TÌM HIỂU VỀ VI KHUẨN SALMONELLA

Đầu tiên con xin gởi đến cha mẹ thân yêu ở quê nhà lời cản ơn chân thành nhất, những người đã dành mọi yêu thương và luôn luôn động viên con về tinh thần cũng như vật chất suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã đồng ý cho tôi thực hiện đề tài này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến KS. Huỳnh Văn Thành và KS. Phạm Minh Nhựt đã tận tâm hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Xin cám ơn các bạn bè tôi đã luôn luôn ở bên cạnh và ủng hộ tinh thần trong suốt quá trình làm khóa luận TpHCM, ngày 24 tháng 06 năm 2010 NGUYỄN HỮU LIÊM MỤC LỤC TRANG Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục các hình v Danh mục các bảng vi Danh mục các từ viết tắt vii Chương I: Giới thiệu 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích 1 1.3 Nội dung nghiên cứu 1 Chương II: Tổng quan 2 2.1 Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm 2 2.1.1 Escherichia Coli 2 2.1.1.1 Giới thiệu 2 2.1.1.2 Phân loại 2 2.1.1.3 Đặc điểm 2 2.1.1.4 Yếu tố độc lực 3 2.1.1.5 Khả năng gây bệnh 9 2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan 9 2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát 9 2.1.2 Listeria monocytogenes 9 2.1.2.1Giới thiệu 9 2.1.2.2 Phân loại 10 2.1.2.3 Đặc điểm 10 2.1.2.4 Yếu tố độc lực 10 2.1.2.5 Khả năng gây bệnh 12 2.1.2.6 Các thực phẩm liên quan 12 2.1.2.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát 12 2.2 Tổng quan về Salmonella sp. 13 2.2.1 Lịch sử phát hiện 13 2.2.2 Phân loại 13 2.2.3 Đặc điểm 14 2.2.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy 14 2.2.3.2 Tính chất hóa sinh 15 2.2.4 Cấu trúc của Salmonella 15 2.2.5 Yếu tố độc lực 17 2.2.5.1 Nội độc tố Endotoxin 17 2.2.5.2 Độc tố đường ruột 18 2.2.5.3 Độc tố tế bào 19 2.2.6 Cơ chế gây bệnh 19 2.2.6.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn 20 2.2.6.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn 21 2.2.7 Nguồn gốc lây nhiễm 21 2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam và trên thế giới 22 2.2.8.1 Trên thế giới 22 2.2.8.2 Trong nước 23 2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella 24 2.3.1 Phương pháp truyền thống 24 2.3.1.1 Nguyên tắc 24 2.3.1.2 Phương pháp thực hiện 25 2.3.2 Phương pháp hiện đại 29 2.3.2.1 Phương pháp PCR 30 2.3.2.2 Phương pháp ELISA 34 2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm 34 Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Địa điểm và thời gian 36 3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 36 3.3 Vật liệu tiến hành thí nghiệm 36 3.3.1 Các dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 36 3.3.2 Các môi trường sử dụng 36 3.4 Nội dung thực hiện 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu 38 3.5.1 Quy trình phân tích 38 3.5.2 Thuyết minh quy trình 39 3.6 Kết quả 45 3.6.1 Kết quả cảm quan 45 3.6.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella 46 Chương IV: Kết luận và kiến nghị 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1 Vi khuẩn Escherichia Coli 3 Hình 2.2 Vi khuẩn Lisria monocytogenes 10 Hình 2.3 Vi khuẩn Salmonella 15 Hình 2.4 Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD 27 Hình 2.5 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường HE 27 Hình 2.6 Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường BS 28 Hình 3.1 Sơ đồ nội dung thực hiện thực nghiệm 37 Hình 3.2 Quy trình phân tích Salmonella trong thực nghiệm 38 Hình 3.3 Khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Salmonella 39 Hình 3.4 Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI 40 Hình 3.5: Thử nghiệm Urea Broth 41 Hình 3.6: Lên men Mannitol 42 Hình 3.7: Thử nghiệm LDC 43 Hình 3.8: Thử nghiệm Indol 44 Hình 3.9: Thử nghiệm Voges – Proskauer 45 Hình 3.10 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên các mẫu khảo sát 40 DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1 Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa 29 Bảng 3.1 Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25 g mẫu 45 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VP: Voges – Proskauer STEC: Shiga toxinproducing E.Coli VTEC: Verotoxigenic E.Coli EHEC: Enterohaemorrhagic E.Coli EPEC: Enteropathogenic E.Coli ETEC: Enterotoxigenic E.Coli EAEC: Enteroaggregative E.Coli EIEC: Enteroinvasive E.Coli) Stx : Shigatoxin Gb: globotriaosylceramide HC: Haemorrhagic colitis AE: attachingandeffacing CF: colonization factor LT: Heatlabile toxin CT: cholera toxin ST: Heatstable toxin GCC: guanylate cyclase C AAF: aggregative adhesion fimbriae EAST1: enteroaggregative heat – stabe toxin – 1 Ipa : Invasion plasmid antigen LLO: Listeriolysin O XLD: xylose lysine deoxycholate LPS : lypopolysaccharide RPF : Rapid permeability facto DPF : Delayed permeability facto CHO: Chinese Hamster Ovary cell SPI – 1: Salmonella pathogenicity island RV : Rappaport Vassiliadis LDC: Lysine decarboxylase ODC: Ornithine decarboxylase TSI : Triple Sugar Iron HE : Hektoen Entric Agar BS: Bismuth Sulphite Agar BPW : Buffered Pepton Water BPLS: Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng nghiêm trọng. Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tôi thực hiện nghiên cứu đề tài “tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác. 1.2 Mục đích Tổng quan về một số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm và tìm hiểu về Salmonella với độc tố của nó. 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố và cơ chế gây độc của một số chủng vi sinh vật. Nghiên cứu về cách phát hiện Salmonella và đề xuất biện pháp phòng ngừa. Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm 2.1.1 Escherichia Coli 2.1.1.1 Giới thiệu Escherichia Coli do Theodore Escherich (1857 – 1911), một bác sĩ nhi khoa người Áo phát hiện năm 1885. E.Coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở đường ruột, nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng. E.Coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. Trong đó, chủng E.coli K12 là mô hình được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã thu được dựa trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. 2.1.1.2 Phân loại Về phân loại, Escherichia Coli được xếp vào:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: Escherichia Coli 2.1.1.3 Đặc điểm E.Coli là trực khuẩn, Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 µm × 0,5 µm. Một số ít chủng E.Coli có vỏ, nhưng hầu hết đều có lông và có khả năng di động. E.Coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có khả năng sinh hơi E.Coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng được nguồn carbon của citrat trong môi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả năng phân giải carborxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h có thể dương tính . Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli 2.1.1.4 Yếu tố độc lực Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc tố khác nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxinproducing E.Coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli). a) Nhóm STEC Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E.Coli này. Tên gọi Verotoxigenic E.Coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng tác viên (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero. Tên gọi Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết và hội chứng huyết niệu (Nataro và Kaper, 1989). Và thuật ngữ Shiga toxinproducing E.Coli (STEC) (trước đây gọi là Shigalike toxin producing E.Coli SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga. STEC sản xuất độc tố Shigalike toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2. Hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B có khối lượng phân tử 7,7 kDa và 1 tiểu đơn vị A có khối lượng phân tử 32 kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một Nglycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phù thủng ở heo.

Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Lời cảm ơn - Đầu tiên xin gởi đến cha mẹ thân yêu quê nhà lời cản ơn chân thành nhất, người dành yêu thương luôn động viên tinh thần vật chất suốt trình học tập thời gian làm khóa luận tốt nghiệp - Cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Môi trường Công nghệ sinh học đồng ý cho thực đề tài - Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến KS Huỳnh Văn Thành KS Phạm Minh Nhựt tận tâm hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài - Xin cám ơn bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ tinh thần suốt q trình làm khóa luận TpHCM, ngày 24 tháng 06 năm 2010 NGUYỄN HỮU LIÊM GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm i Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella MỤC LỤC TRANG Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn Mục lục ii Danh mục hình v Danh mục bảng vi Danh mục từ viết tắt vii Chương I: Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Nội dung nghiên cứu .1 Chương II: Tổng quan 2.1 Tổng quan số vi sinh vật nhiễm thực phẩm 2.1.1 Escherichia Coli 2.1.1.1 Giới thiệu 2.1.1.2 Phân loại 2.1.1.3 Đặc điểm 2.1.1.4 Yếu tố độc lực 2.1.1.5 Khả gây bệnh 2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan 2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa kiểm sốt 2.1.2 Listeria monocytogenes 2.1.2.1Giới thiệu 2.1.2.2 Phân loại 10 2.1.2.3 Đặc điểm 10 2.1.2.4 Yếu tố độc lực 10 2.1.2.5 Khả gây bệnh 12 2.1.2.6 Các thực phẩm liên quan 12 ii GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella 2.1.2.7 Biện pháp phòng ngừa kiểm soát 12 2.2 Tổng quan Salmonella sp 13 2.2.1 Lịch sử phát 13 2.2.2 Phân loại .13 2.2.3 Đặc điểm 14 2.2.3.1 Đặc điểm chung đặc điểm nuôi cấy .14 2.2.3.2 Tính chất hóa sinh 15 2.2.4 Cấu trúc Salmonella .15 2.2.5 Yếu tố độc lực .17 2.2.5.1 Nội độc tố - Endotoxin .17 2.2.5.2 Độc tố đường ruột 18 2.2.5.3 Độc tố tế bào 19 2.2.6 Cơ chế gây bệnh 19 2.2.6.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn 20 2.2.6.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn .21 2.2.7 Nguồn gốc lây nhiễm 21 2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella Việt Nam giới 22 2.2.8.1 Trên giới .22 2.2.8.2 Trong nước .23 2.3 Các phương pháp phát Salmonella 24 2.3.1 Phương pháp truyền thống 24 2.3.1.1 Nguyên tắc .24 2.3.1.2 Phương pháp thực 25 2.3.2 Phương pháp đại 29 2.3.2.1 Phương pháp PCR 30 2.3.2.2 Phương pháp ELISA 34 2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella thực phẩm 34 Chương III: Nội dung phương pháp nghiên cứu .36 3.1 Địa điểm thời gian .36 iii 3.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 36 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella 3.3 Vật liệu tiến hành thí nghiệm 36 3.3.1 Các dụng cụ hóa chất thí nghiệm 36 3.3.2 Các môi trường sử dụng .36 3.4 Nội dung thực 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu .38 3.5.1 Quy trình phân tích .38 3.5.2 Thuyết minh quy trình 39 3.6 Kết 45 3.6.1 Kết cảm quan .45 3.6.2 Kết đánh giá mức độ nhiễm Salmonella .46 Chương IV: Kết luận kiến nghị .47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1 Vi khuẩn Escherichia Coli Hình 2.2 Vi khuẩn Lisria monocytogenes 10 Hình 2.3 Vi khuẩn Salmonella .15 Hình 2.4 Khẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường XLD 27 Hình 2.5 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella mơi trường HE 27 Hình 2.6 Khẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường BS .28 Hình 3.1 Sơ đồ nội dung thực thực nghiệm 37 Hình 3.2 Quy trình phân tích Salmonella thực nghiệm 38 Hình 3.3 Khuẩn lạc đặc trưng vi khuẩn Salmonella .39 Hình 3.4 Thử nghiệm mơi trường thạch TSI 40 Hình 3.5: Thử nghiệm Urea Broth .41 Hình 3.6: Lên men Mannitol .42 Hình 3.7: Thử nghiệm LDC 43 Hình 3.8: Thử nghiệm Indol 44 Hình 3.9: Thử nghiệm Voges – Proskauer 45 Hình 3.10 Tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu khảo sát 40 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1 Biểu đặc trưng Salmonella test sinh hóa .29 Bảng 3.1 Phát hay không phát Salmonella 25 g mẫu 45 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm vi Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VP: Voges – Proskauer STEC: Shiga toxin-producing E.Coli VTEC: Verotoxigenic E.Coli EHEC: Enterohaemorrhagic E.Coli EPEC: Enteropathogenic E.Coli ETEC: Enterotoxigenic E.Coli EAEC: Enteroaggregative E.Coli EIEC: Enteroinvasive E.Coli) Stx : Shigatoxin Gb: globotriaosylceramide HC: Haemorrhagic colitis A/E: attaching-and-effacing CF: colonization factor LT: Heat-labile toxin CT: cholera toxin ST: Heat-stable toxin GCC: guanylate cyclase C AAF: aggregative adhesion fimbriae EAST1: enteroaggregative heat – stabe toxin – Ipa : Invasion plasmid antigen LLO: Listeriolysin O XLD: xylose lysine deoxycholate LPS : lypopolysaccharide RPF : Rapid permeability facto DPF : Delayed permeability facto CHO: Chinese Hamster Ovary cell SPI – 1: Salmonella pathogenicity island RV : Rappaport Vassiliadis LDC: Lysine decarboxylase GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm vii Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella ODC: Ornithine decarboxylase TSI : Triple Sugar Iron HE : Hektoen Entric Agar BS: Bismuth Sulphite Agar BPW : Buffered Pepton Water BPLS: Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose viii GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày trở nên cấp thiết, báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo, tình trạng ngộ độc thực phẩm leo thang ngày nghiêm trọng Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… đó, Salmonella loài vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh nghiêm trọng khác Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu độc tố, khả gây bệnh cách phát cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tơi thực nghiên cứu đề tài “tìm hiểu vi khuẩn Salmonella” để có nhìn tổng quan vi khuẩn Salmonella số chủng vi sinh vật khác 1.2 Mục đích - Tổng quan số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm tìm hiểu Salmonella với độc tố 1.3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố chế gây độc số chủng vi sinh vật - Nghiên cứu cách phát Salmonella đề xuất biện pháp phòng ngừa GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan số vi sinh vật nhiễm thực phẩm 2.1.1 Escherichia Coli 2.1.1.1 Giới thiệu - Escherichia Coli Theodore Escherich (1857 – 1911), bác sĩ nhi khoa người Áo phát năm 1885 - E.Coli thành viên hệ vi khuẩn bình thường đường ruột, nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng - E.Coli sử dụng làm mơ hình nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực vi sinh học nói riêng sinh học nói chung Trong đó, chủng E.coli K12 mơ hình nghiên cứu nhiều Nhiều thành tựu di truyền học, hóa sinh học thu dựa sở nghiên cứu vi khuẩn 2.1.1.2 Phân loại - Về phân loại, Escherichia Coli xếp vào:  Giới: Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: Escherichia Coli 2.1.1.3 Đặc điểm - E.Coli trực khuẩn, Gram âm, kớch thc trung bỡnh t àm ì 0,5 µm Một số chủng E.Coli có vỏ, hầu hết có lơng có khả di động - E.Coli có khả lên men nhiều loại đường có khả sinh E.Coli có khả sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng nguồn carbon citrat mơi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả phân giải carborxyl lysin, ornithin, arginin acid glutamic Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h dương tính GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 10 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella + Thử nghiệm indol VP (-) Thử nghiệm H2S LDC Urea Manitol,sorbitol Indol VP Môi trường TSI/KIA Biểu đặc trưng Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch xuất LDC Urea Manitol, sorbitol Trypton vạch đen Không đổi màu Khơng đổ màu Bị acid hóa,mơi trường chuyển sang màu vàng Khơng xuất vòng đỏ nhỏ thuốc thử VP Kovac’s Không đổi màu nhỏ α – napthol 5% KOH 40% Bảng 2.1: Biểu đặc trưng Salmonella test sinh hóa - Các thử nghiệm kháng nguyên cần thử nghiệm song song với mẫu đối chứng nước muối sinh lý để tránh tượng ngưng kết giả Hai loại huyết đa giá cần dùng Salmonella Polyvalent O Salmonella Polyvalent H Phản ứng (+) chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết không ngưng kết với nước muối sinh lý 2.3.2 Phương pháp đại - Phương