vật, đánh giá độc tính nấm gây hại vùng sản xuất công cụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh lem lép hạt Để có đầy đủ thơng tin tình hình bệnh lem lép hạt nước đa dạng di truyền, phân nhóm isolate nấm Curvularia lunata cần có nghiên cứu quy mơ tồn quốc nhiều năm BVTV - Số 5/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmad, I., Iram, S., Cullum, J., Ahmad, I., & Al, E T., 2006 Genetic variability and aggressiveness in Curvularia lunata associated with rice-wheat cropping areas of pakistan, 38(2), 475–485 Caligiorne, R.B., Resende, M.A., Paiva, E & Azevedo, V., 1999 Use of RAPD (random amplified polymorphic DNA) to analyse genetic diversity of dematiaceous fungal pathogens Canadian Journal of Microbiology 45:408-412 Dellaporta SL, Wood J, and Hicks JB.,1983 A plant DNA minipreparation: version II Plant Mol Biol Rep 1: 19-21 Goh, T.K., Hyde, K.D and Lee, D.K.L., 1998 Generic distinction in the Helminthosporium complex based on restriction analysis of the nuclear ribosomal RNA gene Fungal Diversity 1: 85-107 IRRI (1997) Laboratory manual In: A workshop on gene cloning, transformation and molecular analysis of transgenic rice Plant Breeding, Genetics, and Biochemistry division, IRRI Kamaluddeen; Sobita Simon; Lal, A A., 2013 A new blight disease of rice caused by Curvularia lunata from Uttar Pradesh International Journal of Agricultural Science and Research (IJASR) (5) 13-15 Reza, M., Motlagh, S., & Anvari, M., 2010 Genetic variation in a population of Bipolaris oryzae based on RAPD-PCR in north of Iran, 9(36), 5800–5804 Rohlf FJ, 2000 NTSYS-pc number taxonomy and multivariate analysis system version 2.1 Setauket, NY, USA, Exeter Publish-ing Séré, Y., Onasanya, A., Afolabi, A., Mignouna, H D., & Akator, K., 2007 Genetic diversity of the blast fungus, Magnaporthe grisea ( Hebert ) Barr , in Burkina Faso, 6(22), 2568–2577 10 Sumangala K., Patil M.B., Nargund V.B and Ramegowda G., 2008 Evaluation of fungicides, botanicals and bio-agents against Curvularia lunata, a causal agent of grain discoloration in rice, Journal of Plant Dis Sci., 3(2), 159-164 11 Weikert-oliveira, R C B., Resende, M A D E., 2002 Genetic variation among pathogens causing “ Helminthosporium ” diseases of rice , maize and wheat, 27(6), 639–643 Phản biện: TS Nguyễn Huy Chung 49 ... tạo giống lúa kháng bệnh lem lép hạt Để có đầy đủ thơng tin tình hình bệnh lem lép hạt nước đa dạng di truyền, phân nhóm isolate nấm Curvularia lunata cần có nghiên cứu quy mơ tồn quốc nhiều... 2013, phân lập thành công 17 isolate nấm Curvularia lutana gây bệnh lem lép hạt từ Lào Cai, Thái Nguyên Sóc Trăng, đồng thời phân isolate thành nhóm dựa theo đa dạng di truyền phân tích thị RAPD Bệnh. .. giá đa dạng di truyền Với 19 mồi RAPD sử dụng cho nghiên cứu, kết cho thấy có 19 mồi cho đa hình isolate nghiên cứu Các băng điện di có kích thước từ 150 – 1600bp Trong phân tích đa dạng di truyền,