Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn sau lưu trữ đông lạnh

Máu dây rốn được xem là nguồn cung cấp tế bào gốc đầy tiềm năng và có thể dự trữ bằng hình thức lưu trữ đông lạnh để sử dụng một cách linh hoạt và chủ động. Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn; tìm hiểu mối liên quan giữa đặc điểm tạo cụm tế bào với một số yếu tố.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM TẾ BÀO CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC MÁU DÂY RỐN SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH Vũ Thu Huyền*, Trần Ngọc Quế*, Nguyễn Bá Khanh* TÓM TẮT Máu dây rốn xem nguồn cung cấp tế bào gốc đầy tiềm dự trữ hình thức lưu trữ đơng lạnh để sử dụng cách linh hoạt chủ động Mục tiêu: Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn; Tìm hiểu mối liên quan đặc điểm tạo cụm tế bào với số yếu tố Đối tượng: 307 mẫu tế bào gốc máu dây rốn thu thập, xử lý lưu trữ Ngân hàng Tế bào gốc Viện Huyết học – Truyền máu TW từ năm 2014 đến 2018 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang, tiến cứu, hồi cứu, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc môi trường nuôi cấy Methocult 4434 Kết quả: Số lượng cụm trung bình đơn vị lưu trữ 147,9 x104 cụm, với đặc điểm hình thái loại cụm thường gặp là: BFU-E (75,3x104 cụm), CFU-GM (60,1x104 cụm), CFU-GEMM (8,1x104 cụm); cụm gặp CFU-E (1,7x104 cụm); thời gian lưu trữ đông lạnh mẫu tính đến thời điểm ni cấy trung bình 1,08 năm; Số lượng cụm tế bào có mối tương quan thuận với số lượng tế bào CD34+ tế bào có nhân, có mối tương quan chặt chẽ với số lượng tế bào CD34+ Từ khóa: cụm tế bào, tế bào gốc máu dây rốn, nuôi cấy tế bào gốc ABSTRACT STUDY SOME CHARACTERISTICS OF COLONY FORMING UNIT OF UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELL CULTURE AFTER CRYOPRESEVATION Vu Thu Huyen, Tran Ngoc Que, Nguyen Ba Khanh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 430 – 436 Cord blood is considered a potential source of stem cells and can be fully stored by cryopreservation for use in a flexible manner and initiative Objective: To describe the characteristics of colonies; to study the relative between characteristics colony of stem cell with some of factors Subjects: 307 samples of cord blood stem cells are collected, processed and stored in Stem Cell Bank at the National Institute of Hematology and Blood Transfusion from 2014 to 2018 Methods: Cross sectional descriptive, prospective, retrospective study MethoCult™ H4434 Classic is a complete methylcellulose-based medium for the growth of hematopoietic progenitor cells in colony-forming unit (CFU) assays of umbilical cord blood Results: The average number of colony per unit was 147,9x104 colonies, with morphological characteristics common kind of colonies were: BFU-E (75,3x104 colonies); CFU-GM (60,1x104 colonies); CFU-GEMM (8,1x104 colonies); less common colony was CFU-E (1,7x104 colonies); cryopreservation time of samples in this study average was 1,08 years The number of colony was positively correlated with CD34+ cell numbers and total nucleated cell numbers, which correlated more closely with CD34+ cell numbers Keywords: colony-forming unit, cord blood stem cells, stem cell culture *Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương Tác giả liên lạc: KS Vũ Thu Huyền ĐT: 0944891118 430 Email: huyenthuhuyen.91@gmail.com Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell) nghiên cứu nửa kỷ, lĩnh vực tiến bật y sinh học đại Chúng tạo tế bào máu tế bào có thẩm quyền miễn dịch, đáp ứng cho đổi số lượng chức máu Ghép tế bào gốc tạo máu coi phương pháp điều trị đưa lại hội sống cho bệnh nhân bị mắc bệnh lý ác tính, bệnh di truyền huyết học số bệnh lý khác chuyên khoa Huyết học Tế bào gốc tạo máu lấy từ nhiều nguồn như: từ máu dây rốn, từ tủy xương từ máu ngoại vi Trong số nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn xem nguồn tế bào gốc non trẻ, phương pháp thu thập không đau đớn, dễ dàng thực Và đời ngân hàng lưu trữ tế bào gốc máu dây rốn, sở cho việc tạo nguồn tế bào gốc sẵn sàng phục vụ cho bệnh nhân có nhu cầu ghép Tại đây, mẫu thu thập, xử lý chiết tách thu tế bào gốc, lưu trữ đông lạnh sẵn sàng cho sử dụng Việc thực đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc sau lưu trữ quan trọng, giúp đem lại thông tin cần thiết để hỗ trợ việc ứng dụng cải thiện quy trình tạo nguồn tế bào gốc Các phương pháp đánh giá chất lượng khối tế bào gốc bao gồm thành phần khối tế bào gốc, số lượng tỷ lệ sống tế bào gốc, khả thực chức năng… Trong đó, ni cấy mơi trường chuyên biệt kỹ thuật phổ biến đánh giá chất lượng, đặc biệt khả thực chức mẫu tế bào gốc Căn vào số lượng cụm mọc môi trường đặc điểm cụm tế bào hình thái, tính chất, ta đưa đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc, giúp cho việc chọn mẫu để ghép tiên lượng khả mọc mảng ghép lâm sàng(2) Một số nghiên cứu giới số lượng cụm có liên quan đến tỷ lệ mọc mảnh ghép cấy ghép bệnh lý huyết học trẻ em(1) Nghiên cứu Y học Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu tế bào gốc ứng dụng tế bào gốc tạo máu điều trị thực thành công bệnh viện Viện Huyết học - Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Tp Hồ Chí Minh, Bệnh viện Đa khoa TW Huế Tuy nhiên, nghiên cứu đánh giá chất lượng, đặc biệt khả thực chức mẫu tế bào gốc tạo máu hạn chế Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn sau lưu trữ đông lạnh” với mục tiêu: Mô tả đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn Tìm hiểu mối liên quan đặc điểm tạo cụm tế bào với số yếu tố ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu 307 mẫu TBG máu dây rốn thu thập, xử lý lưu trữ đông lạnh Ngân hàng Tế bào gốc Viện Huyết học – Truyền máu TW từ tháng 1/2014 – 12/2018 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu chọn mẫu Nghiên cứu cắt ngang mô tả, tiến cứu, hồi cứu Chọn 10% số mẫu lưu thời gian năm 2014 đến 2018 theo cách 10 mẫu liên tiếp lấy mẫu vị trí thứ hai để tiến hành ni cấy, đánh giá chất lượng; Chọn chia mẫu nghiên cứu thành nhóm theo thời gian, tính từ thời điểm lưu trữ đông lạnh đến thời điểm nuôi cấy, cụ thể: + Nhóm 1: thời gian lưu < năm; + Nhóm 2: Từ năm đến ≤ năm; + Nhóm 3: > năm Các thông số nghiên cứu Đặc điểm mẫu: Nguồn gốc, thể tích, mật độ thành phần tế bào…) Đặc điểm tế bào có nhân (TBCN): Số lượng, tỷ lệ sống/chết tế bào Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học 431 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Đặc điểm tế bào CD34: Số lượng, tỷ lệ CD34+/CD45, tỷ lệ sống/chết Đặc điểm tạo cụm tế bào: Số cụm, thành phần cụm Quy trình kỹ thuật áp dụng nghiên cứu (Hình 1) Xác định phân biệt loại cụm kính hiển vi quang học đảo ngược(2) BFU-E (Burst Forming Unit - Erythocyte): Đơn vị tạo cụm hồng cầu lớn, cụm có > 200 nguyên hồng cầu, đứng thành nhiều đám, có màu hồng, tế bào đứng sát nhau, ranh giới khơng rõ, vùng rìa cụm thường gọn CFU-E (Colony Forming Unit - Erythocyte): Đơn vị tạo cụm hồng cầu nhỏ, đặc điểm tương tự cụm BFU-E kích thước nhỏ hơn, có từ đến 200 nguyên hồng cầu CFU-GM (Colony Forming Unit Granulocyte/Macrophage): Đơn vị tạo cụm bạch cầu, cụm có  40 bạch cầu, màu trắng đục, tế bào đứng cạnh ranh giới thường rõ, vùng rìa thường khơng CFU-Mix/CFU-GEMM (Colony Forming Unit - Mixed): cụm lớn, thường bao hàm cụm BFU-E CFU-GM Cấy mẫu đĩa Nuôi cấy tủ Đọc phân tích kết ni cấy Chuẩn Pha bị mẫu lỗng hóa chất Hình Quy trình nuôi cấy cụm tế bào với methycellulose medium lượng tế bào CD34+ trung bình 239,8 x 105 tế Các phương tiện, vật liệu nghiên cứu bào; thể tích lưu trữ trung bình mẫu máu Máy đếm tế bào FC500, DxH500; day rốn 22,3 ml; tỷ lệ sống tế bào sau rã Tủ an toàn sinh học; tủ nuôi cấy tế bào; đông mẫu nghiên cứu trung bình Kính hiển vi quang học đảo ngược; 82,5%; thời gian lưu trữ đông lạnh mẫu Máy Vortex; micropipet; tính đến thời điểm ni cấy trung bình 1,08 Bơm tiêm 3ml, kim 18G; đĩa Petri d=35mm; năm (Bảng 1) đĩa Petri d=100mm; ống nghiệm 5ml có nắp tiệt Bảng Số lượng cụm trung bình đĩa ni trùng; kim Catheter; cấy (d=35mm) Mẫu XN Môi trường nuôi cấy MethoCult™ H4434 Classic nước cất Sơ đồ nghiên cứu (Hình 2) KẾT QUẢ Bảng Một số đặc điểm chung mẫu ni cấy Thơng số Trung bình X ± SD Tế bào có nhân (10 ) Tế bào CD34+ (10 ) Thể tích lưu trữ (ml) Tỷ lệ tế bào sống sau rã đông (%) Thời gian lưu trữ đông lạnh (năm) 59,7 ± 19,9 239,8 ± 184,6 22,3 ± 0,7 Tối Tối đa thiểu 124,4 17,2 1830 42 25 20,6 82,5 ± 6,2 93,29 70 1,08 ± 0.64 2,8 0,04 Số lượng tế bào có nhân trung bình mẫu dây rốn nghiên cứu 59,7 x 107 tế bào; số 432 Loại cụm CFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Tổng Trung bình (cụm) X ± SD 0,5 ± 0,8 22,1 ± 10,8 17,5 ± 8,2 2,5 ± 2,4 42,7 ± 18 Tối đa Tối thiểu 93 44 18 125 14 Trung bình đĩa ni cấy với kích thước d=35mm có 42,7±18 cụm Số lượng loại cụm CFU-E; BFU-E; CFU-GM; GEMM trung bình đĩa ni cấy là: 0,5 cụm; 22,1 cụm; 17,5 cụm; 2,5 cụm (Bảng 2) Trung bình đơn vị lưu trữ sau ni cấy có 147,9x104 cụm Các cụm thường gặp là: BFU-E (75,3x104 cụm), CFU-GM (60,1x104 cụm) CFU-GEMM (8,1x104 cụm); cụm gặp Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học CFU-E (1,7x104 cụm) (Bảng 3) Tế bào gốc máu dây rốn lưu trữ 307 mẫu đánh giá Rã đông mẫu đông lạnh Các thông số tế bào có nhân, tế bào CD34+ Ni cấy mơi trường Methocult, t0=370C, 5% CO2, 14 ngày Phân tích ghi kết vào phiếu thu thập thông tin Phân tích kết ghi vào phiếu đọc kết cấy cụm Tổng hợp kết quả, xử lý số liệu phần mềm SPSS Hình Sơ đồ nghiên cứu Bảng Số lượng cụm tế bào trung bình đơn Bảng Tương quan yếu tố nghiên vị lưu trữ cứu số lượng loại cụm Loại cụm CFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Tổng Trung bình (10 cụm) X ± SD 1,7 ± 2,7 75,3 ± 53,3 60,1 ± 39,2 8,1 ± 7,1 147,3 ± 94,6 Tối đa Tối thiểu 17,5 547,5 247,4 40,6 757 9,9 4,4 0,5 33 CFU-GM (10 cụm) GEMM (10 cụm) Bảng Ảnh hưởng thời gian lưu trữ đến số lượng cụm tế bào Nhóm Nhóm Nhóm (≤ năm) (1-2 năm) Loại cụm (n=189) (n=35) BFU-E (10 cụm) Nhóm (> năm) (n=13) p 0,29 ± 0,5 > 0,05 CFU-E 0,56 ± 0,9 0,41 ± 0,6 BFU-E 20,4 ± 9,7 23,7 ± 11,5 32,2 ± 12,8 > 0,05 CFU-GM 17,3 ± 8,1 16,7 ± 24,89 ± 7,2 > 0,05 GEMM 2,6 ± 2,6 2,5 ± 3,02 ± 1,9 > 0,05 Số lượng cụm tế bào trung bình loại cụm khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm nghiên cứu (Bảng 4) r p r p r p Số lượng tế Thời gian Số lượng bào có nhân lưu trữ CD34+ (10 ) (10 ) (năm) 0,14 0,56 0,13