1. Trang chủ
  2. » Thể loại khác

Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn sau lưu trữ đông lạnh

7 47 0

Đang tải... (xem toàn văn)

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 7
Dung lượng 394,09 KB

Nội dung

Máu dây rốn được xem là nguồn cung cấp tế bào gốc đầy tiềm năng và có thể dự trữ bằng hình thức lưu trữ đông lạnh để sử dụng một cách linh hoạt và chủ động. Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn; tìm hiểu mối liên quan giữa đặc điểm tạo cụm tế bào với một số yếu tố.

Trang 1

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM TẾ BÀO CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC MÁU DÂY RỐN SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH

Vũ Thu Huyền * , Trần Ngọc Quế * , Nguyễn Bá Khanh *

TÓM TẮT

Máu dây rốn được xem là nguồn cung cấp tế bào gốc đầy tiềm năng và có thể dự trữ bằng hình thức lưu trữ đông lạnh để sử dụng một cách linh hoạt và chủ động

Mục tiêu: Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn; Tìm hiểu mối liên quan giữa đặc

điểm tạo cụm tế bào với một số yếu tố

Đối tượng: 307 mẫu tế bào gốc máu dây rốn được thu thập, xử lý và lưu trữ tại Ngân hàng Tế bào gốc của

Viện Huyết học – Truyền máu TW từ năm 2014 đến 2018

Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang, tiến cứu, hồi cứu, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc

trên môi trường nuôi cấy Methocult 4434

Kết quả: Số lượng các cụm trung bình trong 1 đơn vị lưu trữ là 147,9 x10 4 cụm, với đặc điểm hình thái các loại cụm thường gặp là: BFU-E (75,3x10 4 cụm), CFU-GM (60,1x10 4 cụm), CFU-GEMM (8,1x10 4 cụm); cụm ít gặp là CFU-E (1,7x10 4 cụm); thời gian lưu trữ đông lạnh của mẫu tính đến thời điểm nuôi cấy trung bình là 1,08 năm; Số lượng cụm tế bào có mối tương quan thuận với số lượng tế bào CD34+ và tế bào có nhân, trong đó

có mối tương quan chặt chẽ hơn với số lượng tế bào CD34+

Từ khóa: cụm tế bào, tế bào gốc máu dây rốn, nuôi cấy tế bào gốc

ABSTRACT

STUDY SOME CHARACTERISTICS OF COLONY FORMING UNIT

OF UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELL CULTURE AFTER CRYOPRESEVATION

Vu Thu Huyen, Tran Ngoc Que, Nguyen Ba Khanh

* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No 6 - 2019: 430 – 436

Cord blood is considered a potential source of stem cells and can be fully stored by cryopreservation for use in

a flexible manner and initiative

Objective: To describe the characteristics of colonies; to study the relative between characteristics colony of

stem cell with some of factors

Subjects: 307 samples of cord blood stem cells are collected, processed and stored in Stem Cell Bank at the

National Institute of Hematology and Blood Transfusion from 2014 to 2018

Methods: Cross sectional descriptive, prospective, retrospective study MethoCult™ H4434 Classic is a

complete methylcellulose-based medium for the growth of hematopoietic progenitor cells in colony-forming unit (CFU) assays of umbilical cord blood

Results: The average number of colony per unit was 147,9x10 4 colonies, with morphological characteristics common kind of colonies were: BFU-E (75,3x10 4 colonies); CFU-GM (60,1x10 4 colonies); CFU-GEMM (8,1x10 4 colonies); less common colony was CFU-E (1,7x10 4 colonies); cryopreservation time of samples in this study average was 1,08 years The number of colony was positively correlated with CD34+ cell numbers and total nucleated cell numbers, which correlated more closely with CD34+ cell numbers

Keywords: colony-forming unit, cord blood stem cells, stem cell culture

*Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương

Tác giả liên lạc: KS Vũ Thu Huyền ĐT: 0944891118 Email: huyenthuhuyen.91@gmail.com

