Lời Mở Đầu Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Những năm gần đây, nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Dưới áp lực trên, nguồn năng lượng tái tạo đang được các quốc gia quan tâm Việc sử dụng cellulase của Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Việt Nam có nguồn sinh khối tự nhiên dồi dào. Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú và đa dạng. Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4βglucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao. Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết được những vấn đề ―nóng‖ ở Việt Nam và trên thế giớiĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG SVTH: Nguyễn Thị Hương 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN I. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei 1. Lịch sử phát hiện Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quân đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma viride mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma. Việc nuôi cấy dễ dàng và không tốn kém, các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới Theo Christian P. Kubicek và Gary E. Harman.ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG SVTH: Nguyễn Thị Hương 2 2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei 2.1. Vị trí phân loại Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota . Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10 dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại . Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấmĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG SVTH: Nguyễn Thị Hương 3 Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Loài: Trichoderma reesei 2.2. Đặc điểm hình thái Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 130µm (thông thường là 5 10 µm). Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhóm phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome).ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG SVTH: Nguyễn Thị Hương 4 Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗ thủng. Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn của sợi nấm và ít hơn trong các tế bào phía sau ngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối ít ( 6 ở T.reesei). Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực (Eukaryote) khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 2025nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) : bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN 25S; 5,8S và 5S cùng với 3040 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 2124 loại protein) Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh (endospore). Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều mycelia), sau 35 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm.
ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đồ án, tơi nhận giúp đỡ của: Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình vấn đề liên quan cung cấp số tài liệu có ích suốt thời gian thực đồ án Tất thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - tạo điều kiện tốt cho thực đồ án Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - học tập, trao đổi kinh nghiệm giúp đỡ tơi q trình làm việc Xin gởi đến người kể lời cảm ơn chân thành! SVTH: Nguyễn Thị Hương i ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Mục Lục Mục Lục ii Danh Mục Hình v Lời Mở Đầu vii I Giới thiệu nấm mốc Trichoderma reesei 1 Lịch sử phát Đặc điểm sinh học nấm mốc T.reesei 2.1 Vị trí phân loại 2.2 Đặc điểm hình thái 3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3.1 Đặc điểm sinh thái 3.2 Môi trường sống 3.3 Chất chuyển hóa thứ cấp kháng sinh 3.4 Môi trường nhân sinh khối Khái niệm kiểm soát sinh học Trichoderma Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 5.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cải thiện suất trồng 5.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường 5.3 Trong lĩnh vực khác II Khả phân hủy cellulose Trichoderma reesei: 11 Cellulose: 11 1.1 Cấu trúc: 11 1.2 Nguồn gốc: 12 Cellulase: 15 2.1 Cấu trúc: 15 SVTH: Nguyễn Thị Hương ii ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG 2.2 Phân loại: 19 2.3 Cơ chế hoạt động: 20 2.4 Hệ thống cellulase Trichoderma reesei : 22 Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả phân hủy cellulose cao 29 I Phương pháp đại: 29 1.1 Nâng cao khả sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) chủng T.reesei 29 1.1.1 Khuếch đại biểu cbh1 cách tăng số gen cbh1: 29 1.1.2 Khuếch đại biểu cbh2 cách sử dụng promoter mạnh cbh1: 31 1.2 Nâng cao khả sản xuất endoglucanases ( EG ) chủng T.reesei cách sử dụng promoter mạnh : 35 1.3 Nâng cao khả sản xuất endoglucanases ( EG ) chủng T.reesei cách nhân biểu gen khác loài : 38 1.3.1 Plasmids 39 1.3.2 Kết 40 II Phương pháp cổ điển: 42 2.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên hình thái T.reesei việc sản xuất enzyme cellulase 42 2.1.1 Sự phát triển hệ sợi nấm 45 2.2 Ảnh hưởng qua lại pH chất môi trường nuôi cấy đến khả sản xuất cellulase 48 2.3 Ảnh hưởng áp suất đến khả tạo cellulase 50 2.4 Ảnh hưởng sục khí khơng sục khí đến khả sản xuất cellulase T.reesei RUT C30 51 PHẦN 3: KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 53 SVTH: Nguyễn Thị Hương iii ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Danh Mục Bảng Bảng 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm Bảng 2: Thành phần cellulose có số loài thực vật 14 Bảng 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9] 19 Bảng 4: Tóm tắt loại enzymee có mặt T.reesei [8, 11] 23 Bảng 5: Tóm tắt gen qui định cellulase nấm T.reesei 28 Bảng 1: Sản xuất cellulase chủng chủ ALK02221 chủng biến đổi ALK03760, ALK03862, ALK03761 31 Bảng 2: Sản xuất cellulase chủng ALKO2221 chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873 34 Bảng 3: Sản xuất cellulase chủng chủ VTT-79125 chủng đột biến sản xuất lượng lớn EGI 37 Bảng 4: Các primer để khuếch đại gen egl 20-50 kDa cbh 50kDa M.albomyces phương pháp PCR 39 Bảng 5: Sản xuất cellulase chủng M albomyces ALKO4237, chủng chủ Trichoderma ALKO3620 (egl2) chủng T.reesei biến đổi chép cel45A, cel7A cel7B thay gen cbh1 hay egl1 41 Bảng 6: So sánh sản lượng tế bào thu nuôi cấy liên tục nấm T.reesei 52 SVTH: Nguyễn Thị Hương iv ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Danh Mục Hình Hình 1: Sợi nấm T.reesei quan sát kính hiển vi điện tử Hình 2: Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Fusarium Hình 3: Chế phẩm enzyme trichoderma bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất công ty Điền Trang Hình Tăng cường rễ phát triển lĩnh vực trồng ngô đậu tương dòng T harzianum T-22 [G E Harman, Cornell University, Geneva] Hình 5: Một số gen biocontrol từ T harzianum đưa vào thuốc để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo vào khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G E Harman, Cornell University, Geneva] 10 Hinh 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu đỏ-oxy, màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ] 11 Hình 7: Cấu trúc phân tử cellulose 12 Hình 8: Hình ảnh mơ tả cellulose thành phần tế bào thực vật 13 Hinh 9: Cấu trúc không gian chiều enzyme cellulase (Ngân hàng liệu protein, cấu trúc 1JS4) 15 Hinh 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase 17 Hinh 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose sản xuất protein tái tổ hợp [7] 18 Hinh 12: Sơ đồ chế hoạt động cellulase [10] 22 Hình 13: vùng xúc tác enzyme 24 Hình 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose Hai cellobiohydrolases (CBH) công vào vùng cellulose tinh thể chuỗi kết thúc endoglucanases (EG) khu