Trichoderma reesei- tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

Trichoderma reesei- tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose

ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNGLỜI CẢM ƠNTrong quá trình thực hiện đồ án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề liên quan và cung cấp một số tài liệu có ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án.Tất cả các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đồ án.Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc.Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành!Mục LụcSVTH: Nguyễn Thị Hương i ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNGMục Lục i Danh Mục Hình . iii . iii Lời Mở Đầu iv I.Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei 1 1.Lịch sử phát hiện . 1 2.Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei . 2 2.1.Vị trí phân loại . 2 2.2.Đặc điểm hình thái . 3 3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa . 5 3.1.Đặc điểm sinh thái 5 3.2.Môi trường sống . 5 3.3.Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh . 6 3.4.Môi trường nhân sinh khối . 6 4.Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma . 6 5.Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma . 7 5.1.Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng . 7 5.2.Trong lĩnh vực xử lý môi trường . 8 5.3.Trong lĩnh vực khác . 9 II.Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: . 11 1.Cellulose: 11 1.1.Cấu trúc: 11 1.2.Nguồn gốc: 12 2.Cellulase: 15 II.1.Cấu trúc: 15 II.2.Phân loại: . 18 II.3.Cơ chế hoạt động: . 19 II.4.Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei : . 21 Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao 27 I.Phương pháp hiện đại: 27 SVTH: Nguyễn Thị Hương ii ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNGI.1. Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei 27 I.2. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter mạnh : . 33 I.3. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài : 37 I.3.1.Plasmids . 38 I.3.2.Kết quả . 39 II.Phương pháp cổ điển: 41 II.1.Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase. 41 II.2.Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase. 46 II.3.Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase . 47 II.4.Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30. 49 PHẦN 3: KIẾN NGHỊ . 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO: . 50 Danh Mục BảngDanh Mục Hình SVTH: Nguyễn Thị Hương iii ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG Lời Mở ĐầuCellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải, ). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Những năm gần đây, nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Dưới áp lực trên, nguồn năng lượng tái tạo đang được các quốc gia quan tâm Việc sử dụng cellulase của Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Việt Nam có nguồn sinh khối tự nhiên dồi dào. Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú và đa dạng. Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao.Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết được những vấn đề “nóng” ở Việt Nam và trên thế giớiSVTH: Nguyễn Thị Hương iv ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNG PHẦN 1: TỔNG QUANI. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei1. Lịch sử phát hiện Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay lồi đó được biết là Trichoderma viride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng khơng hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong Thế Chiến lần thứ II, khi qn đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị qn sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của qn đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma "viride" mã số QM 6a là lồi nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tơn kính người đã khám phá ra lồi này là Elwyn T. Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những cơng trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mơ tả được 9 lồi Trichoderma. Việc ni cấy dễ dàng và khơng tốn kém, các chủng Trichoderma đã lơi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản về Trichoderma hơn là ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các lồi nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm sốt sinh học trong nơng nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới [Theo Christian P. Kubicek và Gary E. Harman].SVTH: Nguyễn Thị Hương 1 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG2. Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei2.1. Vị trí phân loạiBan đầu, hệ thống phân loại nấm chia thành 4 ngành (Division, Phylum): Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota .Tiến bộ của Sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Nấm được chia thành 10 dưới ngành (subphylum) trong đó Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào dưới ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại .Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấmTheo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau:SVTH: Nguyễn Thị Hương 2 N MễN HC GVHD: ThS.HONG M DUNGGii: FungiNgnh: AscomycotaLp: AscomycetesB: HypocrealesH: HypocreaceaeGing: TrichodermaLoi: Trichoderma reesei2.2. c im hỡnh thỏi Trichoderma l nhng si nm (hypha) cú dng hỡnh ng phõn nhỏnh bờn trong cha cht nguyờn sinh cú th lu ng. V chiu di chỳng cú s sinh trng vụ hn nhng v ng kớnh thỡ thng ch thay i trong phm vi 1-30àm (thụng thng l 5-10 àm).Khun ty ca vi nm khụng mu, cung sinh bo t phõn nhỏnh nhiu, cui nhúm phỏt trin thnh 1 khi trũn mang cỏc bo t trn khụng cú vỏch ngn, khụng mu, liờn kt vi nhau thnh chựm nh u cnh nh cht nhy. Bo t cựa Trichoderma, cú mu xanh c trng, nhng cng cú th l mu trng, vng hay xanh xỏm tựy theo loi, bo t luụn n bo, bo t hỡnh cu, hỡnh elip hoc hỡnh thuụn.u si nm cú hỡnh viờn tr, phn u gi l vựng kộo di (extension zone). Lỳc si nm sinh trng mnh, vựng ny cú th di n 30 àm. Di phn ny thnh t bo dy lờn v khụng sinh trng thờm c na. Mng nguyờn sinh cht thng bỏm sỏt vo thnh t bo. Trờn mng nguyờn sinh cht cú mt s phn cú kt cu gp np hay xon li, ngi ta gi l biờn th mng (plasmalemmasome) hay biờn th (lomasome). Nhõn t bo cha hch nhõn (nucleolus) c bao bc bi mng nhõn cú nhiu l thng. Nhõn tp trung nhiu phn ngn ca si nm v ớt hn trong cỏc t bo phớa sau SVTH: Nguyn Th Hng 3 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNGngọn (1,2 nhân). Nhân nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối ít ( 6 ở T.reesei). Tế bào nấm chứa các bào quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân thực (Eukaryote) khác. Ribosome của T.reesei thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit) : bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein) Phần ngọn có thể tách với phần bên dưới bằng một không bào, lúc đầu nhỏ nhưng về sau kết hợp lại với nhau để lớn dần, tạo áp lực dồn tế bào chất về phía đỉnh ngọn sợi nấm. Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan (autolysis) hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt (lytic enzymee) do các vi sinh vật khác sinh ra. Cũng có những phần sợi nấm già phần lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày hình thành những bào tử áo (chlamydospore). Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua những điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trường hợp này rất giống với các bào tử nội sinh (endospore). Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium, số nhiều- mycelia), sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau tạo hệ thống liên thông thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. SVTH: Nguyễn Thị Hương 4 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNGHình 1 1: Sợi nấm T.reesei quan sát dưới kính hiển vi điện tử ( nguồn bởi G.B.Sharples)3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa3.1. Đặc điểm sinh tháiT.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty. T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 250C-300C, chậm ở 350C-370C. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường. Trong khi ở 370C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy.3.2. Môi trường sốngTrichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. chúng có mặt khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm SVTH: Nguyễn Thị Hương 5 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: ThS.HỒNG MỸ DUNGhoặc cận nhiệt đới là khu rừng ơn đới hay rừng phương Bắc. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của mơi trường sống đặc trưng cho từng lồi.Các lồi Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dứa (6-pentyl-pynone đã bay hơi) thường được tạo ra trong q trình sinh trưởng của Trichoderma 3.3. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinhTrichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh : glioviridin, sespuiterpenoids, trichothecenes, cyelic peptides, isocyanid .Trichoderma có khả năng sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp: anthroquinon , emodin .3.4. Mơi trường nhân sinh khốiTrichoderma phát triển và hình thành bào tử trên mơi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngơ, cám gạo, thóc, bã bia…4. Khái niệm kiểm sốt sinh học của Trichoderma [nguồn TS. Dương Hoa Xơ - TT CNSH Tp. Hồ Chí Minh]Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào nhiều "hoạt động" khác nhau, chúng có thể sử dụng:Kháng sinh được tạo ra chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng trưởng của tác nhân gây bệnhCạnh tranh: Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài ngun (dinh dưỡng, khơng gian sống) với các sinh vật gây bệnh nhưng Trichoderma "xâm chiếm" mơi trường trước các vi sinh vật khác.Ký sinh: tức giết chết các lồi gây bệnh bằng cách xâm nhập vào bên trong lồi nấm gây hại và/hoặc tiết ra những chất (enzymee) để phân hủy chúng.SVTH: Nguyễn Thị Hương 6 [...]... tắt các gen qui định cellulase ở nấm T.reesei Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao I Phương pháp hiện đại: I.1 Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei I.1.1 Khuếch đại biểu hiện cbh1 bằng cách tăng số bản sao gen cbh1: Plasmid pALK496 (Hình 21) đã được xây dựng và chuyển vào nấm T reesei ALKO2221 để tăng số lượng bản sao của gen cbh1... DUNG Phân loại: Ban đầu enzyme cellulase được phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủy cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so với endoglucanase [5] Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3 nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [8] Cellulase Cơ chế Cellulose. .. hoặc sản phâm oxy hóa cellulose cũng làm tăng khả năng hình thành cellulase từ T.reesei Glucose là sản phẩm cuối của quá trình thủy phân cellulase Glulcose gây hiện tượng ức chế endoglucanase ở T.reesei Tính chất xúc tác của cellulase nhờ vào khả năng hoạt động phối hợp của toàn bộ hệ thống enzyme cellulose Nó phụ thuộc vào tỉ lệ các enzyme riêng biệt và mức độ bão hòa của cơ chất và loại cơ chất Hoạt... cellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể Một số khác lại có xu hướng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6] Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng cho enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu... loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose Đó là các loại nấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide Trong nhóm nấm này, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau Loài nấm có khả năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T viride (reesei) SVTH:... lập Cellulosome thủy phân hiệu quả cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose Trong khi đó, các enzyme đơn lẻ hoặc kể cả hỗn hợp của chúng không thực hiện đồng thời cả hai chức năng trên Quá trình sản xuất enzyme cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế Trong đa số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp cellulose được xúc tiến nhờ sản phẩm phân hủy của cellulose Về phương diện này,... Trong lĩnh vực khác Trichoderma được bổ sung vào thức ăn gia cầm nhằm tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose ở vật nuôi Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển SVTH: Nguyễn Thị Hương 9 ĐỒ ÁN... năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endo -cellulase phân giải chúng Cellobiase (E.C.3.2.1.21) cò được gọi là β-glucosidase, tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy các sợi cellulose II.3 Cơ chế hoạt động: Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước: Cellulase liên kết với cellulose thông... của enzyme riêng biệt từ T.reesei là cao nhất đối với cellulose vô định hình Trong khi đó, hệ enzymee hai cấu tử CBH I/EG III và CBH I/CBH II có khả năng phối hợp tốt hơn đối với cellulose tinh thể Hình 1 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose Hai cellobiohydrolases (CBH) tấn công vào vùng cellulose tinh thể ở chuỗi kết thúc và endoglucanases (EG) ở giữa khu của cellulose Các vòng tròn đầy, ký hiệu... ThS.HOÀNG MỸ DUNG Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau, có khả năng phối hợp để phân hủy tinh thể cellulose T reesei sản sinh 5 enzyme endoglucanase, hai exoglucanase và một cellobiase (β-glucosidase) [8, 11] Enzyme EC 3.2.1 Kí hiệu CD thuộc họ I 4 EG I 7/C II 4 EG II 5/A5 III 4 EG III 12/H IV 4 EG IV 61 V 4 EG V 45/K I 91 CBH I 6/B II 91 CBH II 7/C Endo -cellulase Exo -cellulase Cellobiase . cao. Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết. các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ .Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose