bằng cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài :
Nhân bản gen cellulase từ Melanocarpus albomyces và biểu hiện chúng ở T.reesei do nhiều nghiên cứu tìm thấy ở Melanocarpus albomyces có 3 gen hiệu quả sản xuất cellulase đó là :Cel7A, Cel45A, Cel7B. Nếu những gen này hoạt động dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbh1 ở T.reesei biến đổi gen có thể sẽ cho sản lượng endoglucanase cao ở chủng biến đổi
M.albomyces (ALKO237, CBS685.95) sử dụng như là chủng cho gen cellulase. Chủng E.coli XL1-Blue MRA sử dụng như chủng chủ tạo thư viện gen cho M.albomyces.
T.reesei ALKO3620 (gen egl2 xóa bỏ) là chủng để biến đổi. T.reesei ALKO4072 là chủng không chứa gen cbh1, egl2 dùng như chủng đối chứng.
ADN nhiễm sắc thể của M.albomyces thì được phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Sau3A. Đoạn ADN 5- 15 kb liên kết Lambda DASHRII và được biến nạp vào trong tế bào E.coli XL-Blue MRA.
Các gen cel45A, cel7A, cel7B được khuếch đại bằng PCR. Các primer sử dụng để khuếch đại gen.
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG cel45A #429 #28-rev Cel7A #507 #509-rev Cel7B #636 #534-rev
Bảng 2 4: Các primer để khuếch đại gen egl 20-50 kDa và cbh 50kDa của M.albomyces bằng phương pháp PCR.
I.3.1. Plasmids
Plasmid pALK1231 và pALK1235 được xây dựng cho biểu hiện của gen cel45A của M.albolyces. pALK1231 và pALK1235 chứa vùng casset biểu hiện : đoạn cel45A 0.9 kb khởi đầu với 1 ATG dưới sự kiểm soát của promoter mạnh cbh1 của T.reesei 2.2 kb và đoạn AvaII 0.7 kb là phần kết thúc của cbh1. pALK1231 chứa thêm 1 đoạn BamHI- EcoRI 1.7 kb của cbh1 và đoạn SpeI-XbaI 3.1 kb của gen amdS. pALK1235 gồm 1 đoạn ScaI-StuI egl1 đầu 5’ dài 1.8 kb và ScaI-XhoI egl1đầu 3’ kích thước 1.6 kb và 1 đoạn NotI-PvuII 2.2 kb. pALK1238 và pALK1240 được xây dựng cho biểu hiện của gen
cel45A của M.albomyces. pALK1231 và pALK1235 biểu hiện của gen cel7A bắt đầu bằng ATG. pALK1242 xây dựng cho biểu hiện của gen cel7B.
Hình 2 9: Các plasmid được sử dụng cho biến đổi T.reesei ALK3620 biểu hiện gen cel45A, cel7A, cel7B ở M.albomyces.
Các chủng sau biến đổi được kiểm tra sự có mặt của gen biến đổi và khảo sát lượng CBHI, EGI được tổng hợp bởi các chủng.
I.3.2. Kết quả
Bản sao thay thế vào chủng biến đổi ALKO3620/1231/14, ALKO3629/1231/16, ALKO3620/1235/49 và ALKO3620/1235/40 sản xuất đạt 2100–2500 NCU/ml ở 70 ◦C (bảng ). Phân tích cassette biểu hiện thì thấy rằng hoặc là locus cbh1 hoặc egl1 không có ảnh hưởng đáng kể tới mức độ hoạt động tạo enzyme. Hoạt động của enzyme endoglucanase của chủng ALKO3620/1235/40 và ALKO3620/1235/49 biến đổi tạo EGI thì thấp hơn so với chủng ALKO3620/1231/14 và ALKO3620/1231/16 biến đổi tạo CBHI.endoglucanase hoạt động tối ưu ở 700C sau 20 phút. Chủng biến đổi sản xuất lượng endoglucanase cao hơn so với chủng chủ M. albomyces ALKO4237 (bảng 2.5)
Khoảng 38% chủng biến đổi ALKO3620/pALK1238 thì không tạo CBHI và khoảng 23% chủng biến đổi ALKO3620/ pALK1240 thì không tạo EGI. Gen cbh1 của T.reesei thì được thay thế bởi 1 bản sao của đoạn plasmid pALK1238 biểu hiện trong
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
ALKO3620/1238/42 và gen egl1 được thay thế bởi 1 bản sao của pALK1238 biểu hiện trong ALKO3620/1240/32.
Trong môi trường nuôi cấy bề mặt, chủng ALK3620/1238/42 tạo ra 4700 NCU/ml ở 50 ◦C, và 6000 NCU/ml ở 70 ◦C. ALKO3620/1240/32 tạo ra 1700 NCU/ml ở 50 ◦C và 3500 NCU/ml ở 70 ◦C.