cellulose Các vòng tròn đầy, ký hiệu R, đại diện cho vùng kết thúc giảm vòng tròn mở, ký hiệu NR, đại diện cho vùng kết thúc không giảm C vùng cellulose kết tinh[ Teeri, 1997 ] 26 SVTH: Nguyễn Thị Hương v ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG Hinh 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly Hynes, 1985 ] 29 Hình 2: Kết Southern Blot chủng biến đổi 30 Hinh 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII 32 Hình 4: Kết Southern Blot chủng biến đổi 32 Hình 5: Kết Southern Blot chủng biến đổi 33 Hình 6: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn plasmid pALK537 egl2 nối với promoter cbh1 Đoạn NotI 9.2 kb tách từ plasmid để thực biến đổi 35 Hình 7: Giới hạn plasmid pALK540 Đoạn ClaI-PvuI 11.6 kb tách từ plasmid để thực biến đổi 36 Hình 8: Southern blotting chủng ALKO3530 ALKO3574 37 Hình 9: Các plasmid sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu gen cel45A, cel7A, cel7B M.albomyces 40 Hình 10: phát triển hình thái sợi nấm môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D) 45 Hình 11: đặc điểm hình thái sợi nấm theo thời gian môi trường khác Môi trường A ( ), môi trường B ( ), môi trường C ( ), môi trường D ( ) 47 Hình 12: ảnh hưởng pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) T.reesei QMY-1 chất alpha cellulose 48 Hình 13: ảnh hưởng pH khác đến sản lượng filter paper activity (FPA) T.reesei QMY-1 chất CTMP 49 Hình 14: Ảnh hưởng áp suất đến khả tạo cellulase 50 Hình 15: Ảnh hưởng trình sục khí ( ) khơng sục khí ( ) trình lên men 51 SVTH: Nguyễn Thị Hương vi ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Lời Mở Đầu Cellulose chất hữu tổng hợp nhiều giới nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ hàng năm loài thực vật tạo Đây loại polymer sử dụng nhiều (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải, ) Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ cellulose tạo năm cần phải phân hủy, khơng chúng tích tụ lại gây nguy hiểm cho hệ sinh thái Những năm gần đây, nguồn lượng hóa thạch ngày cạn kiệt Dưới áp lực trên, nguồn lượng tái tạo quốc gia quan tâm Việc sử dụng cellulase Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose thành ethanol nghiên cứu áp dụng Việt Nam có nguồn sinh khối tự nhiên dồi Thêm vào đó, nước ta nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú đa dạng Enzym Cellulase phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid cellulose tạo sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzym cellulase lớn vi sinh vật Trong đó, vi nấm Trichoderma nguồn thu enzyme cellulase quan trọng enzyme có hoạt tính cao Mục đích đề tài tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase số phương pháp nâng cao khả phân hủy cellulose Để từ đó, giải vấn đề ―nóng‖ Việt Nam giới SVTH: Nguyễn Thị Hương vii ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG PHẦN 1: TỔNG QUAN I Giới thiệu nấm mốc Trichoderma reesei Lịch sử phát Gần 200 năm trước, Trichoderma phát lồi biết Trichoderma viride Hơn 150 năm sau, Trichoderma đối tượng vài nhà phân loại nấm học không hấp dẫn mối quan tâm ngành khoa học khác Tình hình thay đổi Thế Chiến lần thứ II, quân đội Mỹ cảnh báo tượng trang bị quân bị mục xứ nhiệt đới, đặc biệt Nam Thái Bình Dương Chương trình điều tra quân đội Mỹ Trichoderma "viride" mã số QM 6a loài nấm phân hủy cellulose khu vực Sự nhầm lẫn kéo dài suốt 20 năm chủng Trichoderma QM 6a nhận diện đặt tên lại Trichoderma reesei để tỏ lòng tơn kính người khám phá lồi Elwyn T Reese, tác giả làm việc viện nghiên cứu Natick với cộng tác Mary Mandels nghiên cứu nhiều đề tài sinh tổng hợp, chế phân hủy cellulose hợp chất polysaccharides khác chủng Trichoderma reesei thể đột biến chủng Nhờ cơng trình mà nhiều phòng thí nghiệm khác Mỹ, Châu Âu Châu Á tiếp tục nghiên cứu khám phá hệ thống phân giải