Tìm hiểu về vi khuẩn CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Trường Đại học Bách khoa Khoa Công nghệ Hoá học & Dầu khí BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BK TP.HCM BÀI TIỂU LUẬN VI SINH VẬT HỌC ĐỀ TÀI: VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM GVHD : TS Lê Văn Việt Mẫn Nhóm Sinh viên thực hiện: Tống Tiến Hiển Nguyễn Thị Quý Như Nguyễn Hoàng Oanh Nguyễn Ngọc Thuyết Năm: 2003-2004 Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn MỤC LỤC I Hình thái sinh lý 1.1 Phân loại tính chất 1.2 Các loại thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum II Độc tố- Tác động 2.1 Cấu trúc Neurotoxin 2.2 Kiểm soát tạo thành Neurotoxin 2.3 Cơ chế tác ñoäng III Triệu chứng bị ngộ độc thịt 11 IV Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành phát triển phát sinh độc tố 11 4.1 Thế oxi hoá khử 11 4.2 Nhiệt độ 12 4.3 pH 15 4.4 Nồng độ muối- Hoạt độ nước 16 4.5 Nitrite 16 4.6 Các chất khác 17 V Các phương pháp phân lập nhận biết 17 5.1 Khái quát phương pháp gieo cấy để phân lập 17 5.2 Cách phân lập 18 5.3 Phương pháp ELISA 21 5.4 Phương pháp phân tích dựa vào hoạt tính phân huỷ peptide nội bào 21 5.5 Phương pháp PCR 22 5.6 Lựa chọn phương pháp 22 VI Phương pháp phòng ngừa 23 6.1 Bảo quản nhiệt độ cao 23 6.2 Bảo quản nhiệt độ thấp 23 6.3 Bảo quản hoá chất 24 6.4 Bảo quản phương pháp chiếu xạ 25 6.5 Kết hợp phương pháp 25 Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Giới thiệu: Ngộ độc thịt (Botulism) xảy phổ biến không nước phát triển mà nước phát triển Thuật ngữ “Botulism” xuất phát từ tiếng Latin “botulus” có nghóa “xúc xích”, đặt tên cho trường hợp ngộ độc phát Trung Âu năm 1800 thường liên quan đến việc ăn xúc xích Trong ngộ độc thực phẩm ngộ độc thức ăn nghiêm trọng nhất, bệnh gây ăn phải thức ăn chứa độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum Clostridium botulinum van Ermengem phân lập lần vào năm 1897 từ giăm sống, muối phơi khô-tác nhân gây đợt dịch Bỉ, từ lách nạn nhân I HÌNH THÁI SINH LÝ VI SINH VẬT: I.1Phân loại tính chất: a) Phân loại: Trong sinh giới Clostridium botulinum đứng vị trí sau: Siêu giới (Superkingdom) Giới (Kingdom) Ngành (Phylum) Lớp (Class) Bộ (Order) Họ (Family) Bacteria Eubacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium botulinum chia thành nhóm dựa vào tính chất sinh lý mà chúng thể hiện, với chủng sản sinh neurotoxin loài C.butyricum C baratii Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum Loại độc tố Khả phân giải protein Dịch hoá gelatin Khả lên men Glucose Fructose Mannose Maltose Sucrose Trehalose Enzym lipase Enzym Lecithinase Acid trao đổi chất Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu Nhiệt độ sinh trưởng tối thiểu Thời gian chịu nhiệt bào tử (phút) I A, B, F GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Clostridium botulinum II III B, E, F C, D IV G C.butyric um (E) C baratii (F) + - - + - - + + + + - - + +++ + + + + + + + + ++ ++ - + + + + + + - + + + + - - - - - - + A, iB, B iV, PP A, B A, P, B A, iB, B, iV, PA A, B A, B 30-40oC 25-37oC 40oC 37oC 30-37oC 30-45oC 10-12oC 3.0oC 15oC 121oC 0.21 82.2oC 0.4-2.4 104oC 0.1-0.9 ~10oC 104oC 0.8-1.2 Ghi : (+) : tất chủng có phản ứng dương (-) : tất chủng có phản ứng âm (+-) : vài chủng có phản ứng dương , vài chủng có phản ứng âm Acid trao đổi chất: A: acetic; B:butyric; P:propionic; iB:isobutyric; iV: isovaleric; PP: phenylpropionic; PA: phenylacetic Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Những nghiên cứu cho thấy chủng nhóm kiểu hình có liên quan gần, ngoại trừ loại độc tố sản sinh, nhóm kiểu hình lại tương ứng với nhóm họ riêng biệt Những chủng thuộc nhóm I II liên hệ dù chúng sản sinh loại độc tố Sự khác biệt nhóm từ I đến IV đủ lớn để lập thành loài, nên không đòi hỏi giữ tên Clostridium botulinum cho nhóm Để thuận tiện người ta gọi chủng Clostridium botulinum “C botulinum loại A”, v.v tuỳ thuộc vào loại toxin mà chúng sản sinh, xác dùng thuật ngữ “ Clostridium botulinum toxin loại A”, với từ “loại” thể loại kháng nguyên toxin mà chúng sinh tính chất thân sinh vật Vì chủng proteolytic nonproteolytic sinh độc tố loại B F, nên việc xếp chủng loại B hay F cần làm rõ chủng thuộc nhóm I proteolytic hay nhóm II nonproteolytic Clostridium botulinum b) Hình thái sinh lý vi khuẩn Clostridium botulinum: Nhóm Clostridium botulinum vi khuẩn kị khí bắt buộc, di chuyển được, sinh bào tử, hình que, rộng 0.5-2 µm, dài 1.6-20 µm Vì ngộ độc thức ăn chủ yếu sinh vật nhóm I II gây nên phần tập trung vào nhóm Hai nhóm có khác biệt lớn khả chịu nhiệt, pH tối ưu, cách thức tác động Vi khuẩn Clostridium botulinum nhóm I actively proteolytic (nghóa là, chúng phân giải protein tự nhiên nhanh chóng phá vỡ cấu trúc thịt môi trường thịt, phân giải protein lòng trắng trứng casein) Chúng làm biến tính nhanh chóng dẫn xuất protein, gelatin Clostridium botulinum nhóm II không làm biến tính protein tự nhiên, làm chảy lỏng gelatin, dù không hoạt động nhoùm I Nhoùm I sinh acid isobutyric, acid isovaleic, acid phenylpropionic sản phẩm thứ cấp acid amin valine, isoleucine/leucine, phehylalanine nhóm II không sinh acid Nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng vi khuẩn tối quan trọng: nhóm I thích ứng nhiệt độ thấp 10oC, nhóm II phát triển nhiệt độ thấp tới 3-3.3oC Bào tử chủng nhóm I chịu nhiệt tốt bào tử chủng nhóm II Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn c) Tính chất bào tử Clostridium botulinum: Những nghiên cứu sinh lý sinh bào tử cho thấy khác biệt nhóm I nhóm II Bào tử tất nhóm nằm đầu tế bào, có kích thước to so với kích thước tế bào Bào tử nhóm I làm bao bào tử phình to cách rõ ràng bào tử nhóm II III làm căng Cấu trúc bào tử chất giống với bào tử loài khác thuộc giống Clostridium Bacillus Trong nhiều điều kiện nuôi cấy bào tử chủng nhóm I chứa bao bào tử thời kỳ dài Ngược lại, bào tử chủng nhóm II chín giải phóng khỏi bao bào tử Bào tử vài chủng loại E, nhóm II chứa túi bào tử, túi có màng mỏng, dày dạng hình lục giác Thông thường, chức túi bào tử Bào tử vài chủng loại E mang lượng lớn phần phụ trợ có đường kính xấp xỉ 20nm dài tới 350nm Những phần phụ trợ không xuất với khả di chuyển, chúng gắn liền có vai trò nảy mầm bào tử chưa biết chức Bào tử chủng 78A nhóm I có ngoại bào tử nhiều lớp thường bao bào tử, bào tử chủng 17B nhóm II bao ống hở giống ngoại bào tử thường tồn bào tử tự 1.2 Các loại thực phẩm nhiễm Clostridium Botulinum : Một số dấu hiệu nẩy sinh Clostridium botulinum thực phẩm nhận biết loại thực phẩm có liên quan đến bùng phát Clostridium botulinum thịt, cá, rau quả, mật ong, phomat, đậu phôïng, oliu đen Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn a) Trong cá: Một vài nghiên cứu Clostridium botulinum thịt cá cho thấy số vùng, tỉ lệ nhiễm Clostridium botulinum thấp số vùng khác tỉ lệ nhiễm lại cao.Ví dụ cá chép biển có xuất xứ từ Caspian Sea người ta tìm thấy Clostridium botulinum loại E khoảng 63% mẫu MPN chứa 490kg-1 bào tử Cá nuôi nhiễm nhiều Clostridium botulinum, đặc biệt cá nuôi ao hồ có đáy ao tiếp xúc trực tiếp với đất ao hồ có đáy betong lượng Clostridium botulinum nhiễm cá giảm hẳn Các loại cá qua chế biến lượng Clostridium botulinum giảm hẳn, nhiên có trường hợp ngoại lệ b) Trong thịt: Nhìn chung thịt bị nhiễm Clostridium botulinum cá Trong hai nghiên cứu Anh, Clostridium botulinum không tìm thấy 280 mẫu thịt sống ba nghiên cứu Clostridium botulinum tìm thấy từ 2% đến 14% mẫu với bào tử/kg Người ta thường thấy có Clostridium botulinum loại C thịt Trong mẫu thịt đóng gói chân không người ta thấy có Clostridium botulinum loại A B 4-5% tổng số mẫu kiểm tra c) Trong rau quả-trái cây: Trong vài nghiên cứu Clostridium botulinum không tìm thấy rau trái số điều tra tỷ lệ mẫu nhiễm Clostridium botulinum lại cao Phần lớn nghiên cứu Clostridium botulinum loại I mặt hàng rau thường trữ lạnh nên nguy nhiễm Clostridium botulinum loại II cao Tỷ lệ bùng phát cao Clostridium botulinum kết hợp với tiêu thụ rau thực phẩm số quốc gia làm tăng khả có mặt vi sinh vật nhóm sản phẩm d) Trong sữa: Có nghiên cứu Clostridium botulinum sữa Từ 1912 đến 1989, có 12 vụ ngộ độc Clostridium botulinum xác định sản phẩm từ sữa