Bảng 2 5: Sản xuất cellulase bởi chủng M. albomyces ALKO4237, chủng chủ Trichoderma ALKO3620 (egl2) và chủng T.reesei biến đổi sao chép cel45A, cel7A và
cel7B thay thế gen cbh1 hay egl1.
II. Phương pháp cổ điển:
II.1.Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái T.reesei và việc sản xuất enzyme cellulase.
Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu này là xác định hình thái của nấm ảnh hưởng như thế nào đến khả năng sản xuất cellulase ở Trichoderma reesei nuôi cấy trong môi trường lactose và lactobionic acid kiểu fed-batch trong bồn bioreactor 7 lít. Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ môi trường nuôi cấy đã cho hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất với thể tích enzyme có hoạt tính 69.8U/L.h, và sinh khối nấm men cực đại là 14.7g/l . Những phát hiện này kèm theo đặc điểm hình thái của nấm: tổng sợi nấm là 98% tổng diện tích ước lượng, với chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm3, đường kính 7.9μm, số lượng nhánh 9, và số lượng đỉnh mỗi sợi nấm là 29. Một sự tương quan rõ ràng đã được tìm thấy giữa các sợi nấm, số lượng đỉnh và khả năng sản xuất enzyme cellulase.
Chủng và bào tử T.reesei C30
Môi trường nuôi cấy trung gian
Môi trường sản xuất Đĩa petri
Bioreactor
Xác định nồng độ cellulose
Xác định lượng sinh khối khô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát hình thái
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Chủng T.reesei RUT-C30 được cấy truyền vào môi trường thạch potato dextrose (potato dextrose agar-PDA) vô trùng trong đĩa petri. Đĩa PDA sau đó được ủ ở 300C trong 7 ngày ( đến khi sự hình thành bào tử xảy ra tốt) và sao đó bảo quản ở nhiệt độ 40C và giữ ở -800C để sử dụng lâu hơn. Kích thước bào tử nấm có thể tính bằng phương trình dưới, giả sử các bào tử có hình cầu và cả hai kích thước của chúng giống như hình tròn.
Trong đó: Vs là thể tích bào tử và Ds là đường kính bào tử.
Kích thước sợi nấm được ước lượng khi sợi nấm được xem như là một hình trụ rắn. Kích thước của sợi nấm có thể tính bằng công thức sau:
Trong đó Vh là thể tích sợi nấm, Dh là đường kính sợi nấm và Lh là chiều dài sợi nấm.
T.reesei được nuôi cấy trong 4 loại môi trường khác nhau nhằm kiểm tra hình thái và kích thước bào tử cũng như sợi nấm đồng thời khảo sát khả năng sản xuất cellulase.
Môi trường A: 10 g/l cellulose, 10 g/l nấm men, 10 g/l glucose, 1.4 g/l (NH4)2SO4,
2 g/l KH2PO4, 0.4 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0037 g/l CoCl2.6H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O.
Môi trường B: 10 g/l glucose, 5.1 g/l bã ngô( đã được acid hóa và làm ẩm), 1.4 g/l
(NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.5 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O.
Môi trường C: 7.5 g/l cellulose, 0.3 g/l nấm men, 0.8 g/l peptone, 3 g/l urea , 1.4 g/
l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 0.3 g/l CaCl2.2H2O, 0.3 g/l MgSO4.7H2O, 0.005 g/l FeSO4.7H2O, 0.02 g/l CoCl2.6H2O, 0.0016 g/l MnSO4.H2O, 0.0014 g/l ZnSO4.7H2O.
Môi trường D: 10 g/l glucose, 6.7 g/l đạm nấm men, 4 g/l KH2PO4, 20 g/l
Kết quả cho thấy sinh khối khô trong môi trường A đạt đến nồng độ 14.7 g/l vào cuối giai đoạn và giảm dần sau khi thêm hỗn hợp lactose và acid lactobionic như là 1 tác nhân gây ức chế. Sinh khối khô đạt được trong môi trường B, C, D tương ứng gấp 1.6, 3.3, 2.0 lần so với môi trường A (bảng 2.5). Các sinh khối tích lũy qua thời gian, giả thiết rằng có mối quan hệ mạnh mẽ giữa tổng hợp cellulase và nồng độ của sinh khối tổng.
Thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hình thái của T.reesei
Trichoderma reesei nuôi ở các môi trường khác nhau sẽ biểu hiện các hình dạng sợi nấm khác nhau và được quan sát bằng kính hiển vi điện tử như hình 2 10.Hình 2 10 minh họa thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của nấm. Các sợi nấm nảy chồi cực đại tại 120h sau đó giảm dần. Nếu nuôi cấy trong môi trường B thì các sợi nấm nảy chồi giảm 6 lần, trong môi trường C giảm 4 lần và môi trường D giảm 7 lần so với môi trường A (hình 2 10 ). Hình 2 10 cũng cho thấy hoạt động của enzyme cellulase cao điểm tại 120h. Lượng bào tử được quan sát nhiều hơn 50% trong các môi trường B, C, D (hình 2 10B). Trong môi trường A, các sợi nấm phân nhánh chủ yếu trong 10h đầu tiên của sự lên men, trong khi đó các nhánh được hình thành khoảng 24h sau khi bắt đầu của giai đoạn lên men ( hình 2 10C).
Hình 2 10: sự phát triển hình thái của các sợi nấm trên các môi trường : môi trường (A), môi trường B ( B), môi trường C (C), môi trường D (D)
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình thái của sợi nấm có thể ảnh hưởng đến năng suất tạo enzyme trong môi trường A (hình 2 11).
Hình ảnh từ kính điện tử quét (hình 2 11A và 2 11B) cho thấy các sợi nấm phân nhánh nhiều, dài và linh động. các sợi nấm dài và phân nhánh làm tăng bề mặt tiếp xúc của nấm, có thể làm tăng sự tương tác với cơ chất , và do đó năng suất sản xuất enzyme cao (De Nicolas- Santiago et al.,2006).Túi bào tử và đầu bào tử đính được hình thành bởi cuống bào tử đính (hình 2 11E). Số lượng đỉnh phát triển từ sợi nấm chính là 1 dấu hiệu của sự tích lũy sinh khối trong môi trường nuôi cấy (hình 2 11C và 2 11 D). Protein được tiết ra từ sợi nấm và chủ yếu ở đỉnh của sợi nấm đang phát triển. Điều đó được giải thích là do các đỉnh có nhiều lỗ hổng làm cho nó dễ dàng cho các enzyme ngoại bào đi qua khỏi vách tế bào (Peberdy, 1994 ; Punt et al.,1994). Vì vậy, tăng số lượng các đỉnh của sợi nấm hoạt động làm tăng năng suất protein (Juge et al.,1998; Pluschkell et al., 1996).
Hình 2 11 cho thấy sự phát triển của đặc điểm sợi nấm phụ thuộc thời gian. Hình 2 11D ta thấy chiều dài tối đa của sợi nấm trong môi trường A là dài nhất ( môi trường A: chiều dài tối đa là 10 mm, môi trường B là 8 mm, môi trường C là 8 mm và môi trường D là 4 mm). Hình 2 11E – H mô tả sự thay đổi đặc điểm hình thái sợi nấm phụ thuộc thời gian trong 4 môi trường thử.
Trong môi trường A, đường kính sợi nấm thay đổi ngay sau đạt giá trị lớn nhất là 7.9 µm trong khi đường kính sợi nấm trong môi trường B là 6.1 µm, C là 6.2 µm, D là 4.3 µm (hình 2 11E).
Hình 2 11F cho thấy sự tăng thể tích sợi nấm trong môi trường A là lớn nhất. Hình 2 11G , trong môi trường A số lượng các nhánh tăng theo thời gian trong khi số lượng nhánh mỗi sợi nấm nhỏ hơn so với môi trường khác tại điểm mà enzyme hoạt động .
Trong môi trường A, số lượng đỉnh của mỗi sợi nấm đạt cực đại 29 đỉnh/ sợi nấm tại thời điểm enzyme hoạt động (120h). trong khi đó , môi trường B chỉ đạt 4 đỉnh/ sợi nấm, môi trường C là 6 đỉnh/ sợi nấm, môi trường D là 3 đỉnh/ sợi nấm (hình 2 11H).
Hình 2 11: đặc điểm hình thái của sợi nấm theo thời gian trên các môi trường khác nhau. Môi trường A ( ), môi trường B ( ), môi trường C ( ), môi trường D ( ).
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
II.2.Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất cellulase.
Mỗi cơ chất và mỗi vi sinh vật nhất định thích hợp ở 1 pH khác nhau và ảnh hưởng tới sản lượng của sản phẩm. Theo báo cáo của Andreotti et al thì T.reesei sinh trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy ở pH =5 và hơi chậm ở pH 4.5 và 4. Tuy nhiên, Chahal et al. cho thấy rằng T.reesei sản xuất cellulase tối ưu ở pH=6.0.
Hình 2 12: ảnh hưởng của pH đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất alpha cellulose. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kí hiệu:
Với cơ chất là alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu tại pH 5.0. Tại pH 5.0 và 6.0 thì lượng FPA đạt tối ưu là 3.2 và 3.0 IU/ml sau 99h (Hình 2 12). Sản lượng cellulase thấp ở pH 3.0 và 7.0. Tuy nhiên, trong các tài liệu công bố trước thì pH 3.0 (2,4,7), pH 4,0 (10), và pH 5,0 (4) cho sản lượng cellulase cao của nấm T. reesei. Trong một thử nghiệm khác , khi pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4,0 IU / ml trong vòng 91 h.
Hình 2 13: ảnh hưởng của pH khác nhau đến sản lượng filter paper activity (FPA) của T.reesei QMY-1 trên cơ chất CTMP.
Kí hiệu :
Với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose, và phần còn lại là hemicelluloses và lignin) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu ở pH 6.0. Lượng FPA thu được 2.02IU/ml tại pH 6.0 và 1.87IU/ml tại pH 5.0 sau 139h và 117 h (Hình 2 13).
Ta nhận thấy rằng nếu cơ chất cảm ứng chứa nhiều cellulose thì sản lượng FPA cao và đạt sản lượng tối ưu ở thời gian ngắn hơn. Với cơ chất là alpha cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì FPA đạt được gấp 1.5 lần so với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ). Và pH tối ưu cũng phụ thuộc cơ chất . Nếu cơ chất alpha cellulose (chứa 99,9%
cellulose) thì pH tối ưu ở 5. Nếu cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose ) thì pH tối ưu ở 6.
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 2 14: Ảnh hưởng của áp suất đến khả năng tạo cellulase
Giai đoạn đầu của quá trình lên men , các enzyme tạo thành đạt tỷ lệ cao hơn đáng kể trong ở áp suất cao ,quá trình lên men đã được gần như hoàn thành sau 48 h, năng suất tăng 12,2-16,7 FPU/1/h (Hình 2 14). Tuy nhiên, sản lượng cuối cùng của cellulases thì giống như cho quá trình lên men ở áp suất thường.
II.4.Ảnh hưởng của sục khí và không sục khí đến khả năng sản xuất cellulase ở T.reesei RUT C30.
Hình 2 15: Ảnh hưởng của quá trình sục khí ( ) và không sục khí ( ) trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men đối với chủng Rut C30 thì tốt nhất lên men trong điều kiện không sục khí.
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Bảng 2 6: So sánh sản lượng tế bào thu được trong nuôi cấy liên tục của nấm T.reesei Nhận xét: chủng Trichoderma sp. đạt tối ưu trong môi trường cơ chất là glucose. Chủng Rut C30 là chủng thích hợp được với nhiều cơ chất khác nhau (glucose, lactose, mùn cưa...)và cho năng suất tương đối cao. Do đó, chủng Rut C30 đã được sử dụng khá phổ biến.
PHẦN 3: KIẾN NGHỊ
Hai phương pháp cổ điển và hiện đại là ở 2 bài báo cáo khác nhau. Theo tôi nghĩ, nếu có điều kiện nên khảo sát chung để tạo được chủng có khả năng sản xuất cellulase cao nhất. Bằng cách đột biến tạo chủng tốt nhất sau đó nuôi trong điều kiện tối ưu nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
2. Nguyễ Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương. Công nghệ lên men. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP.HCM, 2004.
3. Nguyễn Đức Lượng,Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường. Công nghệ gen. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP.HCM, 2007
Tài liệu nước ngoài
4. G. C. Ainsworth and al. The Fungi. New York and London: Academic Press, 1, pp.1963-1973.
5. Ainsworth and Bisby, 1995. Dictionary of the Fungi.
6. David S. HIBBETT and al, 2007. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research, III, pp. 509 – 547.
7. Markus Linder and Tuula T. Teeri , 1997. The roles and function of cellulose- binding domains, Journal of Biotechnology, 57, pp 15-28.
8. Martin Schülein, 2000. Protein engineering of cellulases, Biochimica Et Biophysica Acta, 1543, pp 239 – 252.
9. Edward A Bayer and al, 1998. Cellulose, cellulases and cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, 8, pp. 548 – 557.
10. Ilan Levy and Oded Shoseyov, 2002. Cellulose-binding domains Biotechnological applications. Biotechnology Advances, 20, pp 191–213.
11. M. L. Rabinovich and al, 2002. Microbial Cellulases. Applied Biochemistry and Microbiology, 38, pp. 305–321. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Prabuddha Bansal and al, 2009. Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates. Biotechnology Advances, 27, pp. 833–848.
13. Yong-Hong Wang et al, 2009. Production and distribution of β-glucosidase in a mutant strain Trichoderma viride T 100-14. New Biotechnology, 26, pp. 150-156.ra
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
14. K howww.en.wikipedia.org
15. http://www.khuyennongvn.gov.vn/e-khcn/vai-tro-nam-111oi-khang- trichoderma-trong-kiem-soat-cac-sinh-vat