pháp truyền thống nhiều thời gian (5 ngày) kết quả, người ta phát triển nhiều phương pháp thử nhanh để phát Salmonella mẫu thực phẩm mẫu nước thời gian ngắn, từ có biện pháp xử lý kịp thời mẫu nhiễm Xu hướng sử dụng PCR IMS thường đượ c sử dụ ng Phương pháp PCR giúp phát nhanh; nhiên dễ xảy tượng âm tính giả, đòi hỏi thao tác phải thành thạo Multiplex PCR giúp tiết kiệm thời gian, số lượng mẫu chi phí; nhiên lại có độ nhạy Người ta phát triển thêm phương pháp Real Time PCR từ PCR truyền thống Phương pháp có độ nhạy cao, cho kết sớm hơn, không cần phải chạy điện di sau phản ứng khuếch đại Phương pháp miễn dịch từ phân tách lựa chọn tốt Nó có độ nhạy cao (< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm thực 4-5 giờ) - Bên cạnh kỹ thuật Sinh học phân tử để phát định danh Salmonella, có phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết học, kỹ thuật ELISA, Western blot) Và để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta cc̣n kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 35 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát Salmonella thực phẩm 2.3.2.1 Phương pháp PCR - Nguyên tắc : Phương pháp định tính dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có khuếch đại hay khơng Quá trình xác định thực cách điện di sản phẩm khuếch đại gel agarose, nhuộm màu ADN etyl bromua quan sát đèn UV có bước sóng 302 mm Nếu mẫu có gen đích, bảng gel điện di xuất sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài đoạn ADN đích định Nếu mẫu khơng có gen đích, gel diện di khơng xuất sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khơng phù hợp với đoạn ADN đích - Thiết bị, dụng cụ, hố chất mơi trường + Thiết bị, dụng cụ + Tủ ấm 37oC + Máy luân nhiệt + Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml + Máy lắc ống nghiệm + Thiết bị điện di ngang nguồn điện di có điện hoạt động từ 80 đế 150 volt + Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm + Bộ chụp ảnh đèn UV + Ống Eppendorf 0,2 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR + Hoá chất, môi trường - Mồi gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trò q trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau : + invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' + invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha lỗng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật loại hoá chất khác : Khuyến khích sử dụng mơi trường ni cấy dạng bột khơ vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR tổng hợp thành kit lưu hành thị trường có thành phần phù hợp Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp sử dụng vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết thành phần nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh sinh học phân tử GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 36 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Thang DNA :Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp - Agarose : Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp - Phương pháp tiến hành + Lấy mẫu : Cân xác 25 g mẫu (hoặc khối lượng xác tuỳ theo yêu cầu) cho vào bình tam giác bao PE vô trùng + Tăng sinh : Nhằm làm tăng số lượng Salmonella mẫu, tế bào bị suy yếu hay tổn thương phục hồi phát triển Giai đoạn tiến hành môi trường không chọn lọc nguyên tắc phần khối lượng mẫu bổ sung phần khối lượng môi trường tăng sinh Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm Ủ mẫu có mơi trường tăng sinh nhiệt độ 37,0oC 1,0oC khoảng 18 giờ + Xử lý mẫu giải phóng DNA : Giai đoạn nhằm thu nhận sinh khối sau tăng sinh, rửa môi trường sau nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng DNA Cách xử lý sau:  Lắc canh khuẩn tăng sinh Hút 0,5 ml vào ống eppendorf tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút phút loại bỏ phần môi trường lỏng bên Rửa sinh khối bên với nước cất vô trùng tiếp tục ly tâm với chế độ để loại bỏ phần nước  Huyền phù sinh khối ống với 0,5 ml nước cất vô trùng Ðun sôi cách thuỷ 10 phút Ly tâm huyền dịch sau đun với tốc độ 10 000 vòng/phút phút để