Trang 2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào gốc tạo máu (HSC: Hematopoietic

Stem Cell) đã được nghiên cứu hơn nửa thế kỷ,

là một trong những lĩnh vực tiến bộ và nổi bật

nhất trong y sinh học hiện đại Chúng tạo ra

những tế bào máu và tế bào có thẩm quyền miễn

dịch, đáp ứng cho sự đổi mới về số lượng và

chức năng của máu

Ghép tế bào gốc tạo máu hiện nay được coi

là phương pháp điều trị có thể đưa lại cơ hội

sống cho những bệnh nhân bị mắc các bệnh lý ác

tính, bệnh di truyền về huyết học và một số bệnh

lý khác ngoài chuyên khoa Huyết học Tế bào

gốc tạo máu có thể lấy được từ nhiều nguồn

như: từ máu dây rốn, từ tủy xương hoặc từ máu

ngoại vi Trong số đó nguồn tế bào gốc tạo máu

từ máu dây rốn được xem là nguồn tế bào gốc

non trẻ, phương pháp thu thập không đau đớn,

dễ dàng thực hiện Và sự ra đời của ngân hàng

lưu trữ tế bào gốc máu dây rốn, là cơ sở cho việc

tạo nguồn tế bào gốc sẵn sàng phục vụ cho

những bệnh nhân có nhu cầu ghép Tại đây, các

mẫu được thu thập, xử lý chiết tách thu tế bào

gốc, lưu trữ đông lạnh và sẵn sàng cho sử dụng

Việc thực hiện đánh giá chất lượng mẫu tế

bào gốc sau lưu trữ là rất quan trọng, giúp đem

lại những thông tin cần thiết để hỗ trợ việc ứng

dụng cũng như cải thiện các quy trình tạo nguồn

tế bào gốc Các phương pháp đánh giá chất

lượng khối tế bào gốc bao gồm về thành phần

của khối tế bào gốc, số lượng và tỷ lệ sống của tế

bào gốc, khả năng thực hiện chức năng… Trong

đó, nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt là kỹ

thuật phổ biến đánh giá chất lượng, đặc biệt là

khả năng thực hiện chức năng của mẫu tế bào

gốc Căn cứ vào số lượng cụm mọc trên môi

trường và đặc điểm của các cụm tế bào về hình

thái, tính chất, ta có thể đưa ra đánh giá về chất

lượng của mẫu tế bào gốc, giúp cho việc chọn

mẫu để ghép cũng như tiên lượng khả năng mọc

mảng ghép trên lâm sàng(2) Một số nghiên cứu

trên thế giới chỉ ra rằng số lượng cụm có liên

quan đến tỷ lệ mọc mảnh ghép trong cấy ghép

bệnh lý huyết học ở trẻ em(1)

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về tế bào gốc cũng như ứng dụng tế bào gốc tạo máu trong điều trị thực hiện thành công tại các bệnh viện như Viện Huyết học - Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Tp Hồ Chí Minh, Bệnh viện Đa khoa TW Huế Tuy nhiên, các nghiên cứu về đánh giá chất lượng, đặc biệt là khả năng thực hiện chức năng của mẫu tế bào gốc tạo máu còn hạn chế

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành

đề tài “Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn sau lưu trữ đông lạnh” với mục tiêu:

Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn

Tìm hiểu mối liên quan giữa đặc điểm tạo cụm tế bào với một số yếu tố

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

307 mẫu TBG máu dây rốn được thu thập,

xử lý và lưu trữ đông lạnh tại Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Huyết học – Truyền máu TW từ tháng 1/2014 – 12/2018

Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu và chọn mẫu

Nghiên cứu cắt ngang mô tả, tiến cứu, hồi cứu Chọn 10% số mẫu đã lưu trong thời gian năm 2014 đến 2018 theo cách cứ 10 mẫu liên tiếp

sẽ lấy mẫu ở vị trí thứ hai để tiến hành nuôi cấy, đánh giá chất lượng;

Chọn và chia mẫu nghiên cứu thành 3 nhóm theo thời gian, tính từ thời điểm lưu trữ đông lạnh đến thời điểm nuôi cấy, cụ thể:

+ Nhóm 1: thời gian lưu < 1 năm;

+ Nhóm 2: Từ 1 năm đến ≤ 2 năm;

+ Nhóm 3: > 2 năm

Các thông số nghiên cứu

Đặc điểm của mẫu: Nguồn gốc, thể tích, mật

độ và thành phần tế bào…)

Đặc điểm của tế bào có nhân (TBCN): Số lượng, tỷ lệ sống/chết của tế bào

Trang 3

Đặc điểm của tế bào CD34: Số lượng, tỷ lệ

CD34+/CD45, tỷ lệ sống/chết

Đặc điểm tạo cụm tế bào: Số cụm, thành

phần cụm

Quy trình kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu

(Hình 1)

Xác định và phân biệt các loại cụm dưới kính

hiển vi quang học đảo ngược (2)

BFU-E (Burst Forming Unit - Erythocyte):

Đơn vị tạo cụm hồng cầu lớn, mỗi cụm có >

200 nguyên hồng cầu, đứng thành một hoặc

nhiều đám, có màu hồng, các tế bào đứng sát

nhau, ranh giới không rõ, vùng rìa của cụm

thường gọn

CFU-E (Colony Forming Unit - Erythocyte): Đơn vị tạo cụm hồng cầu nhỏ, đặc điểm tương

tự cụm BFU-E nhưng kích thước nhỏ hơn, có từ

8 đến 200 nguyên hồng cầu

CFU-GM (Colony Forming Unit - Granulocyte/Macrophage): Đơn vị tạo cụm bạch cầu, mỗi cụm có  40 bạch cầu, màu trắng đục, các tế bào đứng cạnh nhau ranh giới thường rõ, vùng rìa thường không đều

CFU-Mix/CFU-GEMM (Colony Forming Unit - Mixed): một cụm lớn, thường bao hàm cụm BFU-E và CFU-GM

Hình 1 Quy trình nuôi cấy cụm tế bào với methycellulose medium

Các phương tiện, vật liệu nghiên cứu

Máy đếm tế bào FC500, DxH500;

Tủ an toàn sinh học; tủ nuôi cấy tế bào;

Kính hiển vi quang học đảo ngược;

Máy Vortex; micropipet;

Bơm tiêm 3ml, kim 18G; đĩa Petri d=35mm;

đĩa Petri d=100mm; ống nghiệm 5ml có nắp tiệt

trùng; kim Catheter;

Môi trường nuôi cấy MethoCult™ H4434

Classic và nước cất

Sơ đồ nghiên cứu (Hình 2)

KẾT QUẢ

Bảng 1 Một số đặc điểm chung của mẫu nuôi cấy

Thông số Trung bình X ± SD Tối đa thiểu Tối

Tế bào có nhân (107) 59,7 ± 19,9 124,4 17,2

Tế bào CD34+ (105) 239,8 ± 184,6 1830 42

Tỷ lệ tế bào sống sau rã

Thời gian lưu trữ đông

Số lượng tế bào có nhân trung bình của mẫu

dây rốn trong nghiên cứu là 59,7 x 107 tế bào; số

lượng tế bào CD34+ trung bình là 239,8 x 105 tế bào; thể tích lưu trữ trung bình của các mẫu máu day rốn là 22,3 ml; tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông của các mẫu trong nghiên cứu trung bình

là 82,5%; thời gian lưu trữ đông lạnh của mẫu tính đến thời điểm nuôi cấy trung bình là 1,08

năm (Bảng 1)

Bảng 2 Số lượng cụm trung bình trong 1 đĩa nuôi

cấy (d=35mm)

Loại cụm Trung bình (cụm)

Trung bình trong một đĩa nuôi cấy với kích thước d=35mm có 42,7±18 cụm Số lượng mỗi loại cụm CFU-E; BFU-E; CFU-GM; GEMM trung bình trong 1 đĩa nuôi cấy lần lượt là: 0,5 cụm;

22,1 cụm; 17,5 cụm; 2,5 cụm (Bảng 2)

Trung bình trong một đơn vị lưu trữ sau nuôi cấy có 147,9x104 cụm Các cụm thường gặp là: BFU-E (75,3x104 cụm), CFU-GM (60,1x104

cụm) và CFU-GEMM (8,1x104 cụm); cụm gặp ít

Mẫu

XN

Chuẩn

bị mẫu

và hóa chất

Cấy mẫu trên đĩa

Nuôi cấy trong tủ

Đọc và phân tích kết quả nuôi cấy Pha

loãng

Trang 4

nhất là CFU-E (1,7x104 cụm) (Bảng 3)

Hình 2 Sơ đồ nghiên cứu Bảng 3 Số lượng cụm tế bào trung bình trong 1 đơn

vị lưu trữ

(10 4 cụm) X ± SD Tối đa Tối thiểu

Bảng 4 Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ đến số

lượng cụm tế bào

Nhóm

Loại cụm

Nhóm 1

(≤ 1 năm)

(n=189)

Nhóm 2 (1-2 năm) (n=35)

Nhóm 3 (> 2 năm) (n=13)

p

CFU-E 0,56 ± 0,9 0,41 ± 0,6 0,29 ± 0,5 > 0,05

BFU-E 20,4 ± 9,7 23,7 ± 11,5 32,2 ± 12,8 > 0,05

CFU-GM 17,3 ± 8,1 16,7 ± 8 24,89 ± 7,2 > 0,05

GEMM 2,6 ± 2,6 2,5 ± 2 3,02 ± 1,9 > 0,05

Số lượng cụm tế bào trung bình của mỗi loại

cụm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

giữa các nhóm trong nghiên cứu (Bảng 4)

Bảng 5 Tương quan giữa các yếu tố trong nghiên

cứu và số lượng các loại cụm

Số lượng tế bào có nhân (10 7 )

Số lượng CD34+ (10 5 )

Thời gian lưu trữ (năm)

BFU-E (104 cụm)

CFU-GM (104 cụm)

GEMM (104 cụm)

Số lượng TBCN có mối tương quan thuận có

ý nghĩa thông kê với số lượng cụm BFU-E,

CFU-GM Số lượng CD34+ có mối tương quan thuận

có ý nghĩa thông kê với số lượng của 3 loại cụm

trong nghiên cứu (Bảng 5)

Số lượng cụm mọc có liên quan chặt chẽ với

số lượng tế bào có nhân trong mẫu nghiên r=0,68 (p <0,05) và liên quan rất chặt chẽ với số lượng tế bào

CD34+ trong mẫu nghiên r=0,81 (p <0,05) (Hình 3)

Tế bào gốc máu dây rốn lưu trữ

307 mẫu đánh giá

Các thông số tế bào có nhân, tế

bào CD34+

Rã đông mẫu đông lạnh

Nuôi cấy môi trường Methocult,

t0=370C, 5% CO2, trong 14 ngày

Phân tích và ghi kết quả vào

phiếu thu thập thông tin

Tổng hợp kết quả, xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS

Phân tích kết quả ghi vào phiếu đọc kết quả cấy cụm

Trang 5

Hình 3 Tương quan giữa số lượng cụm tế bào với số lượng tế bào có nhân và số lượng tế bào CD34+ trong 1

đơn vị lưu trữ

BÀN LUẬN

Về đặc điểm hình thái cụm tế bào, sau 14

ngày nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, các

cụm tế bào gốc đạt được hình thái điển hình Sử

dụng hệ thống kính hiển vi đảo ngược để quan

sát kết quả, ta dễ dàng nhận ra sự khác biệt về màu sắc giữa các loại cụm khác nhau Kết quả của nghiên cứu về hình thái các loại cụm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn trên thế giới và nhận thấy sự tương đồng với(6) (Hình 4)

Hình 4 Một số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày nuôi cấy a) cụm hồng cầu; b) cụm bạch cầu; c) cụm hỗn hợp

Trang 6

Về số lượng các loại cụm trong đĩa nuôi cấy,

chiếm ưu thế là cụm BFU-E và ít nhất là CFU-E

(Bảng 2, 3) Kết quả của nghiên cứu này tương tự

như các nghiên cứu của tác giả Nguyễn Bá

Khanh (2015) và nghiên cứu trên thế giới về nuôi

cấy cụm đối với máu dây rốn(4) Đây cũng là

điểm đặc trưng cho nuôi cấy cụm từ tế bào gốc

tạo máu từ nguồn máu dây rốn Với ưu điểm về

mức độ non trẻ của các tế bào gốc máu dây rốn

đã mang đến tiềm năng tăng trưởng mạnh mẽ

cho các tế bào vượt trội hơn so với các nguồn tế

bào gốc trưởng thành từ máu ngoại vi hay dịch

tủy xương khi nuôi cấy trong cùng loại môi

trường Bên cạnh đó, sự có mặt của cụm hỗn

hợp (Bảng 2, 3) đã khẳng định tiềm năng tăng

sinh của nguồn tế bào gốc này Trong nghiên

cứu này, số lượng cụm trung bình/1 đĩa nuôi cấy

là 42,7 cụm/đĩa Kết quả này hoàn toàn phù hợp

với khuyến cáo của Bert Wognum với 30-80

cụm/đĩa được xem là kết quả tối ưu đối với các

điều kiện nuôi cấy tế bào(7) Theo một số báo cáo

trên thế giới về mối liên quan giữa số lượng cụm

trung bình và khả năng mọc ghép của bênh

nhân, số lượng cụm trung bình càng nhiều thì

khả năng mọc mảnh ghép càng cao và liều ghép

dựa trên số lượng cụm trung bình được khuyến

cáo là 3,3-3,5x104/kg(4,5) Trong nghiên cứu của

chúng tôi với số lượng cụm trung bình là

147,9x104 (Bảng 3) hoàn toàn có thể đảm bảo

được liều ghép, kể cả cho những bệnh nhân là

người trưởng thành

Thời gian lưu trữ đông lạnh kéo dài

thường dẫn đến lo ngại là một yếu tố nguy cơ

ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu, tuy nhiên

theo kết quả của nghiên cứu này thì thời gian

lưu trữ không ảnh hưởng đến khả năng tạo

cụm của mẫu lưu (Bảng 4) Kết quả của chúng

tôi cũng tương tự như kết quả của Hye Ryun

Lee và cộng sự (2014) khi tiến hành đánh giá

chất lượng các mẫu lưu trữ trong thời gian 5

năm(3) Điều này có ý nghĩa rất quan trọng với

hoạt động của một ngân hàng máu dây rốn bởi

nó sẽ ảnh hưởng đến thời gian cần bổ sung

thêm những mẫu mới Kết quả trong nghiên

cứu đã chỉ ra với những mẫu có thời gian lưu lên đến 3 năm thì vẫn cho kết quả tương

đương với những mẫu lưu dưới 1 năm (Bảng 4) Do đó, quy trình lưu trữ và bảo quản mẫu

tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đến thời điểm hiện tại hoàn toàn đảm bảo được chất lượng mẫu Khi so sánh mối tương quan giữa số lượng cụm tế bào với số lượng tế bào có nhân và CD34+, chúng tôi nhận thấy rằng số lượng CD34+ có mối tương quan chặt chẽ hơn so với số lượng tế bào có nhân Do trong môi trường nuôi cấy đặc biệt chứa các yêu tố kích thích tăng trưởng tạo cụm tế bào gốc tạo máu, tác động chủ yếu vào các tế bào có CD34+ cho nên số lượng, thành phần cụm phụ thuộc rất nhiều vào số lượng tế bào CD34+ trong mẫu Nhìn chung, số lượng CD34+ và số lượng TBCN có mối tương quan với số lượng cụm tế bào gốc trung bình

trong 1 đơn vị lưu trữ (Hình 1)

KẾT LUẬN

Từ kết quả của nghiên cứu này với 307 mẫu máu dây rốn được lưu trữ đông lạnh từ năm

2014 đến 2018 nhận thấy:

- Về hình thái, các loại cụm đều đạt theo tiêu chuẩn chung của thế giới;

- Số lượng cụm trung bình trong 1 đơn vị lưu trữ là 147,9 x104 cụm; cụm thường gặp là: BFU-E (75,3x104 cụm), CFU-GM (60,1x104 cụm), CFU-GEMM (8,1x104 cụm); cụm ít gặp là CFU-E (1,7x104 cụm)

- Số lượng cụm tế bào có mối tương quan thuận, rất chặt chẽ vớ số lượng tế bào CD34+ và liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào có nhân

- Thời gian trung bình lưu trữ của các mẫu là 1,08 năm, mẫu lưu lâu nhất trong nghiên cứu lên đến 2,8 năm, thời gian lưu trữ đông lạnh không ảnh hưởng đến kết quả tạo cụm của mẫu

KIẾN NGHỊ

Nuôi cấy tạo cụm tế bào là kỹ thuật hiệu quả, phù hợp để đánh giá chất lượng của các mẫu sau thời gian lưu trữ đông lạnh Cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu để đánh giá chất lượng

Trang 7

mẫu với sô lượng mẫu nhiều hơn và thời gian

lưu trữ dài hơn Ngoài ra có thể kết hợp với lâm

sàng để nghiên cứu về tương quan giữa kết quả

đánh giá chất lượng mẫu lưu trữ đông lạnh và

kết quả ứng dụng trên lâm sàng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Allan D, Petraszko T, Elmoazzen H & Smith S (2013) A Review

of Factors Influencing the Banking of Collected Umbilical Cord

Blood Units Stem Cells International, pp.1-7

2 Clarke E (2009) Colony-Forming Cell Assays for Determining

Potency of Cellular Therapy Products, Cellular Therapy:

Principles, Methods, and Regulations AABB, pp.573-580

3 Lee HR, Shin S, Roh EY, et al (2014) Quality of cord blood

cryopreserved for up to 5 years, Korean Society of Hematology

Blood Research, 49(1):54-60

4 Nguyễn Bá Khanh, Trần Ngọc Quế (2015) Bước đầu nghiên

cứu kết quả và một số yếu tố liên quan đến khả năng tạo cụm tế

bào của mẫu máu dây rốn lưu trữ tại Viện Huyết học - Truyền

máu TW Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 19(4):257-261

5 Page KM, et al (2015) Relationships Among Commonly Used Measures of Cord Blood Potency, ALDHbr Cell Content, and Colony Forming Cell Content in Cord Blood Units Prior to Cryopreservation: Towards An Improved Metric for Potency of

Banked Cord Blood American Society of Hematology, 118(21):4054

6 Stem cell Technology (2012) Technical manual version 4: Humman colony-forming cell assays using methocult, pp.1-42

7 Wognum NYB, Lai B and Miller CL (2013) Basic Cell Culture Protocols: Colony Forming Cell Assays for Human

Hematopoietic Progenitor Cells Methods in Molecular Biology,

946:267-283

Ngày nhận bài báo: 23/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019

Ngày đăng: 09/02/2020, 23:27

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w