Vào 1996 1997 có thêm hai vụ ngộ độc liên quan đến Clostridium botulinum sữa Phần lớn sản phẩm từ sữa nhiễm Clostridium botulinum phomai Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn e) Trong mật ong: Mật ong chứa nhiều bào tử Clostridium botulinum Một số mẫu kiểm tra cho thấy có đến 104 bào tử Clostridium botulinum kg mật ong Nguyên nhân mật ong chứa nhiều Clostridium botulinum cho xác ong chết, phân huỷ tạo điều kiện kỵ khí thích hợp cho phát triển Clostridium botulinum II ĐỘC TỐ-TÁC ĐỘNG: 2.1 Cấu trúc Neurotoxin: Độc tố Clostridium botulinum ngoại độc tố, có độc tính mạnh chất độc biết, độc gấp lần so với độc tố vi khuẩn uốn ván, với lượng 0.035mg gây chết người Clostridium botulinum sinh loại độc tố A, B, C, D, E, F, G (hiếm gặp) Trong đó, loại thường gây ngộ độc A, B, E, độc loại A Độc tố Clostridium botulinum (BoNTs) loại độc tố tác động lên hệ thần kinh (neurotoxin) trừ C2 độc tố thuộc loại cytotoxic BoNTs tạo thành từ đơn vị chuỗi polypetid đơn có phân tử lượng khoảng 150kDa, tương ứng với khoảng 1251- 1297 acid amin độc tính tương đối thấp, giải phóng trình tự phân tế bào Loại chuỗi đơn (protoxin) biến đổi thành chuỗi đôi (một trình gọi phân cắt) enzim protease ngoại bào vi khuẩn protease thêm vào trypsin để tạo thành phân tử chứa chuỗi nhỏ (L chain – 50kDa) chuỗi lớn (H chain – 100kDa) liên kết với cầu disulfide Protease vi khuẩn trypsin công liên kết giống liên kết tương tự Sự phân cắt thường kèm với hoạt hoá độc tố, làm tăng độc tính lên 500 lần Sự phân cắt xuất cần thiết không đủ để hoạt hoá hoàn toàn độc tố có chứng cớ cho thấy biến đổi cấu trúc bao hàm hoạt hoá Trong nuôi cấy thực phẩm, BoNT tồn dạng chuỗi đơn (không phân cắt), hay dạng chuỗi đôi hay hai dạng trên, tuỳ vào điều kiện sinh lý sinh vật, thời gian ủ bệnh điều kiện nuôi cấy hay thực phẩm Cầu disulphide bị cắt điều trị dithiothreitol, tạo thành chất thành phần không độc Sự phát triển chủng nhóm I, proteolytic Clostridium botulinum thường kèm với sản sinh protease, có khả hoạt hoá độc tố thành độc tố hoạt động mạnh, trường hợp sinh vật nhóm II, nonproteolytic độc tố tạo nên chủ yếu từ chuỗi đơn, hoạt động kiểm tra torng phòng thí nghiệm trypsin phải thêm vào để hoạt hoá cho thể độc tính Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Những độc tố loại chủng Clostridium botulinum khác sinh không thiết giống Điều thể việc phản ứng chúng với chất kháng độc đơn khác số lượng Những nghiên cứu chuỗi nucleotide chủng tiêu biểu cho loại loại độc tố cho thấy khác biệt gen tạo độc tố từ chủng sản sinh độc tố thuộc loại antigenic, khác biệt chuỗi acid amin độc tố loại chủng khác sinh BoNTs tồn cỡ phân tử phức, cỡ, độc tố kèm với protein độc tính Bảng tóm tắt độc dạng độc tố: Dạng S “derivative toxin” M “progenitor toxin” L “progenitor toxin” LL Khối lượng 150kDa(7S) 300kDa(12S) 450-500kDa (16S) 900kDa(19S) Thành phần Chuỗi H (100kDa) liên kết với chuỗi L (50kDal) S + nontoxic nonhemaggiutinin (NTNH) Loại độc tố A, B, C, D, E, F M + hemaggiutinin (HA) A, B, C, D, G Probably a dimer of L A Loaïi M L xem độc tố nguyên thuỷ, loại thường có thực phẩm Nói chung, độc tố nguyên thuỷ ổn định nhiệt độ cao pH thấp độc tố chuyển hoá thích ứng tốt chúng chống hạn chế phá huỷ độc tố dày ARN kết hợp với vài toxin phức tạp chưa biết vai trò việc kết hợp hoạt động hay tính ổn định Tính chất thực phẩm hay môi trường nuôi cấy mà vi khuẩn phát triển diện ion kim loại ảnh hưởng đến kích cỡ loại độc tố phức tạp sản sinh ảnh hưởng đến tính ổn định độc tố Ví dụ: Suốt trình ủ thực phẩm 30oC ngày, chủng 62A loại A Sinh toxin 16S (L) ổn định cao 19S (LL) đậu hà lan 16S comolex nấm, chủ yếu 12S (M) toxin sinh cá ngừ Độc tố phức (toxin complex) bền vững pH< 6.5, pH tăng lên cao 7.5 phức bị phân ly, giải phóng neurotoxin tự Hiện tượng ứng dụng để làm BoNTs Phức phân ly tự động kết hợp lại pH giảm Neurotoxin chia thành thành phần độc tính phương pháp sắc kí trao đổi ion Trong môi trường acid dày, độc tố không bị phân huỷ tác dụng enzym tiêu hoá tripsin pepsin Độc tố bị Trang Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn hoạt tính nhiệt độ cao môi trường kiềm, 50oC độc tố bị phá huỷ sau 30 phút Những nghiên cứu neurotoxin genes chuỗi amino acid toxin chủng tiêu biểu cho loại độc tố cho thấy chuỗi L tạo thành từ khoảng 450 amino acid có vị trí liên kết với Zn, chủng tiêu biểu loại A, B F có chứng cho thấy nguyên tử Zn kết hợp với chuỗi L 2.2 Kiểm soát tạo thành Neurotoxin: Có vài điều chưa chắn vị trí gen điều khiển tạo thành BoNTs Clostridium botulinum nhóm I II Người ta cho gen tổng hợp BoNTs nằm nhiễm sắc thể Khoảng 50% chủng loại A sinh BoNT/A chứa gen ẩn-gen định sản sinh BoNT/B Gen tổng hợp BoNT C1 D tồn pseudolysogenic phage gen tổng hợp toxin C2 lại nằm NST Không phân biệt nontoxigenic chủng loại C D, nontoxigenic hai chủng với nontoxigenic C.novyi chủng loại A, chủng Clostridium botulinum nontoxigenic loại C biến đổi thành Clostridium botulinum toxigenic loại C loại D nhiễm thể thực khuẩn mang gen tạo toxin thích hợp Gen tổng hợp BoNT/G báo cáo nằm plasmid 81-MDa Vị trí gen tổng hợp toxin gen tổng hợp toxin C.butyricum C.baratii chưa trình bày rõ ràng Trong trình nuôi cấy lại phòng thí nghiệm vài chủng Clostridium botulinum có xu hướng giảm khả tổng hợp tập trung toxin Việc tổng hợp độc tố mạnh việc hình thành bào tử bị hạn chế 2.3 Cơ chế tác động Neurotoxin: BoNTs tác động trước hết vào peripheral cholinergic synape hạn chế giải phóng chất truyền xung thần kinh acetylcholine, adrenergic systems bị ảnh hưởng, liều lượng cần thiết dể ức chế giải phóng noradrenaline cao nhiều so với lượng cần để ức chế giải phóng acetyl choline Bốn bước hoạt động BoNTs sau: Sự kết hợp H chain toxin với chất tiếp nhận đặc biệt bề mặt màng presynaptic máy thần kinh Endocytosis tiếp nhận phức toxin- chất tiếp nhận kết tạo thành endocytic vesicles Sự axit hoá lumen endocytic vesicle enzim ATPase protonpumping dẫn đến biến đổi cấu trúc toxin, mà sau chen vào màng lipid kép màng vesicle, L chain sau đổi vị trí qua màng endocytic vesicle Trang 10 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Khả chịu nhiệt bào tử Clostridium botulinum nonproteolytic loại E: Nhiệt độ D-Value Chủng Môi trường (oC) (oF) (phút) 73.89 165 12.97 Beluga Thòt cua 73.89 165 10.39 Alaska Thòt cua 73.89 165 6.80 G21-5 Thòt cua 73.9 165 8.66 Mixed Surimi 76.67 170 4.07 Beluga Thòt cua 76.67 170 3.04 Alaska Thòt cua 76.67 170 2.38 G21-5 Thòt cua 76.7 170 3.49 Mixed Surimi 79.4 175 2.15 Mixed Surimi 79.44 175 1.65 Beluga Thòt cua 79.44 175 1.35 Alaska Thòt cua 79.44 175 1.10 G21-5 Thòt cua 82.2 180 1.22 Mixed Surimi 82.22 180 0.74 Beluga Thòt cua 82.22 180 0.51 Alaska Thòt cua 82.22 180 0.63 G21-5 Thòt cua 82.22 180 0.62 25V-1 Thòt cua 82.22 180 0.49 25V-2 Thòt cua 85.00 185 0.29 Beluga Thịt cua Trang 15 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Khả chịu nhiệt bào tử Clostridium botulinum loại B: Nhiệt độ Hệ số D Môi trường (oC) (oF) (phút) 88.9 192 12.9 Thịt cua 89.5 193 11.1 Thịt cua 90.0 194 9.5 Thòt cua 90.6 195 8.2 Thòt cua 91.1 196 7.1 Thòt cua 91.7 197 6.1 Thòt cua 92.2 198 5.3 Thòt cua 92.8 199 4.5 Thòt cua 93.4 200 3.9 Thòt cua 93.9 201 3.4 Thòt cua 94.5 202 2.9 Thịt cua b) Khả chịu nhiệt Clostridium botulinum: Bào tử Clostridium botulinum nhóm II (không có khả phân giải protein) chịu nhiệt bào tử Clostridium botulinum nhóm I (có khả phân giải protein) Mặc dù bào tử Clostridium botulinum bền nhiệt độc tố chúng lại chịu nhiệt Độc tố chúng bị vô hoạt sau xử lý nhiệt 80oC Theo tính toán Townsend, Esty Basalt dựa liệu Esty Mever cho thấy khả chịu nhiệt cao Clostridium botulinum dung dịch đệm photphat pH=7 thể giá trị Fo = 2.45 phút giá trị z= 17.6oF Nhiệt độ tối ưu cho phát triển hình thành độc tố Clostridium botulinum nhóm I xấp xỉ 35oC; Clostridium botulinum nhóm II vào khoảng 2628oC Clostridium botulinum nhóm II loại B, E, F có khả sinh độc tố nhiệt độ vào khoảng 3-4 oC Khả chịu nhiệt Clostridium botulinum tăng pH tăng nồng độ muối giảm Trang 16 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum C botulinum nhoùm I C botulinum nhoùm II GVHD: Lê Văn Việt Mẫn tmin (oC) 10 topt (oC) 35-40 26-28 tmax(oC) 45-50 40 Các thí nghiệm bào tử bền nhiệt cho thấy pH=7, để tiêu diệt bào tử Clostridium botulinum cần có chế độ xử lý nhiệt: 100oC 330 phuùt 105 oC 100 phuùt 110 oC 33 phuùt 115 oC 10 phuùt 120 oC phút Mặc dù bào tử Clostridium botulinum qua xử lý nhiệt, nhiên chúng có khả sống sót phát triển có mặt thành phần khác môi trường, đặc biệt lysozyme lòng trắng trứng Số bào tử Clostridium botulinum loại I sống sót có mặt lysozyme không đáng kể so với bào tử Clostridium botulinum loại II Lysozyme hoạt hóa hệ thống nảy mầm bị nhiệt độ làm tổn hại bào tử, làm tăng khả sống sót bào tử Để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Clostridium botulinum, ta cần xử lýnhiệt o 80-90 C khoảng 10 phút Trong thực tế cần xử lý nhiệt điều kiện nhiệt độ cao thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật khác có khả chịu nhiệt cao Clostridium botulinum 4.3 nh hưởng pH: pH tối thiểu cần thiết Clostridium botulinum nhóm II (Nonproteolytic) phát triển 4.6-4.8, giảm xuống đến pH= 4.1 môi trường giàu protein Còn Clostridium botulinum nhóm I (Proteolytic) pH tối thiểu cần pH=5 pH có ảnh hưởng lớn đến phát triển Clostridium botulinum Người ta làm thí nghiệm thấy 30oC, pH=4.6, khả phát triển Clostridium botulinum loại A giảm 105.6 lần so với pH=8.6 Mặt khác, người ta thấy Clostridium botulinum không phát triển bị ức chế khoảng pH= 4.5-5.0 bào tử chúng sống sót vòng 56 ngày mà suy giảm số lượng Như vậy, để kìm hãm phát triển Clostridium botulinum, người ta cần tạo môi trường có tính acid cho thực phẩm Trang 17 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 4.4 Nồng độ muối-Hoạt độ nước: Muối có khả ức chế phát triển phần lớn vi sinh vật Khả liên quan đến khả làm giảm hoạt độ nước Khi nồng độ muối cao gây tượng shock nhiệt thẩm thấu Khi nước từ tế bào cuối làm chết sinh vật Clostridium botulinum thuộc nhóm I (Proteolytic) bị ức chế với nồng độ muối khoảng 10%, ứng với hoạt độ nước (aw) khoảng 0.93 Clostridium botulinum nhóm II (Nonproteolytic) bị ức chế nồng độ muối 5% Cả hai nhóm phát triển tốt hoạt độ nước đạt 0.96 Tuy nhiên phát triển chúng phụ thuộc vào chất tạo ẩm, thông thường NaCl glycerol Clostridium botulinum nhóm I phát triển aw=0.96 không phát triển aw=0.95 với chất tạo ẩm NaCl; chúng phát triển aw=0.93 không phát triển aw= 0.92 với chất tạo ẩm glycerol 4.5 nh hưởng Nitrite: Từ lâu, nitrite sử dụng sản phẩm thịt cá để khống chế phát triển Clostridium botulinum Tác động nitrite lên Clostridium botulinum chịu chi phối yếu tố khác pH, thành phần môi trường,… Nồng độ nitrite giảm trình xử lý nhiệt lưu trữ Do đó, nồng độ nitrite ban đầu phải đủ lớn để có tác dụng ức chế Clostridium botulinum Khả ức chế Clostridium botulinum nitrite cho tác dụng oxit nitrite làm vô hoạt protein chứa sắt, lưu huỳnh ferredoxin, pyruvateoxidoreductase Tuy nhiên, ảnh hưởng không tốt lên sức khỏe người nên ngày người ta sử dụng nitrite để bảo quản thực phẩm nói chung ức chế Clostridium botulinum thực phẩm nói riêng Acid Sorbic: Clostridium botulinum thuộc nhóm I khả sử dụng acid sorbic nguồn cacbon cho chúng Khả Clostridium botulinum nhóm II Nồng độ acid sorbic khoảng 2600 mgkg-1 có tác dụng ức chế phát triển sinh độc tố Clostridium botulinum nitrite Thế nồng độ cho phép acid sorbic hầu hết sản phẩm thực phẩm vào khoảng 1000 mg.kg-1 mg.l-1, lên đến 2000-3000 mg.kg-1 cho sản phẩm phomai Các nghiên cứu cho thấy 30oC, pH=6-7, nồng độ acid sorbic khoảng 2000mg.l-1 tác dụng ức chế phát triển tế bào sinh dưỡng Clostridium botulinum Tuy nhiên, môi trường acid acid sorbic có khả ức chế nảy mầm ức chế phát triển Clostridium botulinum Ví dụ, người ta theo dõi 14 ngày pH=5.5 acid sorbic với nồng độ Trang 18 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 1828 mg.l-1 có tác dụng ức chế phát triển Clostridium botulinum 105 lần so với acid sorbic Người ta thấy ảnh hưởng acid sorbic lên Clostridium botulinum nhóm I mạnh ảnh hưởng nhóm II 4.6 nh hưởng chất khác: Các chất nisin, este acid parahydroxybenzoic, polyphotphat, hợp chất chelat, CO2, … có tác dụng ức chế Clostridium botulinum Như vậy, để bảo quản thực phẩm khỏi Clostridium botulinum, ta cần phối hợp nhiều yếu tố với nhằm đạt kết tốt V CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CLOSTRIDIUM BOTULINUM VÀ NHẬN BIẾT ĐỘC TỐ: 5.1 Khái quát phương pháp gieo cấy để phân lập: Mục đích phân lập: ¾ Nghiên cứu tác động Clostridium botulium môi trường thức ăn, tìm kiếm vi sinh vật nghi ngờ thức ăn có liên quan đến bùng nổ vụ ngộ độc thịt ¾ Nguyên cứu tính chất mẫu phân lập Giữa Clostridium botulium phân giải protein Clostridium botulium không phân giải protein có điểm khác sinh lý nên ta phải có điều kiện phân lập khác Xử lý nhiệt mẫu cách làm thường xuyên sử dụng để loại trừ cạnh tranh vi khuẩn sinh dưỡng Đốt nóng 75-80 oC từ 10-15 phút có lợi cho việc nuôi cấy bào tử Clostridium botulinum phân giải protein Nhiệt độ thấp chút, khoảng 60 oC dùng cho trình phân lập nhóm không phân giải protein Việc thêm lysozyme vào môi trường gia tăng phục hồi bào tử qua xử lý nhiệt Các mẫu không qua xử lý nhiệt dùng để nuôi cấy, phân lập tế bào hay bào tử mà khả chịu nhiệt Xử lý mẫu với Ethanol phương pháp sử dụng thay cho xử lý nhiệt trình phân lập bào tử Clostridium botulinum không phân giải protein Môi trường phân lập phải kỵ khí Trong môi trường có màu nhạt Resorufin dùng chất thị tính khử môi trường Để làm giàu cho Clostridium botulinum phân giải protein, mẫu phải nhân giống cách cấy CMM ủ 35oC Môi trường cho Clostridium botulinum không phân giải protein CMM – Glucoze Đó môi trường tinh bột- glucoze- thịt Trypticase-Pepton- Glucoze-Dịch chiết nấm Trang 19 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn men từ nước thịt luộc chứa Trypsin[TPGYT], ủ 26o C Trypsin thêm vào để để vô hoạt vi khuẩn họ hàng với loài Clotridium Khi gieo cấy cần phải ủ ngày lâu cần thiết để Clostridium botulinum tăng trưởng, hình thành bào tử tạo thành độc tố Sau làm giàu, phần mẻ cấy sử dụng để kiểm tra độc tố phần lại cố định môi trường đặc Trước cố định môi trường đặc, mẫu nuôi cấy phải xử lý nhiệt (trong cô lập nhóm I) xử lý với ethanol (trong cô lập nhóm II) để loại bỏ cạnh tranh tế bào sinh dưỡng Môi trường thạch lòng đỏ trứng môi trường Clostridium botulinum nhóm I, II có hình dạng khuẩn lạc điển hình, nên thường dùng Một số môi trường chọn lọc khác sử dụng như: thạch CBI, BSM Những môi trường dùng để nghiên cứu nhóm I, trimethoprin có môi trường ức chế phát triển nhóm II 5.2 Cách phân lập: a) Các môi trường thường sử dụng để phân lập: - Môi trường dịch thể gan bầm (M133) Gan bò tươi 50g 1g K2HPO4 Nước cất 1lít Pepton 10g Tinh bột tan 1g pH môi trường: - Môi trường thịt chín (M134) Tim bò 454g Dextrose 2g Nước cất lít Proteose pepton 20g NaCl 5g - Môi trường dịch thể TPGY (M135) hay với tripsin (TPGYT) Môi trường Trypticase 50g Cao naám men 20g Natri thioglucollate 1g Pepton 5g Dextrose 4g Nước cất 1lít - Môi trường thạch-lòng đỏ trứng-gan-thịt bê (M136): Trang 20 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Chất chiết gan bê 50g Proteose pepton 20g Trypton 1.3g Tinh boät tan 10g NaCl 5g Gelatin 20g Nước cất 1lít Chất chiết thịt bê 500g Neopepton 1.3g Dextrose 5g Gasein đẳng điện 2g 2g NaNO3 Thạch 15g Huyền phù lòng đỏ trứng nước muối sinh lý: 40ml - Thạch-lòng đỏ trứng yếm khí (M101): Thạch Trứng tươi sống Trypton 5g NaCl 5g Nước cất 1lít Cao nấm men 5g Proteose pepton 20g Thạch 20g b) Phân lập giống khiết: Có thể phân lập nhanh vi khuẩn Clostridium botulinum từ hệ vi sinh vật hỗn hợp môi trường tăng trưởng hay từ mẫu thực phẩm ban đầu trình tạo bào tử tốt - Tiền xử lý mẫu: đun môi trường tăng trưởng có chứa vi khuẩn 80oC 1015 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Lưu ý không xử lý nhiệt Clostridium botulinum không phân huỷ protein - Cấy mẫu xử lý: cấy mẫu lên môi trường thạch-lòng đỏ trứng-gan-thịt bê hay lên môi trường thạch- lòng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn lạc phát triển riêng rẻ Nếu cần thiết pha loãng mẩu đến mức cần thiết khuẩn lạc phát triển riêng biệt Ủ 35oC điều kiện yếm khí 48 c) Chọn khuẩn lạc điển hình: - Chọn khuẩn lạc có đặc điểm gồ cao hay dẹt, nhẵn hay xù xì Chúng thường phát triển, phân bố dàn trải có mép không Trên môi trường lòng Trang 21 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh kiểm tra ánh sáng chiếu lệch góc, vùng óng ánh trông giống ngọc trai - Cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường dịch thể: Cấy khuẩn lạc Clostridium botulinum loại E vào môi trường TPGY, khuẩn lạc sinh loại độc tố khác vào môi trường gan bầm hay môi trường thịt Ủ ngày kiểm tra tạo thành độc tố - Phân lập giống thuần, cấy lại chuẩn tạo độc tố môi trường thạch lòng đỏ trứng Ủ hai mẫu 35oC điều kiện kị khí hiếu khí Nếu khuẩn lạc điển hình phát triển điều kiện kị khí không phát triển điều kiện hiếu khí giống khiết 5.2 Cách phát độc tố Botulinum: -Cách tiêm độc tố vào vùng bụng chuột phương pháp chuẩn cho dò tìm nhận BoNT với điều kiện cần thiết giải thích mô tả Solomon -Để phát độc tố hình thành nhóm II (Clostridium botulinum không phân giải protein) từ mẫu vi sinh vật ta cần phải xử lý mẫu với trypsin để chuyển hoá độc tố từ dạng đơn sang dạng đôi Một số nghiên cứu cho phương pháp dò tìm độc tố sinh Clostridium botulinum proteolytic nonproteolytic thức ăn -Điểm đặc biệt cách kiểm tra thực cách sử dụng loại antisera đặc biệt quan sát triệu chứng đặc trưng ngộ độc thịt chuột trước chết -Những phân tích định lượng để xác định độc tố BoNTs không ngừng phát triển tiêu chuẩn tham khảo xác định chuẩn bị hình thành Clostridium Botulium.Thành phần độc tố mẫu biểu thị giới hạn cân BoNT/A g-1 ml-1 -Phương pháp tiêm vào vùng bụng chuột phát lượng nhỏ chất độc loại A đến 5-10pg cung cấp thước đo cho hoạt động sinh học độc tố nh hưởng độc tố tiêm vào chuột: gây chứng liệt mềm bắp thịt tử vong -Thuận lợi phép kiểm tra độ nhạy cao có khả nhật biết trước điểm chưa miêu tả BoNTs, độc tố không điển hình -Không thuận lợi phải sử dụng động vật để thí nghiệm phải chờ đợi vài ngày mẫu có kết Trang 22 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 5.3 Phương pháp ELISA( thí nghiệm chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym) Phương pháp miễn dịch để nhận ảnh hưởng BoNTs liên kết với enzyme immunosorbent gọi ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp dựa kỹ thuật phát quang kháng thể từ tìm kháng nguyên độc tố Một enzym đặc biệt gắn lên kháng thể cho phép nhận biết BoNTs có hai enzym thường dùng là: horseradish peroxidase (cho phương pháp so màu) β- galactosidase ( cho phương pháp phát quang) Phương pháp ELISA có độ nhạy thí nghiệm với chuột, rẻ tiền dễõ sử dụng Nhưng kiểm nghiệm ELISA có số giới hạn: ¾ Có số phản ứng phụ với độc tố sinh học bị vô hoạt ¾ Cho kết sai khác loại độc tố chủng Clostridium botulinum khác tạo thành ¾ Một số thử nghiệm dùng kháng thể làm tăng kháng nguyên nên kết không đặc trưng cho BoNTs ¾ ELISA cần hệ thống thiết bị phức tạp đắc tiền thực độ nhạy việc làm thí nghiệm chuột Mặc dù có giới hạn ELISA sử dụng rộng rãi Kỹ thuật miễn dịch sử dụng để nhận nhóm Clostridium botulinum phân giải protein loại A , loại B nhóm Clostridium botulinum không phân giải protein loại E 5.4 Phương pháp phân tích dựa vào hoạt tính phân huỷ peptide nội bào: Hai dạng phân tích in vitro để phân tích BoNTs nghiên cứu Cơ sở việc phân tích dựa hoạt tính phân huỷ peptide nội bào (endodeptidase) BoNTs Cơ sở phương pháp HPLC sau ủ BoNTs với chất chất sản phẩm phát sinh tách riêng HPLC phân tích hấp phụ chúng Phương pháp HPLC có độ nhạy phương pháp thí nghiệm với chuột không phùø hợp cho việc xác định nhanh số lượng lớn độc tố mẫu Các phương pháp kết hợp hoạt tính phân huỷ peptid nội bào phản ứng miễn dịch nghiên cứu để phát định lượng BoNT loại A, B Đặc điểm phương pháp: ¾ Chỉ đo lường hoạt tính sinh học độc tố loại L ¾ Sự khác kháng nguyên độc tố loại không ảnh hưởng đến độ đáp ứng phương pháp ¾ Các vấn đề phát sinh từ việc dùng kháng nguyên bị loại trừ Trang 23 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Trong phương pháp này, mẫu prôtein chọn lọc (target protein)SNAP-25 cho độc tố loại A VAMP cho độc tố loại B- gắn lên microtiter plate làm nhiệm vụ chất Sau giai đoạn ủ, mẫu chứa neurotoxin thêm vào với kháng