lắng mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch bên coi khuôn DNA để tiến hành phản ứng khuếch đại - Khuếch đại + Giai đoạn nhằm làm tăng số lượng đoạn DNA đích máy luân nhiệt (thermocycler) hai mồi đặc trưng Quá trình khuếch đại tiến hành khoảng 30 chu kỳ + Chuẩn bị ống khuếch đại  Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào ống nghiệm PCR tích 0,2 0,5 ml, thêm vào ml mồi invA1 invA2 có nồng độ pM ml mẫu khuôn ADN Tổng thể tích ống khuếch đại 50 ml GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 37 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella  Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết  Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu nước cất vô trùng + Chương trình khuếch đại  Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: Duy trì nhiệt độ 95 oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi DNA mẫu Tiếp theo 35 chu kỳ, chu kỳ có bước sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20 oC điện di - Ðiện di sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị gel điện di agarose 1%  Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hồn tồn đệm TAE + Chuẩn bị dịch điện di  Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật + Ðiện di  Một giếng gel điện di sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn - Nhuộm DNA, quan sát sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu  Pha dung dịch nhuộm DNA sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di + Nhuộm gel  Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư + Quan sát, chụp hình  Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ DNA xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 38 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Ðọc giải thích kết + Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm + Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel + Mẫu kết luận âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp 2.3.2.2 Phương pháp ELISA - ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng để phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Kĩ thuật có độ nhạy khoảng 106CFU/ml nhiên phải thực bước tăng sinh tăng sinh chọn lọc trước thực phản ứng miễn dịch - Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) kit phát nhanh Salmonella spp dựa nguyên tắc E sanwich Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc cho vào giếng, có diện vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao vi sinh vật tạo phức hợp với kháng thể cố định giếng kháng thể tự có gắn enzyme peroxydase tạo thành phức hợp kép (sanwhich) Sau kháng thể có gắn enzyme dạng tự không tạo phức hợp sanwhich bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp sanwihch phát nhờ bổ sung chất phản ứng (ure peroxide teramethylbenzidine) Enzyme peroxide thủy phân chất tạo phản ứng màu xanh dương Phản ứng kết thúc cách bất hoạt enzyme dung dịch kết thúc làm acid hóa mơi trường lầm mơi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng Sự hình thành màu vàng chứng minh diện kháng nguyên hay vi sinh vật mục tiêu mật độ màu vi sinh vật xác định cách đo cường độ màu máy so màu 2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella thực phẩm - Đối với gia súc gia cầm: Trong chăn ni cần ý đề phòng bệnh tật cho chúng Phải kiểm tra thú y giết súc vật, điều làm tốt có hội bán xuất loại thịt nhiễm Salmonella Trong giết thịt phải đảm bảo tính riêng rẽ, tránh lây lan vi khuẩn, ý tới loại dụng cụ dùng giết thịt GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 39 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm chế biến nguyên liệu Chú ý thịt băm, patê thịt nghiền mà không ướp lạnh sau tạo điều kiện cho tồn khối nguyên liệu nhiễm trùng mau chóng - Đun sôi thực phẩm trước ăn biện pháp tốt Thịt ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài bình thường, đun phải đảm bảo nhiệt độ sơi bên miếng thịt (ít phút) Thực phẩm thừa, thực phẩm dự trữ phải đun lại trước ăn Với trứng bị nhiễm Salmonella sớm đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng ), phải chế biến chín hồn tồn, tuyệt đối khơng ăn sống hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột - Thực nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước vào khám định kỳ (1 năm/1 lần) người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm thực phẩm nấu chín Chương III : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian - Thời gian: Từ ngày 31/05/2010 đến ngày 12/06/2010 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 40 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Mơi trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh - Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh 3.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu phát Salmonella số mẫu thịt gà tươi sống địa bàn hai quận Phú Nhuận Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh 3.3 Vật liệu thí nghiệm 3.3.1 Các dụng cụ hóa chất tiến hành thí nghiệm - Kéo cắt mẫu - Pipet 1ml, 5ml, 10ml - Đĩa petri - Micropipet 10µl-200µl - Túi PE vơ trùng - Que cấy thẳng, que cấy vòng - Cân điện tử - Ống nghiệm khử trùng - Tủ ấm 37oC, 42oC - Nồi hấp khử trùng 121oC - Đèn cồn - Quả bóp cao su - Chai chịu nhiệt dung tích 500ml, 1000ml - Gía ống nghiệm inox - Tủ cấy - Bơng khơng thấm - Que cấy - Cồn 96o, 70o - Nước cất khử trùng 3.3.2 Các môi trường sử dụng - Môi trường BPW (Ấn Độ) - Môi trường RV (Ấn Độ) - Môi trường XLD (Ấn Độ) - Môi trường dùng để test sinh hóa : + LDC (Ấn Độ) + Manitol (Ấn Độ) + Urea (Merck) + VP (Ấn Độ) + TSI (Ấn Độ) + Trypton (Ấn Độ) 3.4 Nội dung thực Mẫu thịt gà Thu mẫu địa điểm khảo sát GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 41 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Đánh giá tiêu Cảm quan Salmonella 25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng 30 giây Nhận xét,nhất Kếtmẫu luậntrong -1 Hình 3.1: Nội dungđộthực thí nghiệm pha lỗng 10 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Quy trình phân tích Đem ủ 37oC 24 Lấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV Ủ 42oC ± 0,5 24 Cấy chuyển môi trường XLD ủ nhiệt độ 37 oC 24 KL đặc trưng Salmonella mơi trường XLD : tròn, lồi, suốt, có tâm đen đơi tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ Cấy chuyển vào mơi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP Hình 3.2: Quy trình phân tích Salmonella thí nghiệm 3.5.2 Ủ 37oC 24 Thuyết minh quy trình GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 42 SVTH: Nguyễn HữuBiểu Liêmhiện đặc trưng Salmonella : TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-); LDC(+); Indol(-); VP(-) Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella a) Chuẩn bị mẫu - Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy chất lỏng có), cho vào bao nilong vơ khuẩn Thêm vào 225ml môi trường PBW hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng mẫu độ pha loãng 10 -1 Đem ủ nhiệt độ 370C 24 b) Cấy mẫu - Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ 42 ± 0,5 oC 24 - Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD ủ nhiệt độ 370C 24 Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng salmonella mơi trường XLD: tròn, lồi, suốt , có tâm đen tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)… Hình 3.3: Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella - Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc ủ 37 ± 0,5oC 24 c) Thử nghiệm khẳng định - Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang mơi trường thử nghiệm sinh hóa Thực sau: • Thử nghiệm mơi trường TSI: - Hấp khử trùng môi trường TSI 1210C 15 phút phân phối môi trường vào ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 43 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella - Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc giống sâu vào đáy ống thạch nghiêng - Sau cấy xong ủ 370C vòng 24h – 48h - Salmonella lên men đường glucose môi trường TSI  phần nghiêng môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng - Salmonella có khả H2S  xuất vệt màu đen mơi trường TSI - Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng không bên ống nghiệm Negative Negative Positive Hình 3.4: Thử nghiệm mơi trường thạch TSI • Thử nghiệm Urea Broth: - Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất thị bromocresol purple - Ủ 370C khoảng 12h – 18h - Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu vàng - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 44 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella  Salmonella khơng phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường Sau nuôi cấy môi trường giữ nguyên màu tím Negative Negative Negative Hình 3.5: Thử nghiệm Urea Broth • Lên men mannitol: - Môi trường sử dụng mơi trường phenol red broth base có pH 7.4, thị mơi trường phenol red có màu đỏ chuyển thành màu vàng pH < 6.8 - Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần khẳng định - Ủ 370C 18 – 24h - Khả lên men chủng đánh giá dựa vào sinh acid sinh - Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng - Sinh (-): có bọt khí ống Durnham  Môi trường sau nuôi cấy salmonella bị acid hóa chuyển thành màu vàng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 45 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Positive Negative Hình 3.6: Lên men Mannitol • Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase): - Sử dụng môi trường Falkow - Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần khẳng định - Chất thị màu môi trường Bromocresol purple - Phản ứng (+): mơi trường giữ ngun màu tím ban đầu, canh khuẩn đục - Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng  Sau ni cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 46 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.7: Thử nghiệm LDC • Thử nghiệm khả sinh Indol: - Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 37oC - Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s - Quan sát sau vài phút - Thử nghiệm (+): bề mặt mơi trường xuất vòng màu đỏ cánh sen - Thử nghiệm (-): không xuất vòng đỏ GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 47 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Positive Negative Negative Hình 3.8: Thử nghiệm Indol • Thử nghiệm Voges – Proskauer: - Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth) - Ủ nhiệt độ 370C vòng từ 2-5 ngày - Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% cồn dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 % với tỷ lệ 3:1 - Quan sát phản ứng xảy phút - Thử nghiệm (+):xuất màu đỏ hay hồng sáng mặt môi trường - Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 48 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.9: Thử nghiệm Voges – Proskauer 3.4.5 Nhận định tính sinh hố đặc hiệu: Tính chất sinh hố Dương âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactose 99,2 TSI sucrose 99,5 TSI glucose + 100 TSI glucose sinh + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê 100,0 Lên men mannitol + Phản ứng Indol 98,2 Phản ứng V.P 100,0 Bảng 3.1: Phát hay không phát Salmonella 25g mẫu 3.6 Kết 3.6.1 Kết cảm quan - Về màu sắc, thịt gà có màu đặc trưng, phần thịt hồng, phần mỡ màu vàng tươi da màu vàng trắng - Về mùi, thịt có mùi đặc trưng, khơng có mùi lạ - Về tính chất, bề mặt thịt có nước, có độ đàn hồi tốt - Về cảm quan nhìn chung tốt, thịt nhìn tươi, tính chất, màu sắc, mùi vị khơng có lạ Nhưng đánh giá cảm quan không đủ để xem xét mức độ thịt 3.6.2 Kết đánh giá mức độ nhiễm Salmonella - Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella CFU/25g GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 49 ... chống bệnh vi khuẩn Salmonella, tôi thực nghiên cứu đề tài tìm hiểu vi khuẩn Salmonella để có nhìn tổng quan vi khuẩn Salmonella số chủng vi sinh vật khác 1.2 Mục đích - Tổng quan số loại vi sinh... Liêm Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1 Vi khuẩn Escherichia Coli Hình 2.2 Vi khuẩn Lisria monocytogenes 10 Hình 2.3 Vi khuẩn Salmonella ... nhóm tìm thấy chủ yếu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 14 Khóa luận: Tìm hiểu vi khuẩn Salmonella plasmid vài gen mã hóa ST tìm thấy transposon Sta (hay gọi ST-I) tạo ETEC vài vi khuẩn