I.1.1. Khuếch đại biểu hiện cbh1 bằng cách tăng số bản sao gen cbh1:
Plasmid pALK496 (Hình 21) đã được xây dựng và chuyển vào nấm T. reesei
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hinh 2 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly và Hynes, 1985 ].
a. Khảo sát sự tồn tại của đoạn ADN cần chèn vào các chủng biến đổi:
Kết quả Southern Blotting cho thấy vạch có kích thước 4,5 kb, 3 kb và 2.3 kb tương ứng casset biểu hiện cbh1, amdS và đoạn egl1 tìm thấy ở những chủng ALKO3760, ALKO3761 và ALKO3862 . Vạch 4.5 kb của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 đậm hơn so với vạch 4.5 kb của chủng ALKO3761, chứng tỏ số lượng bản sao casset biểu hiện cbh1 của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 nhiều hơn. Vạch 2.0 kb
(pALK496 phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Xba1) của chủng ALKO3862 và chủng ALKO3760 chứng tỏ chúng chứa 2 bản sao liên tiếp của đoạn ADN tách ra từ pALK496. Vạch 6 kb, 3.3 kb, 2.1 kb, 1.9 kb của chủng ALKO3760 chứng tỏ chủng chứa một phần casset biểu hiện cbh1. Như vậy, ALKO3862 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1 và 2 đoạn sao chép này nằm liên tiếp nhau. ALKO3760 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1, trong đó, đoạn sao chép thứ 2 chưa hoàn chỉnh là đoạn ADN chứa trong plasmid pALK496).
Hình 2 2: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi.
Giếng 1 và 2: marker
Giếng 3: ALKO2221, giếng 4: ALKO3760, giếng 5: ALKO3761, giếng 6: ALKO3862.
b. Khảo sát khả năng tổng hợp cellulase ở các chủng:
Các chủng biến đổi được khảo sát khả năng tổng hợp cellulase bằng phương pháp filter paper-hydrolyzing activity (FPU).
So với chủng chủ ALKO2221, lượng CBHI tăng 1.5 lần ở chủng ALKO3760, 1.4 lần ở chủng ALKO3862 và 1.3 lần ở chủng ALKO3761 (bảng 2 1).
Ngoài ra, những thay đổi trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiểu. Số lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALKO3760 và chủng ALKO3862, nhưng ở chủng ALKO3761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALKO2221. Đáng ngạc nhiên, số lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALKO3760 và chủng ALKO3862 so với chủng chủ ALKO2221, mặc dù các gen egl1 được giữ nguyên vẹn trong bộ gen. Mức độ tiết ra các protein tăng lên so với chủng chủ.
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG Chủng Số bản sao casset biểu hiện cbh1 CBHI (mg/ml) CBHII (mg/ ml) EGI (mg/ml) ALK02221 0 2.2±0.1 0.18±0.01 0.32±0.01 ALK03760 2 3.4±0.2 0.13±0 0.22±0 ALK03862 2 3.1±0.1 0.13±0.01 0.17±0.01 ALK03761 1 3.0±0.2 0.22±0.04 0.00
Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ALK02221 và bởi chủng đã biến đổi ALK03760, ALK03862, ALK03761.
I.1.2. Khuếch đại biểu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbh1:
Casset của pALK546 (hình 23) chứa promoter mạnh cbh1 biến nạp vào chủng ALKO2221 nhằm điều khiển biểu hiện cbh2 bằng promoter cbh1. Chủng biến đổi được phân tích bằng phương pháp Southern Blot nhằm khẳng định sự tồn tại của đoạn
Hinh 2 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII .
Hình 2 4: Kết quả Southern Blot của các chủng biến đổi.
ADN toàn phần được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn XhoI. Sản phẩm của quá trình này được lai với đoạn ADN của pALK 546 được phân cắt bởi EcoRI và BamHI.
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Giếng 2: ALKO2221, giếng 3:ALKO3798, giếng 4: ALKO3799, giếng 5: ALKO3873
Locus của cbh1 và cbh2 có kích thước 9.1 kb và 9.8 kb nằm trên cùng một vị trí kích thước được tìm thấy ở mọi chủng. Vạch có kích thước 4.9 kb tương ứng đoạn gen ble liên kết với promoter cbh1( ble-cbh1 promoter), vạch có kích thước 3.4 kb tương ứng đoạn cbh2 và đầu 3’ của gen egl2, vạch có kích thước 2.3 kb là đoạn 5’ của gen egl2 liên kết với ble. Kết quả cho thấy chủng ALKO3898 và ALKO3899 chứa 1 bản sao có nguồn gốc từ plasmide pALK546 tuy nhiên vị trí chèn của bản sao này chưa được xác định. Một số nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng ALKO3873 chứa 1 bản sao chèn vào vị trí egl2.
Hình 2 5: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi.
A. Làn 1: marker, kDa, làn 2: ALK02221, làn 3: ALK03873, làn 4: ALK03798, làn 5: ALK03799.
B. Làn 1: ALK02221, làn 2: ALK03873, làn 3: ALK03798, làn 4: ALK03799.
Kết quả SDS-PAGE cho thấy ở 3 chủng biến đổi, lượng CBHI/II được tổng hợp nhiều hơn so với chủng đối chứng dựa vào độ đậm của các vạch. Khảo sát lượng CBHII tổng hợp bằng Western Blot, độ đậm của các vạch phản ánh lượng CBHII cao được tìm thấy ở cả 3 chủng biến đổi.
Lượng CBHII tăng từ 3- 4 lần khi ta tăng thêm số lượng bản sao gen cbh2 dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbh1. Chủng ALK03798 (chứa EGII ) sản xuất lượng lớn CBHII (gấp 4 lần so với chủng chủ ALKO2221). ALK03873 (không chứa EGII) và ALK03799 (chứa EGII) sản xuất lượng CBHII lớn gấp 3 lần so với chủng chủ. Chủng ALKO3798 và ALKO3799 sản xuất lượng CBHI khoảng 20% và ALKO3873 khoảng 10% so với chủng chủ. Lượng endoglucanase giảm 20% ở chủng ALKO3798 và
ALKO3799. Như vậy thiếu gen egl2 trong chủng ALKO3873 là nguyên nhân làm giảm lượng endoglucanase.
Chủng CBHI (mg/ml) CBHII(mg/ml) EGI(mg/ml)
ALK02221 0.18±0.01 0.18±0.01 0.32±0.01
ALK03798 0.70±0.07 0.70±0.07 0.31±0.05
ALK03799 0.50±0.05 0.50±0.05 0.28±0.01
ALK03873 0.53±0.17 0.53±0.17 0.39±0.10
Bảng 2 2: Sản xuất cellulase bởi chủng ALKO2221 và chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873.