thể đặc trưng Các kháng thể kết hợp với đoạn protein chọn lọc trước (target protein) Endopeptidase giúp nhận biết phát triển BoNT/A BoNT/B chúng không phản ứng với BoNTs khác Giới hạn để phát 260 MLD ml-1 với BoNT/A 380 MLD ml-1 với BoNT/B Việc kết hợp phương pháp với phương pháp ELISA có nhiều ưu điểm nhiên cần có thêm nhiều nghiên cứu trước chúng thay phương pháp thử nghiệm chuột có mặt proteases khác số độc tố bị vô hoạt nuôi cấy in vitro làm ảnh hưởng đến kết phân tích 5.5 Sử dụng PCR cách dò Gen để nhận biết Neurotoxin: Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) dò tìm gen tất loại độc tố BoNTs cho loại riêng lẻ Đây phương pháp nuôi cấy in vitro để chép đoạn ADN xác định nhằm làm tăng số lượng đoạn gen lên PCR chuỗi phản ứng làm biến đổi ADN, sau chu kì biến đổi lượng ADN tăng gấp đôi Phương pháp có tương quan với phương pháp thử nghiệm chuột đểå phát độc tố… 5.6 Lựa chọn phương pháp nhận biết phân lập: Làm giàu môi trường nuôi cấy cần thiết cho phân lập nhằm tạo chủng sinh vật khiết để nghiên cứu thuộc tính sinh học chúng Trường hợp môi trường thực phẩm có chứa độc tố nhiễm khuẩn trước tiên phải kiểm tra độc tố Phương pháp thí nghiệm chuột để phát độc tố công cụ quan trọng, cần thiết nhằm gia tăng hiểu biết Clostridium Botulium Từ biết phương thức ngăn chặn ngộ độc thực phẩm Phương thức thí nghiệm chuột có vai trò quan trọng việc nghiên cứu đặc tính loại độc tố Sự phát triển phương thức khác làm cho phương pháp thí nghiệm chuột hạn chế sử dụng Khi nghiên cứu chủng Clostridium botulinum biết, người ta thường dùng phương pháp phân huỷ peptid nội bào, nghiên cứu gen hay phương pháp miễn dịch phối hợp phương pháp Ngoài phương pháp in vitro dùng rộng rãi để kiểm tra lượng lớn mẫu nghiên cứu BoNTs Đây phương pháp hữu ích mà không cần thiết phải sử dụng động vật để thử nghiệm Trang 24 Tiểu luận vi khuẩn Clostridium botulinum GVHD: Lê Văn Việt Mẫn VI PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA: Những kỷ trở lại đây, bảo quản thực phẩm vẩn tiến triển theo phương pháp mò mẫn Mãi đến kỷ 20, điều đánh giá cách định lượng dựa vào yếu tố tham gia bảo quản thực phẩm, điều khiển yếu tố để tạo an toàn thực phẩm Những thực phẩm khả nguy hiểm bị nhiễm khuẩn với mức độ cao thịt, cá từ nhiều nguồn, tập trung chủ yếu ruột cá Sau số biện pháp phòng ngừa bảo quản thực phẩm: 6.1 Xử lý nhiệt độ cao: Xử lý thực phẩm nhiệt độ cao dựa tác động tiêu diệt nhiệt độ cao phần lớn vi sinh vật, biện pháp trùng, tiệt trùng Ví dụ 121oC nhiệt nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật bào tử chúng vòng 15-20 phút, 116oC thời gian tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật bào tử chúng 30-40 phút… Đối với loài Clostridium botulinum loại E: 80oC thời gian tiêu diệt diệt 0.1 -3 phút D80 0.1-3, 110oC thời gian cần thiết nhỏ 1giây D110 Fo3 Sản phẩm chua, thức ăn đóng hộp Thịt xử lý (ướp muối, xông khói, phơi khô) đóng hộp Sản phẩm chua đóng hộp nhiều loại trái cây, rau Thịt tươi xử lý Ví dụ: thịt heo ướp muối, thịt lưng lợn muối xông khói, đùi lợn muối… Xúc xích (lạp xưởng) Thịt, cá tươi, rau sống Xử lý nhiệt < Fo3, NaCl, nitrite Xử lý nhiệt < Fo3, pH NaCl nguyên chất, nitrite làm lạnh 5oC suốt trình ướp muối NaCl nguyên chất, nitrite, pH Bảo quản lạnh riêng Ướp lạnh với hỗn hợp muối ăn, nitrate, muối acid sorbic {CH3(CH=CH)2COOH}, benzonat khói Bảo quản lạnh: muối ăn phụ chất khác, pH Trang Cá sống ướp muối, thịt xử lý, cá hấp,… Phô mai, phô mai bơ 29 ... tên Clostridium botulinum cho nhóm Để thuận tiện người ta gọi chủng Clostridium botulinum “C botulinum loại A”, v.v tuỳ thuộc vào loại toxin mà chúng sản sinh, xác dùng thuật ngữ “ Clostridium botulinum. .. Clostridium botulinum lại cao Phần lớn nghiên cứu Clostridium botulinum loại I mặt hàng rau thường trữ lạnh nên nguy nhiễm Clostridium botulinum loại II cao Tỷ lệ bùng phát cao Clostridium botulinum. .. nhiệt Clostridium botulinum: Bào tử Clostridium botulinum nhóm II (không có khả phân giải protein) chịu nhiệt bào tử Clostridium botulinum nhóm I (có khả phân giải protein) Mặc dù bào tử Clostridium