cellulose Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng thời điểm đó, Rifai Webster Anh lần phân loại mô tả lồi Trichoderma Việc ni cấy dễ dàng không tốn kém, chủng Trichoderma lôi kéo nhà nghiên cứu vào hướng nghiên cứu Trichoderma ứng dụng phân giải cellulose chúng Một phát quan trọng nghiên cứu Trichoderma khả kích thích tăng trưởng cho trồng khả đối kháng với loài nấm bệnh giúp Trichoderma dùng tác nhân kiểm sốt sinh học nơng nghiệp Ngày nay, lĩnh vực trở thành hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới [Theo Christian P Kubicek Gary E Harman] SVTH: Nguyễn Thị Hương ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Đặc điểm sinh học nấm mốc T.reesei 2.1 Vị trí phân loại Ban đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota Tiến Sinh học phân tử kỹ thuật kính hiển vi điện tử đem lại diện mạo cho việc nghiên cứu phân loại học sinh lý học nấm Nấm chia thành 10 ngành (subphylum) Ascomycota Basidiomycota xếp vào ngành Dikarya, Chytridiomycota xếp vào ngành riêng biệt, số Chytridiomycota Zygomycota xếp bảng phân loại Bảng 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm SVTH: Nguyễn Thị Hương ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS ( CBS Course of Mycology) , lần xuất thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Lồi: Trichoderma reesei 2.2 Đặc điểm hình thái Trichoderma sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên chứa chất nguyên sinh lưu động Về chiều dài chúng có sinh trưởng vơ hạn đường kính thường thay đổi phạm vi 1-30µm (thơng thường 510 µm) Khuẩn ty vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, cuối nhóm phát triển thành khối tròn mang bào tử trần khơng có vách ngăn, không màu, liên kết với thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh đặc trưng, màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử ln đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hình thn Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi vùng kéo dài (extension zone) Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng dài đến 30 µm Dưới phần thành tế bào dày lên không sinh trưởng thêm Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào Trên màng nguyên sinh chất có số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người ta gọi biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome) SVTH: Nguyễn Thị Hương ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Hình 9: Các plasmid sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu gen cel45A, cel7A, cel7B M.albomyces Các chủng sau biến đổi kiểm tra có mặt gen biến đổi khảo sát lượng CBHI, EGI tổng hợp chủng 1.3.2 Kết Bản thay vào chủng biến đổi ALKO3620/1231/14, ALKO3629/1231/16, ALKO3620/1235/49 ALKO3620/1235/40 sản xuất đ ạt 210 –2 50 NCU/ml 70 ◦ C (bảng ) Phân tích cassette biểu thấy locus cbh1 egl1 khơng có ảnh hưởng đáng kể tới mức độ hoạt động tạo enzyme Hoạt động enzyme endoglucanase chủng ALKO3620/1235/40 ALK O3 62 0/1 23 5/4 biến đổi tạo EGI thấp so với chủng ALKO 36 20/ 12 31/ 14 ALKO3620/1231/16 biến đổi tạo CBHI.endoglucanase ho ạt động tối ưu 700 C sau 20 phút Chủng biến đổi sản xuất lượng endoglucanase cao so với chủng chủ M albomyces ALKO4237 (bảng 2.5) Khoảng 38% chủng biến đổi ALKO3620/pALK1238 khơng t ạo CBHI khoảng 23% chủng biến đổi ALKO3620/ pALK1240 khơng tạo EGI Gen cbh1 T.reesei SVTH: Nguyễn Thị Hương 40 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG thay đoạn plasmid pALK1238 biểu ALKO3620/1238/42 gen egl1 thay pALK1238 biểu ALKO3620/1240/32 Trong môi trường nuôi cấy bề mặt, chủng ALK3620/1238/42 tạo 470 NCU/ml 50 ◦ C, 600 NCU/ml 70 ◦ C ALKO3620/1240/32 tạo 170 NCU/ml 50 ◦ C 35 00 NCU/ml 70 ◦ C Bảng 5: Sản xuất cellulase chủng M albomyces ALKO4237, chủng chủ Trichoderma ALKO3620 (egl2) chủng T.reesei biến đổi chép cel45A, cel7A cel7B thay gen cbh1 hay egl1 n.a-không xác định SVTH: Nguyễn Thị Hương 41 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG II Phương pháp cổ điển: 2.1 Ảnh hưởng thành phần mơi trường lên hình thái T.reesei việc sản xuất enzyme cellulase Tóm tắt Mục đích nghiên cứu xác định hình thái nấm ảnh hưởng đến khả sản xuất cellulase Trichoderma reesei nuôi cấy môi trường lactose lactobionic acid kiểu fed-batch bồn bioreactor lít Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ môi trường nuôi cấy cho hiệu suất sản xuất enzyme cao với thể tích enzyme có hoạt tính 69.8U/L.h, sinh khối nấm men cực đại 14.7g/l Những phát kèm theo đặc điểm hình thái nấm: tổng sợi nấm 98% tổng diện tích ước lượng, với chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm3, đường kính 7.9μm, số lượng nhánh 9, số lượng đỉnh sợi nấm 29 Một tương quan rõ ràng tìm thấy sợi nấm, số lượng đỉnh khả sản xuất enzyme cellulase Chủng bào tử T.reesei C30 Đĩa petri Môi trường nuôi cấy trung gian Bioreactor Môi trường sản xuất Xác định nồng độ cellulose SVTH: Nguyễn Thị Hương Xác định lượng sinh khối khơ Quan sát hình thái 42 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Chủng T.reesei RUT-C30 cấy truyền vào môi trường thạch potato dextrose (potato dextrose agar-PDA) vô trùng đĩa petri Đĩa PDA sau ủ 30 0C ngày ( đến hình thành bào tử xảy tốt) bảo quản nhiệt độ 0C giữ -80 0C để sử dụng lâu Kích thước bào tử nấm tính phương trình dưới, giả sử bào tử có hình cầu hai kích thước chúng giống hình tròn Trong đó: Vs thể tích bào tử D s đường kính bào tử Kích thước sợi nấm ước lượng sợi nấm xem hình trụ rắn Kích thước sợi nấm tính cơng thức sau: Trong Vh thể tích sợi nấm, Dh đường kính sợi nấm Lh chiều dài sợi nấm T.reesei nuôi cấy loại môi trường khác nhằm kiểm tra hình thái kích thước bào tử sợi nấm đồng thời khảo sát khả sản xuất cellulase Môi trường A: 10 g/l cellulose, 10 g/l nấm men, 10 g/l glucose, 1.4 g/l (NH4)2SO4, g/l KH2PO4, 0.4 g/l CaCl 2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4 7H2 O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0037 g/l CoCl 6H2 O, 0.0016 g/l MnSO4.H2 O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O Môi trường B: 10 g/l glucose, 5.1 g/l bã ngơ( acid hóa làm ẩm), 1.4 g/l (NH4)2SO4, g/l KH2 PO4 , 0.5 g/l CaCl 2.2H2 O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2 O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O Môi trường C: 7.5 g/l cellulose, 0.3 g/l nấm men, 0.8 g/l peptone, g/l urea , 1.4 g/l (NH4)2SO4, g/l KH2 PO4 , 0.3 g/l CaCl 2.2H2 O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.02 g/l CoCl 2.6H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2 O SVTH: Nguyễn Thị Hương 43 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Mơi trường D: 10 g/l glucose, 6.7 g/l đạm nấm men, g/l KH2PO4, 20 g/l carboxymethylcellulose (CMC) Kết cho thấy sinh khối khô môi trường A đạt đến nồng độ 14.7 g/l vào cuối giai đoạn giảm dần sau thêm hỗn hợp lactose acid lactobionic tác nhân gây ức chế Sinh khối khô đạt môi trường B, C, D tương ứng gấp 1.6, 3.3, 2.0 lần so với môi trường A (bảng 2.5) Các sinh khối tích lũy qua thời gian, giả thiết có mối quan hệ mạnh mẽ tổng hợp cellulase nồng độ sinh khối tổng Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hình thái T.reesei Trichoderma reesei ni mơi trường khác biểu hình dạng sợi nấm khác quan sát kính hiển vi điện tử hình 10.Hình 10 minh họa thành phần môi trường ảnh hưởng đến phát sinh hình thái nấm Các sợi nấm nảy chồi cực đại 120h sau giảm dần Nếu ni cấy mơi trường B sợi nấm nảy chồi giảm lần, môi trường C giảm lần môi trường D giảm lần so với mơi trường A (hình 10 ) Hình 10 cho thấy hoạt động enzyme cellulase cao điểm 120h Lượng bào tử quan sát nhiều 50% mơi trường B, C, D (hình 10B) Trong môi trường A, sợi nấm phân nhánh chủ yếu 10h lên men, nhánh hình thành khoảng 24h sau bắt đầu giai đoạn lên men ( hình 10C) SVTH: Nguyễn Thị Hương 44 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Hình 10: phát triển hình thái sợi nấm môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D) 2.1.1 Sự phát triển hệ sợi nấm Hình thái sợi nấm ảnh hưởng đến suất tạo enzyme mơi trường A (hình 11) Hình ảnh từ kính điện tử qt (hình 11A 11B) cho thấy sợi nấm phân nhánh nhiều, dài linh động sợi nấm dài phân nhánh làm tăng bề mặt tiếp xúc nấm, làm tăng tương tác với chất , suất sản xuất enzyme cao (De Nicolas- Santiago et al.,2006) Túi bào tử đầu bào tử đính hình thành cuống bào tử đính (hình 11E) Số lượng đỉnh phát triển từ sợi nấm dấu hiệu tích lũy sinh khối mơi trường ni cấy (hình 11C 11 D) Protein tiết từ sợi nấm chủ yếu đỉnh sợi nấm phát triển Điều giải thích đỉnh có nhiều lỗ hổng làm cho dễ dàng cho enzyme ngo ại bào qua khỏi vách tế bào (Peberdy, 1994 ; Punt et al.,1994) Vì vậy, tăng số lượng đỉnh sợi nấm hoạt động làm tăng suất protein (Juge et al.,1998; Pluschkell et al., 1996) Hình 11 cho thấy phát triển đặc điểm sợi nấm phụ thuộc thời gian Hình 11D ta thấy chiều dài tối đa sợi nấm môi trường A dài ( môi trường A: chiều dài tối đa 10 mm, môi trường B mm, môi trường C mm môi trường SVTH: Nguyễn Thị Hương 45 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG D mm) Hình 11E – H mơ tả thay đổi đặc điểm hình thái sợi nấm phụ thuộc thời gian môi trường thử Trong môi trường A, đường kính sợi nấm thay đổi sau đ ạt giá trị lớn 7.9 µm đường kính sợi nấm mơi trường B 6.1 µm, C 6.2 µm, D 4.3 µm (hình 11E) Hình 11F cho thấy tăng thể tích sợi nấm mơi trường A lớn Hình 11G , môi trường A số lượng nhánh tăng theo thời gian số lượng nhánh sợi nấm nhỏ so với môi trường khác điểm mà enzyme hoạt động Trong môi trường A, số lượng đỉnh sợi nấm đạt cực đại 29 đỉnh/ sợi nấm thời điểm enzyme hoạt động (120h) , mơi trường B đạt đỉnh/ sợi nấm, môi trường C đỉnh/ sợi nấm, môi trường D đỉnh/ sợi nấm (hình 11H) SVTH: Nguyễn Thị Hương 46 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Hình 11: đặc điểm hình thái sợi nấm theo thời gian môi trường khác Môi trường A ( ), môi trường B ( ), môi trường C ( ), môi trường D ( ) SVTH: Nguyễn Thị Hương 47 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG 2.2 Ảnh hưởng qua lại pH chất môi trường nuôi cấy đến khả sản xuất cellulase Mỗi chất vi sinh vật định thích hợp pH khác ảnh hưởng tới sản lượng sản phẩm Theo báo cáo c Andreotti et al T.reesei sinh trưởng tốt môi trường nuôi cấy pH =5 chậm pH 4.5 Tuy nhiên, Chahal et al cho thấy T.reesei sản xuất cellulase tối ưu pH=6.0 Hình 12: ảnh hưởng pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) T.reesei QMY-1 chất alpha cellulose Kí hiệu: Với chất alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) hoạt tính T.reesei tối ưu pH 5.0 Tại pH 5.0 6.0 lượng FPA đạt tối ưu 3.2 3.0 IU/ml sau 99h (Hình 12) Sản lượng cellulase thấp pH 3.0 7.0 Tuy nhiên, tài liệu cơng bố trước pH 3.0 (2,4,7), pH 4,0 (10), pH 5,0 (4) cho sản lượng cellulase cao nấm T reesei Trong thử nghiệm khác , pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4,0 IU / ml vòng 91 h SVTH: Nguyễn Thị Hương 48 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Hình 13: ảnh hưởng pH khác đến sản lượng filter paper activity (FPA) T.reesei QMY-1 chất CTMP Kí hiệu : Với chất CTMP (chứa 60% cellulose, phần lại hemicelluloses lignin) hoạt tính T.reesei tối ưu pH 6.0 Lượng FPA thu 2.02IU/ml pH 6.0 1.87IU/ml pH 5.0 sau 139h 117 h (Hình 13) Ta nhận thấy chất cảm ứng chứa nhiều cellulose sản lượng FPA cao đạt sản lượng tối ưu thời gian ngắn Với chất alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) FPA đạt gấp 1.5 lần so với chất CTMP (chứa 60% cellulose ) Và pH tối ưu phụ thuộc chất Nếu chất alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) pH tối ưu Nếu chất CTMP (chứa 60% cellulose ) pH tối ưu SVTH: Nguyễn Thị Hương 49 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG 2.3 Ảnh hưởng áp suất đến khả tạo cellulase Hình 14: Ảnh hưởng áp suất đến khả tạo cellulase Giai đoạn đầu trình lên men , enzyme tạo thành đạt tỷ lệ cao đáng kể áp suất cao ,quá trình lên men gần hoàn thành sau 48 h, suất tăng 12,2-16,7 FPU/1/h (Hình 14) Tuy nhiên, sản lượng cuối cellulases giống cho trình lên men áp suất thường SVTH: Nguyễn Thị Hương 50 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG 2.4 Ảnh hưởng sục khí khơng sục khí đến khả sản xuất cellulase T.reesei RUT C30 Hình 15: Ảnh hưởng q trình sục khí ( ) khơng sục khí ( ) q trình lên men Trong trình lên men chủng Rut C30 tốt lên men điều kiện khơng sục khí SVTH: Nguyễn Thị Hương 51 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG Điều kiện ni cấy chủng T.reesei Bảng 6: So sánh sản lượng tế bào thu nuôi cấy liên tục nấm T.reesei Nhận xét: chủng Trichoderma sp đạt tối ưu môi trường chất glucose Chủng Rut C30 chủng thích hợp với nhiều chất khác (glucose, lactose, mùn cưa )và cho suất tương đối cao Do đó, chủng Rut C30 sử dụng phổ biến PHẦN 3: KIẾN NGHỊ Hai phương pháp cổ điển đại báo cáo khác Theo nghĩ, có điều kiện nên khảo sát chung để tạo chủng có khả sản xuất cellulase cao Bằng cách đột biến tạo chủng tốt sau ni điều kiện tối ưu SVTH: Nguyễn Thị Hương 52 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tài liệu nước Hồ Huỳnh Thùy Dương Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễ Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương Công nghệ lên men Nhà xuất đại học quốc gia TP.HCM, 2004 Nguyễn Đức Lượng,Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường Công nghệ gen Nhà xuất đại học quốc gia TP.HCM, 2007 Tài liệu nước G C Ainsworth and al The Fungi New York and London: Academic Press, 1, pp.1963-1973 Ainsworth and Bisby, 1995 Dictionary of the Fungi David S HIBBETT and al, 2007 A higher-level phylogenetic classification of the Fungi Mycological Research, III, pp 509 – 547 Markus Linder and Tuula T Teeri , 1997 The roles and function of cellulosebinding domains, Journal of Biotechnology, 57, pp 15-28 Martin Schülein, 2000 Protein engineering of cellulases, Biochimica Et Biophysica Acta, 1543, pp 239 – 252 Edward A Bayer and al, 1998 Cellulose, cellulases and cellulosomes Current Opinion in Structural Biology, 8, pp 548 – 557 10 Ilan Levy and Oded Shoseyov, 2002 Cellulose-binding domains Biotechnological applications Biotechnology Advances, 20, pp 191–213 11 M L Rabinovich and al, 2002 Microbial Cellulases Applied Biochemistry and Microbiology, 38, pp 305–321 12 Prabuddha Bansal and al, 2009 Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates Biotechnology Advances, 27, pp 833–848 SVTH: Nguyễn Thị Hương 53 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG 13 Yong-Hong Wang et al, 2009 Production and distribution of β-glucosidase in a mutant strain Trichoderma viride T 100-14 New Biotechnology, 26, pp 150-156.ra Tài liệu mạng internet 14 K howww.en.wikipedia.org 15 http://www.khuyennongvn.gov.vn/e-khcn/vai-tro-nam-111oi-khang- trichoderma-trong-kiem-soat-cac-sinh-vat 16 http://www.mps.lu.se/people/tjerneld/enzymatic_conversion_of_cellulose/ SVTH: Nguyễn Thị Hương 54 ... Trong đó, vi nấm Trichoderma nguồn thu enzyme cellulase quan trọng enzyme có hoạt tính cao Mục đích đề tài tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase số phương pháp nâng cao khả phân hủy cellulose Để... 2.2 Phân loại: 19 2.3 Cơ chế hoạt động: 20 2.4 Hệ thống cellulase Trichoderma reesei : 22 Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả phân hủy cellulose cao. .. hàng loạt enzyme phân hủy cellulose nghiên cứu kỹ T viride (reesei) Trichoderma tiết lượng lớn enzyme khác nhau, có khả phối hợp để phân hủy tinh thể cellulose T reesei sản sinh enzyme endoglucanase,